'(^6丁0：1^61'1'1'-3'（2比口）。
[0047] 以上述引物对P1对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊TMEM95基因（NC_022311.1 序列）非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)区域;扩增后片段的电泳检测如图1所示，第1泳 道为Marker I (由大到小依次为600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。2~10泳道为检 测片段，N为正常基因型（Normal，2个拷贝-DD，253bp)，H为杂合基因型（Heterozygous，3个 拷贝-ID)，1为插入基因型（InSert，4个拷贝-II)。对扩增的片段进行测序鉴定后，发现在 NC_022311.1序列的第1434位开始存在58bp拷贝数变异，测序峰图如图2、图3所示。经过分 析发现，当该位置58bp片段在基因组中为2个拷贝时，测序峰图为图2所示，琼脂糖凝胶电 泳结果如图1中的2、5、6、10泳道所示；当该位置58bp片段在基因组中为4个拷贝时，测序峰 图为图3所示，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中的7、9泳道所示；当该位置58bp片段在基因组中 为3个拷贝时，测序峰图为图2、图3所示，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中的3、4、8泳道所示。由 于3个拷贝时，PCR产物可能形成四种不同的二级结构（由于二级结构的形成可能具有偏向 性，因此检测时多数杂合型的检测结果为三条条带）。所以可以通过琼脂糖凝胶电泳的方法 对该58bp微小拷贝数变异(CNV)进行检测，参见图4。
[0048](三）以引物对P1进行PCR扩增待测山羊的TMEM95基因片段 [0049] 1、山羊样本的采集
[0050]实验所用的动物为6个山羊品种共计2973个样本。采样时均采用随机采样方式采 取育种场个体的血样或耳组织样。采取血样时，利用ACD抗凝，冰盒低温带回实验室后置于-80°C冻存。采个体耳组织样品后，将样品于70%乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80 °C冻存。6个山羊品种的样品信息如下：（1)西农萨能奶山羊(XNSN)血样共383份，采用群体 随机采样方式在陕西省千阳县萨能奶山羊保种场于2001年7月至2001年9月收集；（2)关中 奶山羊(GZMG)耳组织样共235份，采用群体随机采样方式在陕西三原奶山羊场于2010年11 月9日收集；（3)内蒙古绒山羊（MCG)耳组织样共1740份，采用群体随机采样方式在内蒙古 自治区鄂尔多斯市鄂托克旗内蒙古白绒山羊种羊场经三次采样收集，第一次收集399份样 品（2006年4月25日~5月3日期间），第二次收集395份样品（2006年10月20日~11月5日期 间），第三次收集946份样品（2014年9月）；（4)陕北绒山羊（SBCG)耳组织样品共212份，采用 群体随机采样方式在陕西省榆林市衡山县陕北白绒山羊种羊场，采集时间为2006年11月20 日至2006年12月5日；（5)新疆绒山羊(XJCG)耳组织样品共119份，采用群体随机采样方式在 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市周边地区于2007年4月10日收集；（6)海南黑山羊(HNBG)耳组 织样共284份，采用群体随机采样方式在海南省詹州海南黑山羊育种场于2009年2月2日-2010年4月25日收集。
[0051]表1山羊样本的采集
[0052]
[0053] 2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化
[0054] 1)冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500yL至1.5mL Eppendorf离心管，加 入等体积PBS缓冲液，充分混勾，12000r/min离心10min(4°C)，弃去上清液，重复上述步骤至 上清液透明、沉淀呈淡黄色；
[0055] 2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500yL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37 °C水浴lh;
[0056] 3)加 3yL(20mg/mL)蛋白酶K至上述混合液中并混匀，55°C过夜孵育至澄清；尚未澄 清者，可补加 lyL蛋白酶κ混匀后继续消化直至澄清；
[0057] 4)将反应液冷却至室温，加 Tris-饱和酚500yL，温和摇动离心管20min，使其充分 混匀;4°C，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；
[0058] 5)加氯仿500yL，充分混勾20min，4°C，12000r/min离心10min，将上清液转入另一 1.5mL离心管中；
[0059] 6)加氯仿、异戊醇混合液（24:l)500yL，充分混匀20min，4°C，12000r/min离心 lOmin，将上清液转入另一 1.5mL离心管中；
[0060] 7)加 0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直 至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30~60min;
[0061 ] 8) 4°C，12000r/min离心1 Omin，弃去上清液，用70 %冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
[0062] 9)4°C，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；
[0063] 10)干燥后的DNA溶于80~100yL的TE缓冲液，4 °C保存直至DNA完全溶解，0.8 %琼 脂糖凝胶电泳检测其质量，_80°C保存。
[0064] 3、组织样品DNA的提取与分离
[0065] 1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。
[0066] 2)加入600yL组织DNA提取液，10%SDS至终浓度为1 %，蛋白酶K至终浓度为lOOyg/ mL，55.0°C消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织DNA提取液中。
[0067] 3)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心 管，至少持续l〇min以上，12000r/min离心15min。
[0068] 4)取上清液，加入与上清等体积的酚和氯仿(酚:氯仿= 1:1)，盖紧管盖，缓慢地来 回颠倒离心管，至少持续l〇min以上，12000r/min离心15min。
[0069] 5)取上清液，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇（氯仿：异戊醇= 24:1)，盖紧管 盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续l〇min以上，12000r/min离心15min。
[0070] 6)取上清液，加入上清液2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖 紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。
[0071] 7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500yL70 %乙醇，盖紧管盖，缓慢地来 回颠倒离心管，然后12000r/min离心3~5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
[0072] 8)再一次向离心管中加入500yL70 %乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然 后12000r/min离心3~5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
[0073] 9)待干燥后，加入60yL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4°C保存过夜，待检测。
[0074] 4、琼脂糖凝胶电泳检测DNA
[0075] 1)将制琼脂糖凝胶的胶盒洗干净，用纸擦干，将洗干净的制胶用的底板放入胶盒 中，插上梳子。
[0076] 2)称取0.24g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1XTBE 30mL使其悬浮，微波炉中火加 热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5yg/mL的EB。轻微摇动，防止出现 气泡。
[0077] 3)混匀后（约60°C)，立即将琼脂糖溶液倒入槽内。如出现气泡，立即用移液器移 出。
[0078] 4)完全冷却凝固（约25~40min)后，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中。
[0079] 5)向电泳槽中加入1 X TBE缓冲液，使液面高出胶面2~5mm。
[0080] 6)取DNA样品2~4yL，加2yL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后 对应），并将DNAMarker加在一边。
[0081] 7)80V 电压电泳 2h。
[0082] 8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新 提取相应样品的DNA。
[0083] 5、DNA 的纯化
[0084] 1) 500yL的DNA溶液中加入10 % SDS使其终浓度为0.1 %，加入蛋白酶K至终浓度达 至lj 100yg/mL; 55 °C 保温 1 Oh左右。
[0085] 2)与1)溶液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。
[0086] 3)12000r/min离心5min分相，吸上层水相至另一离心管中。
[0087] 4)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。
[0088] 5)倒掉液体，70 %乙醇洗涤后凉干，加入60yL灭菌超纯水溶解，4 °C待检测。
[0089] 6、分光光度法检测DNA
[0090] 用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的0D值。计算DNA含量和OD26Q/OD 280 的比值。如0D26q/0D28q比值小于1.6,说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化;若 比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。其中，DNA