一种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法。通过从加拿大引进了野生青狗尾草群体中发现的抗烟嘧黄隆材料，并与国内谷子杂交，用产生的YM15谷子种质为材料克隆抗烟嘧黄隆基因(NiALS)进行克隆，以克隆基因NiALS为模板设计引物，PCR扩增，产物经SpeI?SacI酶切后与XbaI?SacI酶切的pBI121连接获得表达载体。叶盘法转化烟草，经卡那霉素筛选获得再生植株。与野生型野草相比，NiALS转基因烟草具有烟嘧黄隆抗性。采用本发明的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，有效地提高了植物的生产力和品质。
【专利说明】
_种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法
技术领域
[0001] 本发明涉及本发明涉及植物育种领域，具体是一种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育 方法。
【背景技术】
[0002] 农田杂草可导致农作物的减产并降低作物的品质。除草剂除草已成为当今农田有 效控制杂草，减少除草劳动量，提高作物产量与质量，发展农业生产一项基本措施。抗除草 剂育种工程也一直受到人们的广泛重视，特别是对那些不具抗除草剂特性、不能用除草剂 除草的作物尤为重要。
[0003] 谷子抗旱耐瘠，是我国北方优质抗旱粮食作物。然而谷子为小粒作物，单粒顶土能 力差，需密植确保出苗，然后进行人工间苗。另外，谷子对市场上销售的除草剂均不敏感，谷 田除草一直依靠人工作业。这种落后的生产方式不适合现代农业的要求，成为制约谷子集 约化、规模化生产的瓶颈难题。因此培育抗除草剂谷子品种具有重要意义。近年来，通过远 缘杂交育成的抗除草剂谷子品种，实现了谷田的化学除草;另通过选育抗、感拿捕净的同型 姊妹系，二者按一定比例混合播种，利用二者对除草剂的抗性差异，苗期通过喷施拿捕净同 步实现了谷子的化学间苗、化学除草。抗除草剂谷子的培育，简化了谷子栽培、实现了谷田 的化学除草，使谷子集约化、规模化生产成为可能。目前应用于抗除草剂谷子育种的主要是 拿捕净和咪唑乙烟酸两种类型。然而谷田杂草种类繁多，拿捕净为单子叶杂草除草剂，对双 子叶无效，除草不彻底;咪唑乙烟酸对单双子叶都有效，但长期使用单一除草剂具有使杂草 产生抗药性的潜在风险。
[0004]挖掘和利用可用于谷子育种的新型除草剂抗性基因，对于拓宽谷子抗除草剂育 种、增加谷子除草剂抗性的多样性是保障谷子化学除草持续有效和安全使用的一项重要措 施。
【发明内容】
[0005] 对此，本发明通过从加拿大引进的抗咪唑乙烟酸野生青狗尾草群体中筛选获得的 抗烟嘧黄隆突变体为材料，并与国内谷子杂交，用产生的YM15谷子种质为材料克隆抗烟嘧 黄隆基因 MALS，并进行转化和检测。采用本发明的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，有 效地提高了植物的生产力和品质。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 一种抗烟嘧黄隆基因，其特征在于，由SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 2所示的核苷酸 序列组成。
[0008] 一种抗烟嘧黄隆基因在培育抗除草剂谷子中的应用，其特征在于，该基因由SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列组成。
[0009] -种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010] (1)抗烟嘧黄隆除草剂基因（NiALS)扩增：
[0011] 引物序列FI: ACGAACGAGTGTGGCCTAAG;
[0012] R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG；
[0013] (2)植物表达载体构建：
[0014] 以克隆基因 NiALS为模板设计引物，正向引物序列5端加 Spe頂每切位点，反向引物 序列5端加 Sac頂每切位点，序列为：
[0015] F2:GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG，
[0016] R2：CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCG,
[0017] PCR扩增，产物经Spel-SacI酶切后与Xbal-SacI酶切的pBI121连接获得表达载体， 命名为 pBI121-NiALS。
[0018] (3)植物转化:叶盘法转化，经卡那霉素筛选获得再生植株。
[0019] 步骤（1)中，PCR 扩增反应体系为：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4μ L、10mmol L-1 引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNAlyL;反应条件 为：98°C预变性5s;98°C变性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40个循环；最后72°(：延伸 10min〇
[0020] 步骤（2)中，PCR 扩增反应体系为：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4μ L、10mmol L-1 引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNAlyL;反应条件 为：98°C预变性5s;98°C变性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40个循环；最后72°(：延伸 10min〇
[0021] 步骤(3)中，转化方法如下：
[0022]表达载体质粒pBI121-NiALS，通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中，用于烟草转化； 剪取新鲜叶子70%乙醇漂洗lmin，10%NaC10消毒lOmin;切掉叶片叶脉和叶片边缘，5-6个 外植体叶片，置于预培养基中（MS+O.lmgL-hAA+lmg L-1 6-BA)，光照下，预培养2天;预培养 2天后，取外植体置于提前准备好的0D600 = 1.0的农杆菌菌液中，轻轻晃动，侵染3-5min;用 滤纸吸除残留菌液后，置于新的预培养基中，避光共培养2天;2天后将外植体转入诱导培养 基中（MS+O.lmg L-hAA+lmg L-1 6_BA+160mg L-himentin+lOOrng L-lKan);待抗性芽长到 约lcm左右时，移到生根培养基上(MS+lOOmg L-lKan)，获得转基因再生植株。
[0023] -种检测权利要求1所述抗烟嘧黄隆除草剂的植物的方法，其特征在于，包括如下 步骤：T 0代再生植株提取D N A，进行P C R检测：设计特异性检测引物F 4 : GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4: CAGAGACAGTGGGTCGTCAC;电泳观察，阳性植株可扩出 392bp大小 的电泳条带，阴性植株无扩增条带。？〇?检测的反应体系2(^，含2\1^1(^、1〇111111〇11/1引 物各0.5yL、模板DNA lyL。反应条件为94°C预变性4min;94°C变性40s，59°C退火40s，72°C延 伸2〇8,35个循环；最后72°(：延伸51^11。
[0024] -种抗烟嘧黄隆除草剂的基因检测试剂盒，包括引物序列F4:
[0025] GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4:CAGAGACAGTGGGTCGTCAC。
[0026]在一个实施例中，所述试剂盒还包括引物序列F1:
[0027] ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；Rl：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG 〇
【附图说明】
[0028] 图1是Ni ALS基因 PCR扩增结果电泳图。
[0029] 图2是本发明的pEASY-El-NiALS重组蛋白表达结果电泳图。
[0030] 图3是本发明的PBI121-NiALS表达载体构建示意图。
[0031] 图4 NiALS转化烟草及转基因植株PCR检测电泳图。
【具体实施方式】
[0032]为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及【具体实施方式】对本发明 做进一步的介绍。
[0033]抗烟嘧黄隆谷子种质YM15由本实验室通过谷子与野生青狗尾草杂交获得。转基因 烟草受体W38、质粒PBI121由本实验室保存。
[0034]基因克隆和生物信息学分析
[0035] 参考NCBI公布的豫谷 1 号ALS基因 （GenBank accession ηο· :ΧΜ_004952503·2)、抗 烟嘧黄隆突变狗尾草ALS基因 （GenBank accession no. :KF020517)和谷子基因组(http:// plants · ensembl · org/Setaria_italica)，设计扩增YM15中烟啼黄隆除草剂基因（NiALS)， 引物序列FI: ACGAACGAGTGTGGCCTAAG; R1: GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG 〇
[0036] PCR反应体系50yL,含lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP各4yL、10mmol L-1 引物各 4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA lyL。反应条件为98°C预变性5s; 98°C变性10s,58°C退火30s,72°C延伸2min,40个循环；最后72°C延伸10min。
[0037] 用1.2%琼脂糖凝胶，在5V cm-1电压下电泳分离PCR产物，用0.01 %EB溶液染色 15min，用紫外成像仪照相。扩增片段大小预计为2100bP<3PCR获得了目的大小的片段(图1)。 [0038] PCR产物与pEASY-Tl载体连接后，经转化，挑取阳性克隆。送去测序。每个克隆测序 三次。获得NiALS全长序列。对该序列进行0RF读码框预测，氨基酸预测。
[0039] PCR产物与T载体连接后，测序获得NiALS序列（SEQ ID NOdhORF分析结果表明， 该序列包含1932bp的读码框(SEQ ID N0:2)，编码643个氨基酸（SEQ ID N0:3)，分子量为 69KD〇
[0040] 表达载体构建
[00411以克隆基因 NiALS为模板设计引物，构建植物表达载体。正向引物序列5端加 Spel 酶切位点，反向引物序列5端加 SacI酶切位点，序列为:F2:GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG， R2: CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCGlCR反应体系为：50yL，含 10 X buffer 5yL、250ymol L- ΜΝΤΡ各4yL、10mmol L-1 引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA 1μ L;反应条件为:98°C预变性5s;98°C变性10s，58°C退火30s，72°C延伸2min，40个循环;最后 72°C延伸lOmiruPCR产物经Spel-Sad酶切后与Xbal-Sad酶切的pBI121连接获得表达载 体，命名为 pBI121-NiALS。
[0042] 原核表达载体的构建：以克隆基因为模板，F3 : CTCCCTTTCCGTGCCACTCG-3，R3 : AAGGGCGGCGCTCCCTGAAT为引物，PrimerStar HS高保真聚合酶，扩增NiALS基因，PCR产物纯 化后与PEASY-E1原核表达载体连接(全式金），连接体系按说明书步骤。构建载体命名为 pEASY-E卜NiALS。
[0043] 原核表达
[0044] IPTG诱导融合基因的表达。将鉴定正确的BL21(DE3)菌液在LB(含LB/Amp+)中预培 养过夜；按1: 50~1:100比例转接过夜培养物到新鲜的LB液体培养液中（含LB/Amp + )， 250rpm，37 °C培养2~3h，使其0D600值达到Ο . 5-0.6左右；加入终浓度为ImM的IPTG进行诱 导，230rpm，37 °C分别继续培养2、4、6h，不加 IPTG诱导的样品作为对照；在不同时间点收集 菌液，空白大肠杆菌对照在4h时收集菌液，8000rpm离心10min，弃上清。
[0045] 沉淀悬浮于lOOul lx SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心lmin， 冰上放置，待全部样品处理完后电泳检测。SDS-PAGE组分为12 %分离胶，5 %浓缩胶。120V， 电泳2h。考马斯亮蓝染色检测表达结果。如图2所示。
[0046] NiALS转基因烟草的获得
[0047] NiALS插入到PBI121载体Xbal-Spel位点，获得表达载体PBI121-MALS(图3)。表达 载体转化到农杆菌AGL1后，叶盘法转化烟草，经卡那霉素筛选获得再生植株。
[0048] 具体方法如下：质粒pBI121-NiALS，参照BI0-RAD电击仪说明书，将不同载体组合 通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中。用于烟草转化:剪取新鲜叶子70%乙醇漂洗lmin，10% NaCIO消毒lOmin。切掉叶片叶脉和叶片边缘，5-6个外植体叶片，置于预培养基中(MS+O.lmg L-lIAA+lmg L-l 6-BA)，光照下，预培养2天。预培养2天后，取外植体置于提前准备好的 0D600 = 1.0的农杆菌菌液中，轻轻晃动，侵染3-5min;用滤纸吸除残留菌液后，置于新的预 培养基中，避光共培养2天;2天后将外植体转入诱导培养基中（MS+O.lmg L-lIAA+lmg L-1 6_BA+160mg L-lTimentin+100mg L-lKan);待抗性芽长到约lcm左右时，移到生根培养基上 (MS+100mg L-lKan)，获得转基因再生植株。
[0049] 转基因植株的检测
[0050] PCR检测TO代再生植株，阳性植株可扩出392bp大小的电泳条带，阴性植株无扩增 条带，扩增大小与预期一致，部分结果如图4。
[0051 ] PCR检测共获得6棵阳性植株。M: DL2000marker; P :PBI 121-NiALS质粒对照;W:野生 型烟草对照；1，2，3，4，：PCR检测阳性植株，5:PCR检测隐性植株。
[0052] 再生植株提取D N A，进行P C R检测，设计特异性检测引物F 4 : GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4: CAGAGACAGTGGGTCGTCAC。用 2 X EasyTaq PCR SuperMiX (全式 金)进行扩增。PCR反应体系20yL，含2 XMixlOyL、10mmolL-l引物各0.5yL、模板DNAlyL。反应 条件为94°C预变性4min;94°C变性40s，59°C退火40s，72°C延伸2〇8,35个循环；最后72°(：延 伸5min。扩增PCR产物大小为392bp。
[0053] 转基因烟草的抗除草剂验证
[0054]将上述鉴定阳性的转基因烟草植株，在苗期6-7片叶子时，喷施浓度为0.25% (V/ V)的商品化烟嘧黄隆除草剂(玉京香），该浓度为田间正常用药量，野生型烟草为对照。12天 后观察其生长发育情况，结果表明喷施除草剂的野生型植株生长受到抑制，叶片不同程度 发黄，萎蔫。而转基因植株可正常生长，具有烟嘧黄隆抗性。说明克隆的NiALS基因在烟草植 株内可正常表达，对烟嘧黄隆除草剂具有抗性。
[0055]本发明从远缘杂交育成的抗烟嘧黄隆谷子种质YM15中克隆了该抗性基因命名为 NiALS，基因全长1932bp，编码643个氨基酸。NiALS序列在1877位处存在G-A的单碱基突变， 导致626位异亮氨基酸替换丝氨酸，可能是其产生烟嘧黄隆抗性的原因。进一步对该基因进 行蛋白表达和功能验证，结果表明该基因可正常表达出目的大小的蛋白，与野生型野草相 比，NiALS转基因烟草具有烟嘧黄隆抗性。从分子水平水阐释该基因的功能，为该基因在谷 子抗除草剂育种及在其他作物中通过转基因技术培育抗除草品种奠定基础。
[0056]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗烟嘧黄隆基因，其特征在于，由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序 列组成。2. -种抗烟嘧黄隆基因在培育抗除草剂谷子中的应用，其特征在于，该基因由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。3. -种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 抗烟嘧黄隆除草剂基因(NiALS)扩增： 引物序列FI :ACGAACGAGTGTGGCCTAAG; Rl：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG； (2) 植物表达载体构建： 以克隆基因 NiALS为模板设计引物，正向引物序列5端加 Spel酶切位点，反向引物序列5 端加 Sac頂每切位点，序列为： F2:GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG， R2：CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCG, PCR扩增，产物经Spel-Sac頂每切后与Xbal-SacI酶切的pBI121连接获得表达载体，命名 为pBI121-NiALS。 (3) 植物转化:采用叶盘法，经卡那霉素筛选获得再生植株。4. 根据权利要求3所述的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于， 步骤（1)中，PCR 扩增反应体系为：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4yL、 lOmmol L-1引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA lyL;反应条件 为：98°C预变性5s;98°C变性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40个循环 ；最后72°(：延伸 10min〇5. 根据权利要求3所述的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于， 步骤（2)中，PCR 扩增反应体系为：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4yL、 lOmmol L-1引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA lyL;反应条件 为：98°C预变性5s;98°C变性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40个循环 ；最后72°(：延伸 10min〇6. 根据权利要求3所述的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于， 步骤(3)中，转化方法如下： 表达载体质粒pBI121-NiALS，通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中，用于烟草转化； 剪取新鲜叶子70%乙醇漂洗111^11，10%似(：10消毒101^11;切掉叶片叶脉和叶片边缘，5-6个外植体叶片，置于预培养基中（MS+O.lmg L-hAA+lmg L-1 6-BA)，光照下，预培养2天； 预培养2天后，取外植体置于提前准备好的0D600 = 1.0的农杆菌菌液中，轻轻晃动，侵 染3-5min;用滤纸吸除残留菌液后，置于新的预培养基中，避光共培养2天； 2天后将外植体转入诱导培养基中（MS+O.lmg L-UAA+lmg L-1 6-BA+160mg L- ^imentin+lOOmg L-lKan)； 待抗性芽长到约lcm左右时，移到生根培养基上(MS+lOOmg L-lKan)，获得转基因再生 植株。7. -种检测权利要求3所述抗烟嘧黄隆除草剂的植物的方法，其特征在于，包括如下步 骤： T 0代再生植株提取D N A，进行P C R检测：设计特异性检测引物F 4 : GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4:CAGAGACAGTGGGTCGTCAC; 电泳观察，阳性植株可扩出392bp大小的电泳条带，阴性植株无扩增条带。8.根据权利要求7所述的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于： PCR检测的反应体系20yL,含2XMix 10yL、10mmol L-1引物各0.5yL、模板DNA lyL。反应 条件为94°C预变性4min;94°C变性40s，59°C退火40s，72°C延伸2〇8,35个循环；最后72°(：延 伸5min〇
【文档编号】C12N15/29GK105837673SQ201610436009
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】程汝宏, 王根平, 张婷, 师志刚
【申请人】河北省农林科学院谷子研究所