维罗纳假单胞菌zw-a及其在生产4-异丙基苯甲酸中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种维罗纳假单胞菌ZW?A及其在生产4?异丙基苯甲酸中的应用。Pseudomonas sp.ZW?A可在好氧条件利用蒎烯类物质为唯一碳源，代谢过程中实现了4?异丙基苯甲酸的积累。该方法与化学合成法相比，具有条件温和、无二次污染等特点，是一种绿色的生产方法。它在2d内能利用100mg/L的α?蒎烯生产4?异丙基苯甲酸24mg/L。该降解菌的发现对4?异丙基苯甲酸的绿色生产具有重要意义。CCTCC NO：M 201578820151228
【专利说明】维罗纳假单胞菌ZW-A及其在生产4-异丙基苯甲酸中的应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种4-异丙基苯甲酸的制备，特别设及一种利用维罗纳假单胞菌ZW-A 制备4-异丙基苯甲酸的方法。 (二)【背景技术】
[0002] 4-异丙基苯甲酸(Cio出2〇2)又叫枯茗酸，是一种重要的精细化学品，在木材工业上 用作防腐剂和保护剂，还是免清洗助焊剂和某些高分子热敏电阻的原材料。近年来，4-异丙 基苯甲酸在医药等化学工业中得到了广泛应用，被视为重要的化工原料。
[0003] 4-异丙基苯甲酸的生产合成主要有两种途径:一种是W异丙苯作为原料，通过酷 化或者甲基化合成；另一种是W对异丙基甲苯，即对伞花控作为原料，醋酸钻为催化剂，醋 酸为溶剂，在氧气或空气中氧化而成。利用上述化学合成过程生产4-异丙基苯甲酸，不仅设 及原料较多，而且反应需在高溫高压下进行;此外，化学合成过程产物得率不高，容易产生 大量的环境污染（如原料、中间副产物、废催化剂等），是一种既不经济也不环保的生产方 法。
[0004] 羡締类物质（如a-羡締，CioHiS)是一种挥发性有机化合物，广泛应用于木材加工 业、造纸业和制药业。随着工业的发展，a-羡締被随意排放进入大气，给环境造成了极大的 危害。研究者发现，一些微生物能降解O-羡締，实现了羡締类物质的生物净化。同时，随着微 生物代谢有机物的中间产物被检测到，研究者提出了利用微生物生产化学品的思路，可W 替代传统的化学合成技术。本发明W羡締类控类物质为原材料，通过微生物的代谢作用，从 而实现了4-异丙基苯甲酸的积累，耗能低，产污少。该微生物还可用于含a-羡締废气的净化 过程，并得到4-异丙基苯甲酸，实现废物的资源化，具有广泛的工业应用前景。
[000引经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii)生产4-异丙基苯甲酸的报道。该微生物的获得对工业原料-4-异丙基苯甲酸的绿 色化生产具有重要的意义。 (H)
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种维罗纳假单胞菌ZW-A及制备在4-异丙基苯甲酸中的应用， 解决了利用传统化学方法生产4-异丙基苯甲酸需要原料多、反应条件苛刻、原料利用率低、 易产生二次污染等问题。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[000引本发明提供一株新菌株-维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW-A，保藏于中 国典型培养物保藏中屯、，保藏编号:CCTCC N0:M 2015788,保藏日期2015年12月28日，地址： 中国武汉，武汉大学，430072。该菌株的特征为：菌落呈乳白色，不透明，边缘光滑，具有黏 性。它生长最适pH值为7.0-7.5，最适溫度为28-32°C。
[0009]本发明还提供一种所述维罗纳假单胞菌ZW-A在生产4-异丙基苯甲酸中的应用，具 体所述的应用为：W羡締控化合物为底物，W维罗纳假单胞菌ZW-A为酶源，W无机盐培养基 为反应介质，在20-35 °C、pH值5-7、好氧/兼性好氧的条件下进行培养，反应完全后，将反应 液分离纯化，获得4-异丙基苯甲酸。
[0010]进一步，所述羡締控化合物为石油工业污染物，优选下列之一:a-羡締、0-羡締、对 异丙基甲苯和对异丙基苯甲醇。
[001 U 进一步，所述无机盐培养基终浓度组成为：K出P04234mg ? L-I，K2HP04942mg ? L-I， 化N03l700mg ? L-i，NH4C1 980mg ? L-i，MgCl2 ?細20 203.3mg ? L-i，CaCb ? 2出0 ll.lmg ? L -l，FeCl3l6.2mg?L-l，微量母液5mL?L-l，溶剂为蒸馈水，pH7.0~7.2;所述微量母液终浓 度组成为：ZnCbSSmg ? L-i，MnCl2 ? 4此0 60mg ? L-i，KI IOmg ? L-i，Na2Mo04 ? 2此0 IOOmg ? L-1，出B0350m邑? L-1，溶剂为蒸馈水。
[0012]进一步，所述无机盐培养基还可W为改良无机盐培养基，所述改良无机盐培养基 终浓度组成为：K此P〇4234mg ? L-i，K2HP〇4942mg ? [1，化N03l700mg ? [1，畑此1 980mg ? L-1， MgS040.l~0.5g ? L-i，CaCl2 ? 2出0 ll.lmg ? L-i，FeCl3 16.2mg ? [1，微量母液5mL ? L-i，溶 剂为蒸馈水，pH7.0~7.2;所述微量母液终浓度组成为：ZnCl288mg?L-l，MnCl2?4H20 60mg ? L-i，KI IOmg ? L-i，Na2Mo04 ? 2此0 IOOmg ? L-i，曲BO巧Omg ? L-i，溶剂为蒸馈水。优选 所述MgS040.307g ? L-i。
[OOU] 进一步，所述底物加入终浓度化OOmg/L。
[0014] 进一步，所述维罗纳假单胞菌ZW-AW菌悬液的形式加入，所述菌悬液制备方法为： 将Pseudomonas veronii ZW-A接种至斜面培养基，在20-35°C培养3-5d，获得斜面菌体;所 述每升斜面培养基终浓度组成为:酵母提取物5g，蛋白腺IOg，化Cl Sg，琼脂15-20g，蒸馈水 lL,pH 7.4-7.6;
[0015] 将斜面菌体接种至种子培养基，在20-3(TC培养2-4d，获得种子液;所述种子培养 基终浓度组成同无机盐培养基，旨化此P〇4234mg ? L-i，K2HP〇4942mg ? [1，化N03l700mg ? [1， 畑此1 980111邑*1-1，]\%(：12*6此0 203.：3111邑*[1，〔曰(：12*2此0 11.1111邑*[1，尸6(：1316.2111邑*1 -1，微量母液5mL ? 1/1，溶剂为蒸馈水，pH 7.0~7.2;所述微量母液终浓度组成为： ZnCbSSmg ? L-i，MnCl2 ? 4出0 60mg ? L-i，KI IOmg ? L-1，化2Mo04 ? 2出0 IOOmg ? L-1， 出B%50mg ? L-1，溶剂为蒸馈水。
[0016] 进一步，所述菌悬液加入培养基至ODs日日为0.1。
[0017] 所述维罗纳假单胞菌ZW-A在废水中最佳培养溫度为30°C、最佳抑7.2,好氧或兼性 好氧。所述假单胞菌ZW-A在2d内均能不同程度地利用0-羡締、对异丙基甲苯等物质实现4-异丙基苯甲酸的生产。
[0018] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明的Pseudomonas veronii ZW-A来自诱变突变株，能适应复杂的实际条件，能利用多种底物绿色无污染生产4-异丙基 苯甲酸，并在羡締类结构物质的废水废气中实现4-异丙基苯甲酸的积累，变废物为工业原 料，能实现含羡締类废水废气的资源化，既消除了污染又变废为宝，实现了废物的资源化。 Pseudomonas sp.ZW-A可在好氧条件利用羡締类物质为唯一碳源，代谢过程中实现了4-异 丙基苯甲酸的积累。该方法与化学合成法相比，具有条件溫和、无二次污染等特点，是一种 绿色的生产方法。它在2d内能利用lOOmg/L的a-羡締生产4-异丙基苯甲酸24mg/L。该降解菌 的发现对4-异丙基苯甲酸的绿色生产具有重要意义。 (四）
【附图说明】
[0019] 图1影印平板法筛选至Ij的Pseudomonas veronii ZW-A照片，A为LB平板，BMN平板；
[0020] 图2 Pseudomonas veronii ZW-A、ZW及空白对照a-羡締代谢率变化曲线；
[0021 ] 图3 Pseudomonas veronii ZW-A、ZW利用a-羡締实现4-异丙基苯甲酸的积累比较 曲线；
[0022] 图4不同培养基配比下Pseudomonas veronii ZW-A代谢a-羡締性能比较；
[0023] 图5不同培养基配比下Pseudomonas veronii ZW-A积累4-异丙基苯甲酸的性能比 较。 (五)
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0025] 本发明实施例所用无机盐培养基终浓度组成为:K出口〇4234111邑-1/1，1(2册〇4942111邑-L-i，NaN〇3l700mg ? L-i，NH4C1 980mg ? L-i，MgCl2 ? 6出0 203.3mg ? L-i，CaCl2 ? 2出0 ll.lmg?L-l，化Cl3l6.2mg?L-l，微量母液5血?L-l，溶剂为蒸馈水，pH7.0~7.2;所述微量 母液终浓度组成为：ZnCbSSmg ? L-i，MnCl2 ? 4此0 60mg ? [I，KI IOmg ? L-i，Na2Mo04 ? 2此0 IOOmg ? [I，出BO巧Omg ? [I，溶剂为蒸馈水。
[0026] 改良无机盐培养基终浓度组成为：KH2P〇4234mg ? L-i，K2HP〇4 942mg ? L-1， 化N〇3l700mg ? 1-1，畑此1 980mg ? L-i，MgS〇4〇.l~0.5g ? L-i，CaCl2 ? 2此0 ll.lmg ? L-i， FeCl3l6.2mg?[l，微量母液5mL?[l，溶剂为蒸馈水，pH7.0~7.2;所述微量母液终浓度组 成为：ZnCbSSmg ? L_i，MnCl2 ? 4出0 60m邑? L-i，KI 10m邑? L_i，Na2Mo04 ? 2此0 IOOmg ? L_i， 出B%50mg ? L-i，溶剂为蒸馈水。
[0027] 实施例1.Pseudomonas veronii ZW-A的获得和鉴定
[00巧]Pseudomonas veronii ZW-A是从本实验室现有菌株Pseudomonas sp.转座子诱变 而获得的突变株。具体步骤如下：
[00巧]将转座供体菌Escherichia COli SMlOApir质粒PSC123上的转座序列转移至受体 菌Pseudomonas sp.ZW(保藏编号为CCTCC N0:M 209313,已在专利申请CN101838623A中公 开）中进行插入诱变。具体操作步骤如下：取生长至对数后期的供体菌菌液，800化pm离5min 收集菌体，加等体积的液体LB培养基重悬，离屯、洗涂两次;加 1/10体积的液体LB重悬菌体， 获得浓缩后的供体菌;浓缩后的受体菌制备方法同供体菌;将浓缩后的供体菌和受体菌按 照不同体积比（5:1、1:1、1:5)混匀；取20化L混合菌液平滩于0.22WI1的微孔滤膜上，直径约 1cm，正置于不含抗生素的固体LB培养基;将LB平板于30°C正置培养，通过不同的接合时间 后（Id,2d和3d)取出滤膜，置入4mL LB试管，剧烈震荡，使滤膜上的菌体悬于LB中；根据菌悬 液浓度取不同体积菌悬液(ODsoo = 0.5取2(K)化;ODsoo= 1.0取50化)涂布于含lOOmg/L氨节青 霉素和50mg/L卡那霉素的双抗LB平板上，于30°C倒置培养;培养一定时间（3d或7d)后，待双 抗LB平板有单菌落出现，即为转座子诱变菌株。
[0030]上述经双亲结合产生的转座子诱变突变株，再利用影印平板(replica-plating method)的方法，进一步筛选4-异丙基苯甲酸代谢失活突变株，具体操作步骤如下：
[0031] 将上述平板出现的单菌落，用牙签接种到一块新的双抗LB平板，同时对应接种到 另一块双抗丽平板(氨节青霉素浓度为lOOmg/L，卡那霉素浓度为50mg/L)，使同一菌落在两 块平板上的位置相同；将LB平板和MN平板于30°C倒置培养一段时间（3d或7d)后，对比两平 板，取在LB平板上生长且在MN平板上不生长菌落（图1 )，于新的双抗LB平板和双抗MN平板再 次影印，验证生长能力;经生长验证后的菌落(在LB平板上生长且在MN平板上不生长菌落）， 即为4-异丙基苯甲酸代谢失活目标突变株，记为菌株ZW-A。菌落特征为菌株的特征为:菌落 呈乳白色，不透明，边缘光滑，具有黏性。它生长最适pH值为7.0-7.5，最适溫度为28-32°C。
[0032] 通过 16S rRNA序列（SEQ ID NO. 1所示）分析，确定菌株ZW-A为Pseudomonas veronii。具体步骤如下：
[0033] 采用3S柱离屯、式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2,上海申能博彩生物科技有限公 司）提取和纯化菌株ZW-A的DNA，4°C保存。选用细菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20对纯 化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为：
[0034] BSF8/20:5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'
[0035] BSR1541/20:5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'
[0036] PCR反应程序设定为：先94°C预变性4min;然后94°C变性1111111，59°(：退火1111111，721： 延伸1.5min，循环35个周期;然后72°C延伸IOmin;最后4°C保持lOmin。将PCR产物进行测序 (上海英潍捷基），测序结果见序列表。
[0037] 将菌株ZW-A的 16S rDNA序列（SEQ ID NO. 1所示）上传到Genbank,获得Genbank的 登录号KU323913,同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Pseudomonas 属，与Pseudomonas ve;ronii(AF064460)同源性最高，达到96%。因此，将该菌命名为维罗纳 假单胞菌（Pseudomonas ve;ronii)ZW-A。
[0038] MN平板终浓度组成同无机盐培养基。
[0039] LB平板终浓度组成:酵母提取物5g，蛋白腺IOg，化Cl Sg，琼脂15-20g，蒸馈水IL， pH 7.4-7.6。
[0040] 实施例2:Pseudomonas veronii ZW-A利用a-羡締实现4-异丙基苯甲酸的积累比 较
[0041] (1)菌悬液的制备
[0042] 将Pseudomonas veronii ZW-A接种至斜面培养基，在30°C培养3d，获得斜面菌体； 所述每升斜面培养基终浓度组成为:酵母提取物5g，蛋白腺IOg，化Cl Sg，琼脂15-20g，蒸馈 水lL，pH 7.4-7.6。
[0043] 将斜面菌体接种至种子培养基，在3(TC培养3d，获得种子液，即为对数生长期的 ZW-A菌悬液;所述种子培养基终浓度组成同无机盐培养基。
[0044] (2)4-异丙基苯甲酸的积累
[0045] 将无机盐培养基分装于250mL的密封玻璃瓶(50mL/个），110°C灭菌40min。待培养 基冷却后，加入处于对数生长期的ZW-A菌悬液，使初始细胞ODsoo值达到0.1，加入a-羡締作 为唯一碳源，初始浓度为lOOmg/L，置于30°C的摇床中16化pm培养。同样条件下，另取3瓶作 为空白对照，第1瓶仅添加无机盐培养基，不加 ZW-A菌悬液和a-羡締 ;第2瓶添加无机盐培养 基和ZW-A菌悬液，不加 a-羡締 ;第3瓶添加无机盐培养基和a-羡締，不加 ZW-A菌悬液。每隔12 小时，取样，用气相色谱检测Q-羡締的浓度，用分光光度计测定培养液的ODsqq值表征菌体生 长情况，离屯、后取上清液，过膜(孔径0.45WI1)后用高效液相色谱检测4-异丙基苯甲酸的含 量，绘制O-羡締的降解率和4-异丙基苯甲酸积累率随时间变化曲线。同样条件下，W原始株 ZW(即Pseudomonas SP. ZW)作为对照。
[0046] 气相色谱检测条件为:利用Agilent 6890来检测摇瓶上方a-羡締气体浓度，其色 谱柱为HP-Innowax毛细管柱（30m X 0.32mm X 0.5皿）。进样口和检测器(FID)的溫度分别为 250°C和300°C，柱溫为140°C，柱流速ImL/min，进样体积80化L。化为载气，分流比为15:1。氨 气流和空气流量分别为40mL/min和450mL/min。
[0047] 高效液相色谱检测条件为:采用Agilent Technologies 1200Series型高效液相 色谱仪分析测定溶液中的枯茗酸浓度。检测条件:SB-C18反相色谱柱(4.6 X 250mm，5WI1);检 测波长人为256nm;流动相为甲醇：水=60 : 40(V/V)，加入IOmM乙酸锭，用乙酸调整pH约为 4.0，利于调节峰型;流速为ImL/min;进样量25化，柱溫30°C。
[0048] 结果如图2和图3所示。可W明显看出，原始株ZW能在50h内将a-羡締代谢完全，但 菌株ZW-A却无法将a-羡締完全代谢，表明转座子的插入影响了菌株利用a-羡締的能力，运 可能是由于突变株的全基因序列中参与到Q-羡締降解的基因受到了影响，或者是一些降解 a-羡締的代谢产物的降解基因受到了影响，代谢产物的大量积累影响了突变株对O-羡締的 利用率。同时，对降解过程中积累的4-异丙基苯甲酸进行了分析。可W发现，对于原始菌株 ZW，4-异丙基苯甲酸的浓度随着降解时间的增加先增加后减少，其最大值在12h左右，为 5mg/L，说明菌株ZW在降解a-羡締的过程中不能积累4-异丙基苯甲酸，它是同时利用a-羡締 和4-异丙基苯甲酸维持生长的。而对于突变株，可W明显地看出，4-异丙基苯甲酸有一定程 度的积累，积累量达到16mg/L，且随着降解时间的延长(从36巧化化），4-异丙基苯甲酸并没 有减少，说明ZW-A不能利用4-异丙基苯甲酸作为碳源维持生长。
[0049] 实施例3:培养基组成对于Pseudomonas veronii ZW-A积累4-异丙基苯甲酸的性 能影响
[0050] 将无机盐培养基中的MgCl2 ? 6出0换成MgS〇4,其他同无机盐培养基，配制成改良无 机盐培养基，MgS〇4的质量分别为0.157g/L、0.207g/L、0.257g/L、0.307g/L、0.357g/L，110 °C灭菌40min。待培养液冷却后，向其中加入生长对数期的ZW-A菌悬液(实施例2方法制备）， 使初始细胞ODsoo值达到0.1，Wa-羡締为唯一碳源，初始浓度为lOOmg/L，置于30°C的摇床中 160巧m培养;每隔12小时检测4-异丙基苯甲酸的积累情况(方法同实施例2)，同时Wzw-A菌 悬液接种无机盐培养基(即原始培养基)为对照，确定最优的无机盐配方。
[0051 ]由图4、图5可知，当MgS〇4的浓度过大或者过小时（小于0.307g/L或者大于0.307g/ L)，a-羡締的代谢效率和4-异丙基苯甲酸的积累效率都有所下降，只有当MgS〇4的浓度为 0.307g/L时，菌株ZW-A利用a-羡締的效率最大为85%，相应的4-异丙基苯甲酸的积累率为 24.5%，明显高于利用无机盐培养基培养ZW-A实现4-异丙基苯甲酸的积累（约19%)。
[0052] 实施例4:Pseudomonas veronii ZW-A利用含羡締类结构的控类化合物生产4-异 丙基苯甲酸的性能考察
[0053] 分别Wa-羡締、0-羡締、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇作为唯一碳源，考察菌株 Pseudomonas veronii ZW-A对于运些物质的利用及积累能力4-异丙基苯甲酸。结果表明， 菌株ZW-A能实现4-异丙基苯甲酸的积累，并且积累量均在20% W上。具体实施方案如下：
[0054] 分别取600mL(pH7.2)改良无机盐培养基（0.307g/L MgS化替代无机盐培养基中 MgCb ? 6此0)分装至12个250mL的摇瓶中，分成S组(组I-组3)，每组4瓶，110°C灭菌40min。 待培养液冷却后，其中组1和组2每瓶加入生长对数期的ZW-A菌悬液(实施例2方法制备），分 别Wa-羡締、e-羡締、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇作为唯一碳源，初始浓度均为IOOmg/ L，置于30 °C的摇床中16化pm培养;相同条件下，组3不加 ZW-A菌悬液，分别添加 a-羡締、0-羡 締、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇，作为空白对照。培养2d离屯、后取上清液，过膜后用高效 液相色谱检测4-异丙基苯甲酸的含量(方法同实施例2)，计算积累率。
[0055] 结果如表1所示。菌株ZW-A能不同程度地利用a-羡締、0-羡締、对异丙基甲苯、对异 丙基苯甲醇，并且实现培养基中4-异丙基苯甲酸的积累。和空白对照相比，积累量分别达到 了 24%、21%、25% 和 23%。
[0056] 表1菌株ZW-A利用不同底物积累4-异丙基苯甲酸的比较 [0化71
【主权项】
1. 维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW-A，保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏编号：CCTCC N0:M 2015788,保藏日期2015年12月28日，地址：中国武汉武汉大学， 430072〇2. -种权利要求1所述维罗纳假单胞菌ZW-A在生产4-异丙基苯甲酸中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以蒎烯烃化合物为底物，以维 罗纳假单胞菌ZW-A为酶源，以无机盐培养基为反应介质，在20-35°C、ρΗ值5-7的条件下进行 培养，反应完全后，将反应液分离纯化，获得4-异丙基苯甲酸。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述蒎烯烃化合物为下列之一:α-蒎烯、β-蒎 烯、对异丙基甲苯和对异丙基苯甲醇。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养基终浓度组成为：ΚΗ2Ρ〇4 234mg · L_1,K2HP〇4 942mg · L_1,NaN03 1700mg · L_1,NH4C1 980mg · L_1,MgCl2 · 6H2O 203.3mg · L-^CaCh · 2H20 ll.lmg · L-^FeCh 16.2mg · L-S微量母液5mL · L-S溶剂为蒸 馏水，pH 7.0~7.2;所述微量母液终浓度组成为：ZnCl2 88mg · L-SMnCh · 4H20 60mg · L -^KI lOmg.L-lOOmg.L-50mg.L-S溶剂为蒸馏水。6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养基为改良无机盐培养基，所述 改良无机盐培养基终浓度组成为：KH2P〇4 gASmg.L-SNaNOs 1700mg· L-^NHaCI 980mg.L-^MgSCk 0.1 ~0.5g.L-ll.lmg.L-^FeCh 16.2mg.L 一S微量母液5mL · I/1，溶剂为蒸馏水，pH 7.0~7.2;所述微量母液终浓度组成为：211(：12 88mg · L_1,MnCl2 · 4H20 60mg · L_1,KI lOmg · L_1,Na2Mo〇4 · 2H20 lOOmg · L_1,H3B〇3 50mg · L一 S溶剂为蒸馏水。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述MgS〇4 0.307g · L一、8. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物加入终浓度为100mg/L。9. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述维罗纳假单胞菌ZW-A以菌悬液的形式加 入，所述菌悬液制备方法为:将维罗纳假单胞菌ZW-A接种至斜面培养基，在20-35 °C培养3-5d，获得斜面菌体;所述每升斜面培养基终浓度组成为：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂 15-20g，蒸馏水1L，pH 7 · 4-7 · 6; 将斜面菌体接种至种子培养基，在20-30°C培养2-4d，获得种子液;所述种子培养基终 浓度组成同无机盐培养基。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于所述菌悬液加入培养基至OD600为0.1。
【文档编号】C12N1/20GK105838651SQ201610345493
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】成卓韦, 陈建孟, 於建明
【申请人】浙江工业大学