浓度(ng/yL) = 50 X 0D26Q值X稀释倍数。 DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ngAiL，存于-20°C备用，其余的存放于_80°C。
[0091] 7、PCR 扩增
[0092] PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1 次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分 混匀后瞬时离心，再分装到每个〇.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心 后进行PCR扩增;PCR反应体系包括2XTaq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优 化的反应缓冲液，浓度为2 X ) 6.25yL;上游引物0.25yL;下游引物0.25yL(上下游引物浓度 为1 Opmo 1 /yL);基因组DNA(浓度为50ng/yL基因组DNA) 1 · OyL;去离子水4 · 75yL;共12 · 5yL体 积的PCR扩增体系。
[0093] 8.PCR反应的程序
[0094] 94 · 0°C，预变性5min; 94 · 0°C，变性30s; 60 · 0°C复性30s; 72 · 0°C延伸30s，40个循环 之后72.0°C延伸10min，4.0°C保存扩增产物。
[0095] 9.琼脂糖凝胶电泳检测
[0096] 1)琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作浓度为2.5 %琼脂糖凝胶，120V电压电泳25 ~30min，EB染色;2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Bio-Rad凝胶成像系统成像;3) 根据图像判断效果。
[0097] 2)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析不同拷贝数多态性；
[0098]用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断拷贝数变异的多态性：由 于山羊为2倍体，所以山羊基因组的TMEM95基因的非编码区（第1434bp位开始的）58bp微小 拷贝数变异(CNV)琼脂糖凝胶电泳结果为:2个拷贝表现为253bp，一条条带;3个拷贝表现 为253bp和311bp两条条带，或者同时表现三条条带或者四条条带;4个拷贝表现为311bp，一 条条带。
[0099] (四）山羊TMEM95基因拷贝数变异位点的频率统计分析
[0100] 1)基因和基因型频率
[0101] 因该微小拷贝数变异共分为三种基因型，与SNP数据结果相似，因此，可以利用分 析SNP数据结果的方法对该拷贝数变异结果进行数据统计分析。
[0102] 基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Ρπ = Νπ/Ν，其中Ρπ代表某一位点的II基因型频率;Νπ表示群体中具有II基因型的个体数;NS 检测群体的总数量。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。 计算的公式可以写成:Pi=(2Nn+Ni ai+Nia2+Nia3+Nia4+……+Nian)/2N，式中，Pi表示等位基因 I 频率，Νπ表示群体中具有II基因型的个体数量，阶^表示群体中具有Iai基因型个体数量， al - an为等位基因 I的η个互不相同的复等位基因。
[0103] 在不同山羊品种ΤΜΕΜ95基因的58bp拷贝数变异(CNV)位点中的等位基因型频率及 等位基因频率如表2所示。XNSN、GZMG、頂06、3806、乂凡6、!1呢6的等位基因"1"的频率分别为 0.4558，0·356、0·7968、0 ·3808、0· 4175，0· 7665,相应的等位基因 "D" 的频率为，0.5442、 0.6433、0.2032、0.6192、0.5825、0.2335。因此，不同品种最小等位基因频率(]\^?)等位基因 "Γ或"D"的频率均大于1%，故为稳定存在拷贝数变异(CNV)类型。
[0104] 表2山羊ΤΜΕΜ95基因58bp微小拷贝数变异基因频率分布表
[0105]
[0106] (五）山羊TMEM95基因微小拷贝数变异基因效应的关联分析 [0107] 基因型数据:2个拷贝-DD、3个拷贝-ID、4个拷贝-II三种基因型
[0108] 生产数据：西农萨能奶山羊生长性状;关中奶山羊生长性状，泌乳性状；内蒙古绒 山羊生长性状、繁殖性状;海南黑山羊生长性状等数据
[0109] 关联分析模型：利用SPSS(20.0)软件来分析品种，环境与基因位点等因素与生产 性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数 据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理 的过程中，依据影响生产性状的指标的因素的不同，考虑到年龄，环境的效应以及基因型的 效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所 示:Y = u+E+Age+G+E，其中，Y:个体表型记录;u:总体均值;E:环境效应;Age:年龄效应;G:标 记基因型效应;E:随机误差。
[0110] 结果表明：山羊TMEM95基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对山羊某些生 产性状(如生长性状，泌乳性状等)均有显著影响。
[0111] 由表3可以看出，在对2973份山羊样品，共计6个品种的研究中，58bp微小拷贝数变 异(CNV)对很多生产性状均有显著影响(P〈0.05)。对于生长性状，在西农萨能奶山羊、关中 奶山羊、内蒙古绒山羊以及海南黑山羊群体中，DD型2个拷贝的个体显著优于II型4个拷贝 的个体，生长性状有随着拷贝数增加而下降的趋势;对于泌乳性状，在关中奶山羊群体中， DD型2个拷贝的个体显著优于II型4个拷贝的个体，与生长性状一致，泌乳性状随着拷贝数 的增加也有下降的趋势。具体数据如表3所示。
[0112] 因此，山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异(CNV)是我国山羊生产性状筛选的拷 贝数变异(CNV)遗传标记。
[0113] 表3山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异对山羊生产性状的影响
[0114]
[0115] 注:生产性状不同的上标(a，b)表示有显著性差异。
【主权项】
1. 一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法，其特征在于:包括以 下步骤：以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增山羊TMEM95基因 部分片段，再对PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳;根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊 TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异； 所述引物对PIS: 上游引物：5 ' -AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3 ' ； 下游引物：5 ' -GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3 '。2. 根据权利要求1所述一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法， 其特征在于:所述PCR的扩增反应程序为： 1) 94.0 °C预变性5min，然后进入步骤2); 2) 94.0 °C 变性30 s，60.0 °C 复性30 s，72.0 °C 延伸 30 s，共40个循环； 3) 经过步骤2)后，72.0 °C延伸lOmin。3. 根据权利要求1所述一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法， 其特征在于:所述琼脂糖凝胶电泳采用质量分数为2.5 %的琼脂糖凝胶。4. 根据权利要求1所述一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法， 其特征在于:所述山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异为：2个拷贝表现为一条 253bp条带；3个拷贝表现为253bp和311bp两条条带、或者还同时存在由于异源双链结合而 形成的不同结构的第三条或者第四条条带;4个拷贝表现为一条311bp条带。5. -种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的试剂盒，其特征在于:包括 用于PCR扩增山羊TMEM95基因微小拷贝数变异位点的引物对P1，所述引物对P1为： 上游引物：5 ' -AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3 ' ； 下游引物：5 ' -GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3 '。6. -种如权利要求1所述利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法在 山羊分子标记辅助选择育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用PCR技术检测山羊TMEM？95基因微小拷贝数变异的方法及其应用，该方法以包含TMEM？95基因的中国地方山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增山羊TMEM？95基因部分序列，再对PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊TMEM？95基因非编码区58bp微小拷贝数变异；由于TMEM？95基因对生长性状、泌乳性状具有重要调控作用，故本发明提供的检测方法为TMEM？95基因的微小拷贝数变异与生产性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国山羊生产性状的标记辅助选择，利于建立遗传资源优良的山羊种群。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105624314
【申请号】CN201610149981
【发明人】蓝贤勇, 张思欢, 吴贤锋, 杨青, 许晗, 陈宏 , 雷初朝
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月16日