利用pcr技术检测山羊tmem95基因微小拷贝数变异的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及微小拷贝数变异(CNV)的检测，特 别涉及一种快速、准确检测山羊跨膜蛋白95(TMEM95)基因58bp微小拷贝数变异(CNV)的方 法。
【背景技术】
[0002] 拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是指由基因组发生重排而导致的与基 因组参考序列相比，基因组中出现DNA片段拷贝数的增加、减少、倒位或易位。从狭义的角度 来看，拷贝数变化的DNA片段长度一般大于lkb，但从广义的角度来看，拷贝数变化的DNA片 段长度一般大于50bp，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。拷贝数变异(CNV)是基因组结 构变异（Structural variation，SV)的重要组成部分，具有分布范围广、可遗传、相对稳定 和高度异质性等特点。在基因组中拷贝数变异（CNV)位点的突变率远高于SNP(Single nucleotide polymorphism)，其变异引起的基因剂量改变可以导致表型改变。基于以上特 点，拷贝数变异(CNV)可以作为一种新的可以预测生产性状的基因组DNA多态性标志。
[0003] 近几年，拷贝数变异(CNV)全基因组关联分析开始出现，使从基因组结构变异的角 度解析复杂性状的分子机制和遗传基础成为可能。在生物医学和动物生产实践中，拷贝数 变异的检测及其应用具有重要意义。例如:研究某些重要功能基因拷贝数变异多态性，可阐 明机体对疾病、毒物和应激的易感性，为临床医学、遗传病学、预防医学的发展开拓新的研 究领域（Balaratnasingam et al.，2015;Riggs et al.，2014;Lee et al. ,2012);研究动 物基因组水平的拷贝数变异多态性，并将其与生长性状、泌乳性状、繁殖性状等生产性状进 行关联分析，将有利于发现影响生产性状的重要变异，为以标记辅助选择(MAS)技术为基础 的分子育种提供基础资料。
[0004] 2004年，美国冷泉港实验室Sebat等利用代表性寡核苷酸微阵列R0MA (Representational oligonucleotide microarray analysis)技术，分析了20个正常个体 的基因组DNA片段的拷贝数情况，结果在76个位点上发现了 221个大于100kb的拷贝数变异 (CNV) (Sebat et al. 2004)。瑞士洛桑大学研究小组Iafrate等使用基于细菌人工染色体 (Bacterial artificial chromosome，BAC)探针的比较基因组杂交微阵列，分析了55例个 体的大片段拷贝数变异(CNV)情况，鉴定了255个重复和缺失（Iafrate et al.2004)。这两 项拷贝数变异(CNV)领域的开创性研究拓展了人们对人类遗传变异的认识。
[0005] 随后，大量拷贝数变异（CNV)图谱以及CNVRs(Copy number variation regions) 被发现。由于CNVRs包含成百上千的基因，疾病位点，数量性状遗传位点等重要区域，比SNP 有更多的核苷酸含量，覆盖的区域更大。因此，在对生物性状的影响上，拷贝数变异(CNV)作 为一种重要的新的遗传变异形式，可能具有比SNP更重要的作用。《Nature Genetics》， 《Genome Research》等杂志从不同的方面对拷贝数变异(CNV)的研究进行了报告，研究发现 在人类基因组上，有至少12%的区域会发生DNA大片段的增多或者丢失，这充分的说明了拷 贝数变异(CNV)在基因组中的重要作用。拷贝数变异(CNV)作为一种和SNP互补的重要的基 因组遗传变异形式，联合使用SNP和拷贝数变异(CNV)这两种遗传标记在标记辅助育种中有 着广阔的应用前景。
[0006] 大量研究表明，拷贝数变异(CNV)不仅与多种疾病及发育异常有关，还会影响许多 重要经济性状。因此，对全基因组的拷贝数变异(CNV)研究至关重要。目前，研究全基因组范 围内拷贝数变异(CNV)的技术主要有比较基因组杂交芯片(CGH)、高密度SNP、分型芯片及基 于近年来正在兴起的新一代测序技术的全基因组重测序。对于已经检测出的拷贝数变异 (CNV)，根据序列特点可以采用基于PCR和杂交的技术方法对其基因型进行判定。
[0007] 目前，具体检测已知拷贝数变异(CNV)的方法有以下五种。（1) Southern杂交和荧 光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)。这是两种基于杂交技术的经 典实验方法。Southern杂交操作比较烦琐、费时。FISH具有安全、快速、灵敏度高等优点，但 成本高、技术要求高、通量小、时间长，对于邻位重复的拷贝数变异(CNV)不能精确定量，且 对样本要求较高。（2)焚光定量PCR(Real_time quantitative PCKqPCRhqPCR技术是基于 PCR技术的检测方法。该方法简单、易于操作、敏感性高、重复性好、速度快和污染少，但是不 适合大样本的高通量检测。（3)短片段多重定量技术(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragment，QMPSFQ)。该方法可以同时进行多重PCR，故在检测通量上有 所提高。但是对于拷贝数增加很多的情况下不可能确定拷贝数的绝对值。（4)多重扩增探针 杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridizatior^MAPHhMAPH可同时快速、可靠 的检测多个位点的拷贝数变异，应用范围增大；（5)PCR直接检测法。这种方法使用方便，简 单、快速、准确，在动物科学领域的DNA分子标记应用中具有非常强的可操作性。即直接利用 DNA样本进行PCR扩增，扩增之后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据电泳结果即可区分不 同的拷贝数个体。实验原理如下:对于某段DNA序列2个拷贝和4个拷贝的纯合型个体，由于 PCR扩增产物长度相等，因此，在缓慢复性后，由同样长度单链DNA片段形成的同源双链分子 长度相等，电泳结果只有一条条带。而对于某段DNA序列3个拷贝的个体(在同一个体中，基 因组某段DNA序列同时存在2个拷贝和4个拷贝，因为它们分别来源于父本和木本基因组 DNA)，PCR产物经加热变性后再缓慢复性时，由1个拷贝和2个拷贝的单链DNA复性形成的异 源双链分子具有某些不同于同源双链分子的特征。异源双链可以形成四种不同的二级结 构，导致在琼脂糖凝胶电泳的过程中，电泳迀移率、PCR产物与基质的结合能力均存在差异。 因此，对于3个拷贝的杂合型个体，由于异源双链的存在，导致琼脂糖凝胶电泳产物出现两 条条带、三条条带，甚至四条条带。
[0008] 在这种情况下，PCR扩增后直接检测的方法就成为检测微小拷贝数变异的理想技 术，在发现微小拷贝数变异区域后，设计包含所有拷贝的引物对，以DNA为模板，利用PCR技 术扩增目的序列，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别不同拷贝数的个体。该方 法不仅具有准确快速的特点，又克服了费用昂贵、繁琐操作的缺点。但该方法只适用于小片 段DNA拷贝数的变异检测。
[0009] 分子育种，即分子标记辅助育种(Molecular Mark-Assist Selection，MAS)，该技 术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良， 它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在羊育种中，人 们期望通过对生产性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选 种和提高育种值准确性的目的，加速育种进程。
[0010] 跨膜蛋白95(Transmembrane protein 95，TMEM95)基因编码了一个高度保守的单 次跨膜蛋白。目前，关于TMEM95基因功能的研究鲜见报道。2014年Pausch等研究发现，在弗 莱维赫牛群体中，TMEM95基因的一个无义突变导致雄性生育能力下降，同时，该基因在精子 顶体部位表达，因此推测，该基因可能与雄性繁殖能力密切相关(Pausch et al. ,2014)。 Teves等研究发现，SPAG 17基因不仅与繁殖性状相关，还会影响骨骼的形成（Teves et al. ,2015)。因此，TMEM95基因可能类似于SPAG17基因，在影响繁殖性状的同时影响生长性 状。
[0011] 与此同时，很多育种实践发现，在不断提高牛羊等经济动物产奶产肉等性能的同 时，往往会伴随着繁殖性能的下降。因此可以推测，繁殖性能与产奶、产肉等生产性状具有 一定的负相关的关系。而某些基因也可能在影响繁殖性状的同时影响产奶等生产性状。
[0012] 本实验室前期研究发现，在秦川牛群体中，TMEM95基因存在不同的剪接体，并且该 基因在睾丸和脑中特异性表达，在睾丸中的表达量显著高于在脑中的表达量。由此推测，该 基因在影响繁殖性状的同时还有可能影响激素的生成或者脑的发育（Zhang et al.， 2016)。
[0013] 综上所述，TMEM95基因的变异可能会对经济动物的生产性状产生重要的影响。同 时，牛和羊基因组之间具有较高的相似性，且羊在我国农业经济发展中占有重要位置，因 此，研究中国地方山羊TMEM95基因的遗传变异和微小拷贝数变异(CNV)遗传特征具有重要 的理论和实践意义。
[0014]