目前，对中国地方山羊TMEM95基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能 研究及其遗传变异与生产性状(如体重、体高、体长、胸宽、胸围、体长指数等生长性状，乳中 蛋白含量、总固形物含量、非脂乳固体含量、脂蛋白密度、乳酸度等泌乳性状，以及产单胎或 多胎等繁殖性状)关联的研究更是空白。
【发明内容】
[0015] 本发明目的在于提供一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异 (CNV)的方法及其应用，从而加快良种选育速度。
[0016] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0017] -种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的方法，包括以下步 骤：以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增山羊TMEM95基因部分 片段，再对PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳;根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊TMEM95 基因非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)。
[0018] 所述引物对P1为：
[0019] 上游引物：5' -AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3' ；
[0020]下游引物：5 ' -GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3 '。
[0021 ]所述PCR的扩增反应程序为：
[0022] 1)94.0°C预变性5min，然后进入步骤2);
[0023] 2)94.0°(：变性308,60.0°(：复性308,72.0°(：延伸308，共40个循环 ；
[0024] 3)经过步骤 2)后，72.0°C 延伸 lOmin。
[0025]所述琼脂糖凝胶电泳采用质量分数为2.5%的琼脂糖凝胶。
[0026] 所述山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)为:2个拷贝表现为一条 253bp条带;3个拷贝表现为253bp和311bp两条条带、或者还同时存在由于异源双链结合而 形成的不同结构的第三条或者第四条条带;4个拷贝表现为一条311bp条带。
[0027] 一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的试剂盒，包括用于 PCR扩增山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)位点的引物对P1，所述引物对P1为：
[0028] 上游引物：5 ' -AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3 ' ；
[0029] 下游引物：5 ' -GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3 '。
[0030]上述利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的方法在山羊分子 标记辅助选择育种中的应用。
[0031]本发明通过特定引物经PCR扩增特定的片段，再经过琼脂糖凝胶电泳进行分型，能 够简单、快速、低成本、精确的检测山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异的多态 性。由于TMEM95基因的功能可能涉及众多生产性状，本发明提供的检测方法为TMEM95基因 的微小CNV与生长性状、泌乳性状等性状之间关系的建立奠定了基础，以便用于中国地方山 羊生产性状的标记辅助选择(MAS)，利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。
[0032] 本发明对6个山羊品种的TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)基因型 进行了检测和基因频率分析，对上述拷贝数变异位点与山羊部分生产性状(如体重、体高、 体长、胸宽、胸围、体长指数等生长性状，乳中蛋白含量、总固形物含量、非脂乳固体含量、月旨 蛋白密度、乳酸度等泌乳性状)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高山羊生长性 状、泌乳性状的微小拷贝数变异(CNV)标记。
【附图说明】
[0033]图1为山羊TMEM95基因扩增包含目的片段不同拷贝数的PCR产物电泳结果。
[0034]图2为山羊TMEM95基因 DNA单链包含目的片段1个拷贝的测序图。带下划线部分为 拷贝数变异的序列:NC_022311.1。
[0035]图3为山羊TMEM95基因 DNA单链包含目的片段2个拷贝的测序图。带下划线部分为 拷贝数变异重复的序列:NC_022311.1。
[0036]图4为山羊TMEM95基因58bp重复序列分析图。图中，黑色方框中的序列为上、下游 引物序列，阴影部分序列为拷贝数变异重复的序列。参考序列代表NCBI上公布的山羊 TMEM95基因序列(NC_022311.1);插入序列代表山羊TMEM95基因 DNA单链包含目的片段2个 拷贝的序列。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限 定。
[0038] 本发明利用PCR技术对山羊TMEM95基因非编码区chrl9 :26355471-26355528的 58bp的拷贝数变异进行检测，并将其与生产性状(如体重、体高、体长、胸宽、胸围、体长指数 等生长性状，乳中蛋白含量、总固形物含量、非脂乳固体含量、脂蛋白密度、乳酸度等泌乳性 状)进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的微小拷贝数变异(CNV) 记 D
[0039](一)实验药品与试剂
[0040] 1.生化试剂与生物学试剂:①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司）；②蛋白 酶K(购自华美生物工程公司）；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司）；
[0041 ] 2.普通试剂:普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬 酸钠、葡萄糖、!^840了4、恥(：1、恥0!1、1((：1、恥2册〇4、1(!1屮〇4、1^8饱和酚、氯仿、异戊醇、无水 乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼 酸、琼脂糖等。
[0042] 3.溶液与缓冲液:所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为 15匕以丨11(1.034\1〇￥3)，251^11。试剂配制方法均参考331111^〇〇1^等编著的《分子克隆实验指 南》。具体溶液与缓冲液如下：（1)样品采样所用溶液:抗凝剂ACD:柠檬酸0.48g;柠檬酸钠 1.32g;葡萄糖1.47g。把它们定容于100mL水中，高压灭菌。每6mL新鲜血液中加入1 mL的ACD 液。这一抗凝剂优于EDTA，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液 可以在0 °C保存数天或-70 °C长期保存。（2)血样基因组DNA分离所用溶液：① PBS缓冲液： NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP〇4 1.44g，KH2P〇4 0.24g，加超纯水至 1000mL，调pH至7.4,高压灭 菌，4°C保存。②10%SDS: 10g SDS溶解于90mL的超纯水中，68°C水浴溶解，用HC1调pH至7.2， 定容至 100mL。③0.5mol/L EDTANa2:EDTA Na2 186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH 至8.0,定容至 1000mL，高压灭菌，4°C保存。④lmol/L Tris · Cl:121.14g Tris，溶于800mL 超纯水中，HC1调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4 °C保存。⑤5mol/L NaCl: NaCl 292.2 g溶于 1000mL超纯水中。⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mol/L EDTANa2 4mL，lmol/L Tris.Cl 10mL，5mol/L NaCl 4mL，10%SDS 20mL定容至 100mL。实际浓度为20mmol/L EDTANa2，pH 8.0;100mmol/L Tris· HCl，pH 8.0;200mmol/L NaCl J^SDSoRNase 20yg/ mL。⑦NaAc缓冲液：NaAc · 3H20 20.4g;超纯水40mL;稀HAc调pH至7.4;定容至50mL。⑧TE缓 冲液:Tris · Cl缓冲液(pH 8.0)10mmol/L，EDTA缓冲液(pH 8.0)0.1mmol/L，高压灭菌，4°C 保存。⑨蛋白酶K:用超纯水配成20mg/mL，-2(TC保存。（3)提取组织样DNA所用溶液：除了基 因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂:①2mol/L NaCl: 11.688g溶于水，定容至 100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液（100mL):l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)1 mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至10〇111匕（4)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液:① 0.5 X TBE缓冲液：取10 X TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液:0.25 %溴酚蓝，0.25 %二 甲苯青FF，40.0 % (w/v)蔗糖水溶液。
[0043](二）山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异(CNV)检测的PCR引物的设计
[0044] 在NCBI上检索山羊TMEM95基因的序列，并利用Primer 5.0设计能够扩增包含山羊 TMEM95基因58bp拷贝数变异区域的PCR引物-引物对P1 (图4)，引物对P1序列如下：
[0045] 上游引物：5'-厶厶6(：111^^丁0^6(^0：1'(：1'11^丁6丁6-3'（28匕口）；
[0046] 下游引物：5'-660^66(：1