LPNISKP修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸,其制备,纳米结构,活性及应用
【专利摘要】本发明公开了下面结构的LPNISKP修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，LPNISKP是结构中Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro，Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的正规缩写，公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它抗肿瘤细胞粘附的作用，公开了它抗肿瘤细胞侵袭的作用，公开了它抗肿瘤细胞迁移的作用，公开了它的抗肿瘤作用，进一步公开了它抑制肿瘤向肺转移的作用。因而本发明公开了它在医学中的应用。
【专利说明】
LPNISKP修饰的1 -乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸，其制备， 纳米结构，活性及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。涉 及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤转移作用，涉及 它的抗肿瘤细胞粘附侵袭和迀移作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物，制备抗肿瘤 转移药物，及抗肿瘤细胞迀移粘附和侵袭药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 人们从天然的植物中提取了 β -咔啉类化合物，这是一类吲哚类生物碱。其具有 多种生物学活性，具有明确的抗肿瘤活性。用于肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌 症的治疗。然而咔啉类化合物作为传统的细胞毒性化合物，其对于肿瘤细胞的选择性 较差。随着基因学和分子生物学的研究深入在分子水平筛选对肿瘤细胞选择性高，特异性 强的低毒药物成为了抗肿瘤药物发展的新方向。近年来人们对咔啉类化合物做了大量 的修饰工作，合成了许多β-咔啉类化合的衍生物。然而这些修饰效果都不显著。其中1位 引入乙酰基，3位引入色氨酸苄酯得到的化合物，其体内抗肿瘤活性和体外细胞毒活性显著 优于单纯平面环的β-咔啉类化合物。然而，该类化合物对正常细胞毒性较大，水溶性差， 对肿瘤细胞的特异性杀伤能力有限。因此，这种修饰的局限性仍是十分明显的。
[0003] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素 α ν β 3的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞 粘附活性。ΚΕ二肽，LDV三肽以及LPNISKP七肽也通过阻断整合素家族的其他受体对肿瘤 细胞的粘附转移起到明显的抑制作用。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化 合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤和抗肿瘤粘附浸润和迀移作用的化合物。
[0004] 发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro与1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酸偶联，形成的1-乙酰 基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro会同时具有抗肿瘤，抗肿瘤转移 和抗肿瘤细胞粘附浸润和迀移作用。基于如此认识，发明人提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个内容是提供下面结构的1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酉先-Leu-Pr〇-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro〇
[0006]
[0007] 本发明的第二个内容是提供1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的制备方法，该方法由以下步骤构成：
[0008] (1)室温下L-Trp-〇Me与1，3-二羟基丙酮在稀盐酸中反应48h，过滤得到滤饼。 滤饼溶解于二氧六环溶液。在冰盐浴下用2NNa0H调节pH = 12,反应10h，得到1-乙酰 基-β -咔啉酰-3-羧酸；
[0009] (2) 1-乙酰基-β -咔啉酰-3-羧酸与L-Trp-OBz 1偶联并皂化制备1-乙酰 基-β-咔啉酰-3-色氨酸；
[0010] (3)将 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 与 1-乙酰基-β - 啉 酰-3-色氨酸偶联，制备1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc )-Pr〇-〇Bzl；
[0011] (4)将 1-乙酰基-β - 啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pr〇-〇 Bzl脱保护，制备1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pr〇-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro〇
[0012] 本发明的第三个内容是评价1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro 抗细胞增殖的活性。
[0013] 本发明的第四个内容是评价1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro对S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。
[0014] 本发明的第五个内容是评价1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro抗肿瘤细胞粘附，侵袭和迀移的作用。
[0015] 本发明的第六个内容是评价1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro 抗肿瘤转移的作用。
【附图说明】
[0016] 图1. 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的合成路 线· i)CH30H，S0C12, ii)DHA，HC1 ;iii)2N NaOH，二氧六环；iv)Trp-〇Bzl，DCC，HOBt，NMM ; v)2N NaOH，THF ;vi)DCC，HOBt，NMM ;TFA/TFSA。
[0017] 图2. 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在水溶液 中1 X 10 9M浓度下的透射电镜照片。
【具体实施方式】
[0018] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0019] 实施例1制备1-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸甲酯
[0020] 称取5g L-Trp-〇Me于100ml茄瓶中，加入10ml 37°C温水搅拌溶解，加入3. 3g 1， 3-二羟基丙酮。室温反应36h，离心，弃去水层，沉淀晾干，得到lg(收率20% )标题化合 物，为棕色固体，待用。ESI-MS(m/e) :257[M+H]+。
[0021] 实施例2制备1 -乙酰基-β -咔啉-3-羧酸
[0022] 称取5g 1-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸甲酯于250ml茄瓶中，加入二氧六环溶解，冰 浴缓慢加入2N NaOH水溶液调节pHl2，反应13h。反应液用饱和KHS04水溶液调节pH8，减压 浓缩。残留物用饱和KHS0 4调节pH2,有机层用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到4g (80% ) 标题化合物，为棕黄色固体。ESI-MS(m/e) :241[M-H]。
[0023] 实施例3制备1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸苄酯
[0024] 称取2g 1-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸，用10ml无水THF溶解，冰浴下加入2g DCC， 1. 2g HOBt，搅拌30min，得溶液A。3. 2g Trp-OBzl溶于15ml无水THF，缓慢加入N-甲基吗 啉调节溶液PH9,得溶液B。冰浴下将B液缓慢加入A液当中，用N-甲基吗啉调节pH9,反 应12h，TLC显示原料消失（石油醚：丙酮=4 : 1)。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留 物用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到的4. 38g糖浆状产物用石油醚/丙酮体系干柱层析 纯化（石油醚/丙酮=4/1)得到2g(46% )标题化合物，为黄色固体产率。ESI-MS(m/e): 531[M+H]+〇
[0025] 实施例4制备1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸
[0026] 称取2g 1-乙酰基-β -咔啉-3-酰基-Trp-OBzl，无水THF溶解。冰浴下加入2Ν NaOH水溶液，调节pH12,反应1. 5h。TLC显示原料点消失（石油醚/丙酮=2/1)，反应液用 饱和KHS04水溶液调节pH8,减压浓缩，残留物用饱和KHS0 4调节pH2,有机层用乙酸乙酯萃 取3次，减压浓缩，得到1. 5g(90% ) 1化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e) :529[M-H]。
[0027] 实施例 5 制备 Boc-Leu-Pro-OBzl
[0028] 按照实施例 3 的方法由 2. 5g (10. 82mmol) Boc-Leu 和 2. 5g (10. 35mmol) HC1 · Pro-OBzl 得到 3. lg(73% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :418[M+H]+。
[0029] 实施例 6 制备 Boc-Leu-Pro
[0030] 按照实施例 4 的方法由 5. 00g(11. %mmol)Boc-Leu-Pro-OBzl 得到 2· 9〇g(74% ) 标题化合物。ESI-MS(m/e) :328 [Μ-Η]。
[0031] 实施例 7 制备 Boc-Asn-Ile-〇Bzl
[0032] 按照实施例 3 的方法由 4. 00g (17. 24mmol) Boc-Asn 和 6. 50g (16. 54mmol) TosH · Ile-〇Bzl 得到 5. 58g(80% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :436[M+H]+。
[0033] 实施例 8 制备 HC1 · Asn-Ile-〇Bzl
[0034] 将 6. 00g(13. 79mmol)Boc-Asn-Ile-0Bzl 溶解在 75mL 氯化氢-乙酸乙酯（4N)溶 液中，冰盐浴搅拌2小时，TLC监测（二氯甲烷：甲醇=25 : 1)显示原料点消失，减压浓缩 除去乙酸乙酯，残留物少量乙醚进行磨洗并减压浓缩，此操作重复3次。得到4. 8g(94% ) 标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :336 [M+H]+。
[0035] 实施例 9 制备 Boc-Leu_Pr〇-Asn-Ile-〇Bzl
[0036] 按照实施例 3 的方法由 4. 70g (14. 33mmol) Boc-Leu-Pro 和 4. 7g (12. 63mmol) HCl.Asn-Ile-〇Bzl 反应得到 5.23g(64%)目标物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :646[M+H] +。
[0037] 实施例 10 制备 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile
[0038] 按照实施例 4 的方法由 5. 23g(8. llmmol)Boc-Leu-Pr〇-Asn-Ile-〇Bzl 得至丨J 4. 15g(92% )标题化合物。ESI-MS(m/e) :554[M-H]。
[0039] 实施例 11 制备 Boc-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl
[0040] 按照实施例 3 的方法由 5. 00g(10. 68mmol)Boc-Lys (Fmoc)和 2. 7g(13. 08mmol) HC1 · P-〇Bzl 得到 4. 5g(63% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :654. 8[M+H]+。
[0041] 实施例 12 制备 HC1 · Lys (Fmoc) -Pro-OBzl
[0042] 按照实施例 8 的方法由 10.0 Og (14. 84mmol) Boc-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 得到 8. 3g(92%)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :554[M+H]+。
[0043] 实施例 13 制备 Boc-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0044] 按照实施例 3 的方法由 9. 05g (14. 83mmol) HC1 · Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 和 2. 90g(14. 16mmol)Boc-Ser 得到 4. 21g(40% )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e): 758[M+H]+。
[0045] 实施例 14 制备 HC1 · Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0046] 按照实施例 8 的方法由 2. OOg (2. 63mmol) Boc-Ser-Lys (Fmoc) -Pr〇-〇Bzl 得到 1.5g(83%)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :658[M-H]。
[0047] 实施例 15 制备 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0048] 按照实施例 3 的方法由 1. 5g (2. 70mmol) Boc-Leu-Pro-Asn-Ile 和 1. 97g(2. 82mmol)HCl ·3θγ-Ι^8(Ρπιο〇)-Ρ;γ〇-〇Βζ1 得到 810mg(26% )标题化合物，为无色油 状物。ESI-MS (m/e) :1179 [M+H]+。
[0049] 实施例 16 制备 HC1 · Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0050] 按照实施例 8 的方法由 450mg (0· 38mmol) Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl 得到 400mg(934%)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :1117[M+H]+。
[0051] 实施例 17 制备 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc )-Pr〇-〇Bzl
[0052] 按照实施例3的方法由160mg (0· 364mmol) 1-乙酰基-β -咔啉-3-酰基-Trp和 426mg HC1 · Leu-Pr〇-Asn-Ile-Ser_Lys(Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 得 150mg (产率 22% )标题化合 物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e) :1503[M+H]+。
[0053] 实施例18制备1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-P ro (2)
[0054] 称取 200mg 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -P ro-OBzl于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下依次加入4ml三氟甲磺酸和lml三氟乙酸，冰浴搅拌 1小时，反应结束。冰浴搅拌下加入50ml无水乙醚，析出黄色絮状固体，离心，乙醚洗3次， 得黄色固体，冰浴下将其溶于2ml蒸馏水，滴加1 %氨水调至pH = 5,减压过滤除去不溶物， 滤液减压浓缩，残留物经C18柱层析纯化（甲醇：水=8 : 1)，得到31mg(20% )标题化 合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e) :1189[M-H]-.Mp :195. 2-196. 7°C;[a ]D25= -25. l(c = 0· 08, CH30H). 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) : δ /ppm = 10. 94(s，1H)，9· 05(s，1H)，8· 53(d，J = 9Hz，3H)，8. 44(d，J = 9. 0Hz，1H)，8. 23(d，J = 9. 0Hz，1H)，8. 08(d，J = 9. 0Hz，1H)，7. 95(s， 1H)，7. 82(d，J = 9. 0Hz，1H)，7. 75(d，J = 9Hz，1H)，7. 64(m，3H)，7. 48(s，1H)，7. 32(m，2H)， 7. 24 (s，1H)，7. 02 (m，2H)，6. 87 (m，1H)，4. 92 (m，1H)，4. 72 (m，1H)，4. 54 (m，2H)，4. 30 (m，1H)， 4· 23 (m，1H)，4· 12 (m，1H)，3· 80 (m，2H)，3· 61 (m，5H)，3· 50 (m，4H)，2· 89 (s，3H)，2· 72 (s，2H)， 2. 68 (s，2H)，1. 98 (m，2H)，1. 94 (m，3H)，1. 86 (m，4H)，1. 61 (m，8H)，1. 39 (m，2H)，1. 24 (m，1H)， 1.08〇11，1!1)，0.91(111，6!1)，0.80(111，6!1);册1^：纯度为95.0%，乙腈：水=1:1.5。波长 280nm，流速 0· 8ml/min。
[0055] 实验例1测定化合物2的透射电镜照片
[0056] 将化合物2按照1 X 10 9M的浓度配置化合物的水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射 电镜（TEM，JEM-1230, JE0L)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图2。结果表明， 化合物2在水中均可形成纳米颗粒，直径为47-58nm。
[0057] 实验例2测定化合物2的细胞毒作用
[0058] 1)本发明的化合物2用含0. 1 % DMS0的培养基配制成所需浓度；
[0059] 2)实验用的肿瘤细胞为SH-SY5Y (人神经母细胞瘤细胞），HL60 (人早幼粒细胞白 血病细胞），HeLa (人宫颈癌细胞），S180 (鼠腹水瘤细胞），HeCaT (人永生化表皮细胞）；
[0060] 3)HL60 和 S180 细胞株采用 RPMI-1640 培养基进行培养。HeLa、SH-SY5Y、HeCaT 三 株细胞采用DMEM培养基进行培养。培养基中均含10 %经灭活的胎牛血清和1 X 105U/L青 霉素和100mg/L链霉素。
[0061] 4)贴壁细胞的培养方法：分别将处于对数生长期且生长状态良好的HeLa、 3^￥5￥、他031'细胞以5\10 4个/11^的密度接种于96孔板，每孔10(^1^37.5°(：、5%〇)2 培养箱中培养8-10h，按预设的浓度梯度加入受试样品（受试样品经过预先灭菌），对照组 加入等体积的溶解样品的溶剂。继续培养48h (24h观察细胞状态），每孔加25 μ L浓度为 5mg/mL的ΜΤΤ溶液，置于37。。孵育四个小时，排枪小心吸去上清液后每孔加入100 μ L的二 甲基亚砜（DMS0)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测0. D.(吸光度）值，波长 490nm〇
[0062] 5)悬浮细胞的培养方法：分别将处于对数生长期且生长状态良好的HL60和S180 细胞以5 X 104个/mL的密度接种于96孔板，每孔100 μ L，37. 5 °C、5 % C0 2培养箱中培养 8-10h，按预设的浓度梯度加入受试样品（受试样品经过预先灭菌），对照组加入等体积的 溶解样品的溶剂。继续培养48h (24h观察细胞状态），每孔加25 μ L浓度为5mg/mL的MTT 溶液，置于37°C孵育4h，离心，3000rpm，5min，排枪小心吸去上清液后每孔加入100 μ L的二 甲基亚砜（DMS0)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测0. D.(吸光度）值，波长 490nm〇
[0063] 6)按照以下计算公式求出每个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率：
[0064] 生长抑制率=[(空白组平均O.D.值-样品组平均O.D.值）/空白组平均 O.D.值]X 100%，每个浓度下实验重复三次，取平均值。平均抑制率对药物浓度作图，并求 出IC5。值（半数抑制浓度），结果列入表1。化合物2抑制5种肿瘤细胞增殖的1C 5。大于 100 μ M，没有细胞毒作用。
[0065] 表1化合物2的抗肿瘤细胞增殖活性IC5。（ i ± SD μΜ)
[0066]
[0067] 实验例3评价化合物2的抗肿瘤活性
[0068] 受试化合物：1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸苄酯，化合物2 ;
[0069] 阳性对照药：阿霉素；
[0070] 实验动物：ICR小鼠，雄性，体重20±2g(x土SD);北京维通利华动物实验技术有限 公司提供。给药组每组12只小鼠，空白及阳性对照组每组各15只小鼠。
[0071] 瘤源：小鼠 S180肉瘤，北京大学医学部动物实验中心提供，自行传代维持。
[0072] 溶剂：受试化合物悬浮于0. 5%羧甲基纤维素钠（CMCNa)溶液。阿霉素溶于生理 盐水。
[0073] 化合物2组的S180小鼠口服给药，每天给药一次，剂量为0. 1 μ mol/kg，连续给药 10天。阴性对照组的S180小鼠口服生理盐水，每次0.2mL/只，连续给10天。阳性对照组 的S180小鼠腹腔注射阿霉素，每天给药一次，剂量为2 μ mol/kg，连续给药10天。
[0074] 采用自行传代的S180腹水瘤模型小鼠，取小鼠腹水S180瘤液，离心、去除杂质 后，接种于健康小鼠腋下，构建S180实体瘤模型：在无菌条件下，处死腹水瘤小鼠，于75% 酒精中浸泡l〇min消毒，取出小鼠于表面皿中晾干酒精，打开腹腔，抽取接种7天后生长旺 盛S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成（瘤液：生理盐水=1 : 2)的液体，混合，离心 5min (1000转），去除细胞碎片，取细胞液于生理盐水中，用新鲜配制的0. 2%台盼蓝染色， 混匀后按细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，按如下公式计算细胞 浓度和细胞存活率；
[0075] 细胞浓度=4大方格内活细胞数/4X 104X稀释倍数=细胞数/mL ;
[0076] 细胞存活率=活细胞数八活细胞数+死细胞数）X 100% ;
[0077] 将存活率大于90%的瘤液用匀浆法制备成IX 107个/mL的细胞悬液，于健康小鼠 腋皮下接种〇. 2mL/只，小鼠体重为20±2g。
[0078] 每天观察各给药组动物的反应：小鼠的自主活动能力、精神状态、毛发颜色、呼吸 状态、饮食情况、粪便性状。
[0079] 每组连续给药7天后，于第8天称取小鼠体重，乙醚麻醉并脱颈椎处死，然后用镊 子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤使肿瘤完全暴露，钝性剥离，称瘤重，以7 ±SD g 表示，结果列入表2。数据统计均采用t检验和方差分析。
[0080] 可以看出，在阿霉素的给药剂量为2 μ mol/kg，化合物2的给药剂量为0. 1 μ mol/ kg时对治疗小鼠的瘤重有等同的影响。可见，化合物2的抗肿瘤作用比阿霉素强20倍。
[0081] 表2化合物2对S180荷瘤小鼠瘤重的影响
[0082]
[0083] η = 12 ;a)与生理盐水组比 P < 0.01，与阿霉素（2ymol/kg)比 P > 0.05.
[0084] 实验例4化合物2抗肿瘤细胞粘附的活性
[0085] 1)受试样品
[0086] 化合物2用含0· 1 % DMS0的DMEM培养基配制成100 μ Μ浓度。
[0087] 2)细胞株
[0088] 高转移的HCC-LM3细胞。
[0089] 3)主要试剂
[0090] DMEM培养基干粉：购自Gibco公司；
[0091] PBS 缓冲液：每 1L 溶液中含有 NaCl 8. 2g、KC1 0· 2g、Na2HP04 · H20 1. 56g、 KH2P040 . 2g，PH 值 7. 4 ;
[0092] 胎牛血清：购自Hyclone公司；
[0093] 0· 25%胰酶溶液：购自Hyclone公司；
[0094] 青霉素、链霉素：购自石药集团中诺药业（石家庄）有限公司；
[0095] MTT (四噻唑蓝）：购自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤 除菌后使用，避光保存；
[0096] DMS0(二甲基亚讽）：购自Hyclone公司；
[0097] Fn (人纤维连接蛋白）：购自Sigma公司。
[0098] 4)实验方法
[0099] 用PBS配制100 μ g/mL的Fn溶液，按100 μ L/孔加入96孔培养板中，将培养板置 于4°C冰箱过夜。次日，吸除未包被的Fn溶液，用PBS洗一次，每孔加入含2% FBS的PBS溶 液30 μ L封板，在37°C和5% 0)2的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、 处于对数生长期的HCC-LM3细胞以5 X 104个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔 100 μ L，同时加入25 μ L化合物的溶液2,使其终浓度为20nM，在37°C、5% C02培养箱中培 养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25 μ L浓度为5mg/mL的MTT溶液， 置于37°C、5% C02培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100 μ L的DMS0,振 荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测0. D.(吸光度）值。粘附抑制率的 计算公式如下：粘附抑制率（％ ) = [l-(2a-c组细胞0D值/空白组细胞0D值）]X 100%; 实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以& ±SD)表示。
[0100] 6)实验结果
[0101] 化合物2的抗细胞粘附实验结果列入表3。从结果中可以看出，化合物2在2 μΜ 时有较弱的抗HCC-LM3细胞与FN粘附的作用，当浓度增大到20 μ Μ时，化合物2抗HCC-LM3 细胞与FN粘附的作用明显增强。
[0102] 表3化合物2的体外抗肿瘤细胞粘附评价
[0103]
[0104] 实验例5化合物2抗肿瘤细胞侵袭的活性
[0105] 1)化合物2用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成浓度为100 μ Μ的溶液。
[0106] 2)细胞为高转移HCC-LM3。
[0107] 3)基质胶为 matrigelo
[0108] 4)实验方法
[0109] 将冻存于-20°C冰箱的基质胶matrigel 4°C过夜，变成液态；取720 yL无血 清DMEM培养基，加入180 μ LMatrigel，混勾，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室， 100 μ L/个，放入37°C和5% C02培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50 μ L DMEM培养基，37°C和5% C02培养箱中孵育30min。
[0110] HCC-LM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度 为2 X 105个/mL。每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入25 μ L化合物2a-c的溶液，使其 终浓度为20 μ M。空白对照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制的溶液。下室加入 600 μ L无血清DMEM培养基，在37°C和5% C02培养箱中培养48小时。
[0111] 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除 固定液，用PBS洗3次，用0. 1 %的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0112] 在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检 验和方差分析，侵袭的细胞数以均值土SD表示。
[0113] 5)结果见表4。可以看出，化合物2的浓度为20μΜ时与空白对照组相比，具有明 显的抗HCC-LM3细胞侵袭作用。与发明人公开的Lys-Glu抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓 度为ImM相比，化合物2的有效浓度降低了 50倍。
[0114] 表4化合物2的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0115]
[0116] η = 9 ;a)与空白对照组比p < 0. 01.
[0117] 实验例6化合物2抗肿瘤细胞迀移的活性
[0118] 1)化合物2用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成浓度为100 μ Μ的溶液。
[0119] 2)细胞为高转移HCC-LM3。
[0120] 3)实验方法
[0121] HCC-LM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为 5 X 105个/mL。每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入25 μ L同时加入25 μ L化合物2的溶 液，使其终浓度为20 μ Μ。空白对照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制的溶液。下 室加入600 μ L无血清DMHM培养基，在37°C和5% C02培养箱中培养8小时。
[0122] 用棉签擦去上室内的细胞之后，用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液， 用PBS洗3次，用0. 1 %的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0123] 在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检 验和方差分析，侵袭的细胞数以均值土SD表示。
[0124] 4)结果见表5。可以看出，在20μΜ浓度下化合物2与空白对照组比，发生迀移的 细胞数均显著减少，说明在该条件下化合物2具有明显的抗HCC-LM3细胞迀移作用。与发 明人公开的Lys-Glu抑制HCC-LM3细胞迀移的有效浓度为ImM相比，化合物2的有效浓度 降低了 50倍。
[0125] 表5化合物2的体外抗肿瘤细胞迀移活性
[0126]
[0127] η = 9 ;a)与空白对照组组比p < 0· 01.
[0128] 实验例7化合物2a_c抗肿瘤转移的活性
[0129] 受试化合物化合物2
[0130] 阳性对照药阿霉素
[0131] 实验动物C57BL/6小鼠，SPF级，雄性C57BL小鼠，体重18-20g，6-8周，购于北京 维通利华实验动物技术有限公司。接种C57BL/6小鼠的瘤源为Lewis小鼠肺癌细胞（LLC)， 由体外细胞培养，自行传代维持。
[0132] 化合物2加入少量的吐温80润湿助溶，逐渐加入0. 5% CMCNa水溶液至所需要浓 度即可。
[0133] 化合物2组小鼠口服给药。每天给药一次，给药剂量为0. 1 μ mol/kg，连续给药10 天。阴性对照组小鼠口服生理盐水。每天给药一次，剂量为〇.2mL/只，连续给10天。阳性 对照剂量为以腹腔注射阿霉素。每天给药一次，给药剂量为2 μmol/kg，连续给药10天。
[0134] 动物模型
[0135] l)Lewis小鼠肺癌细胞（LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养，其中含10%经灭活的 胎牛血清和1 X 105U/L青霉素和100mg/L链霉素培养LLC细胞。按照贴壁细胞培养方法， 每两天传代一次，富集细胞。
[0136] 2)待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度 至lXl〇7mL，胎盘蓝（Tryanblue)拒染实验示活细胞数> 95%。取近交系C57BL/6小鼠， 雄性，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持ImL无菌注射器于小鼠 腋部皮下注射瘤细胞悬液〇. 2mL/只（含肿瘤细胞数约为2X 106/mL)。接种后8-10天可以 生长成绿豆粒大的肿瘤，给药备用。
[0137] 3)取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，颈椎脱白，用75%乙醇浸泡消 毒lOmin，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻 璃组织匀浆器内，按瘤块重（g):生理盐水体积（mL)为1 : 3的比例加入4°C预冷的生理盐 水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至 lX107/mL，胎盘蓝（Tryanblue)拒染试验示活细胞数> 95%。
[0138] 4)取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窝 皮肤，右手持lmL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0. 2mL (含肿瘤细胞数约为 2X 106/mL)。接种后8-10天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积 分组进行给药。
[0139] 5)每天观察各给药组小鼠的自主活动能力、精神状态、毛发颜色、呼吸状态、饮食 情况、粪便性状。
[0140] 6)每组连续给药10天后，于第11天称取小鼠体重，乙醚麻醉并脱颈椎处死小 鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤使肿瘤完全暴露，钝性剥离，称重，以 无土SDg表示。
[0141] 7)用镊子固定小鼠右腋部位，剪开皮肤使双肺完全暴露，钝性剥离双肺，称重，并 迅速放入生理盐水中保存。统计双肺的瘤节转移数和转移例数。
[0142] 8)实验结果列入表6和表7。从表6可知，在0. 1 μ mol/kg的给药剂量下，化合物 2除有效地抑制Lewis瘤生长。剂量比阿霉素低20倍时，化合物2抑制Lewis瘤生长的活 性与阿霉素没有统计学差异。可见，化合物2抑制Lewis瘤生长的活性是阿霉素的20倍。 从表7可知，在0. 1 μ mol/kg的给药剂量下，化合物2有效地减少瘤节转移例数和转移个 数。
[0143] 表6化合物2抑制Lewis肺癌的活性
[0144]
[0145] η = 12 ;a)与生理盐水组比P < 0.01，与阿霉素组比P > 0.05.
[0146] 表7化合物2在Lewis肺癌转移模型中的转移瘤节和转移例数
[0147]
[0148] η =12 ;a)与生理盐水组比，P< 0.01。
【主权项】
1. 下面结构的化合物卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-IIe-Ser-Lys-Pro2. 权利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的 制备方法，该方法由以下步骤构成： (1) 室温下L-Trp-OMe与1，3_二羟基丙酮在稀盐酸中反应48h，过滤得到滤饼，滤饼 溶解于二氧六环，得到的溶液在冰盐浴下用2N的NaOH水溶液调节pH至12,反应10h，得到 1-乙酰基-β -咔啉酰-3-羧酸； (2) 1-乙酰基-β -咔啉酰-3-羧酸与L-Trp-OBzl偶联并皂化制备1-乙酰基-β -咔 啉酰-3-色氨酸； (3) 将 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl 与 1-乙酰基-β - P专P林酰 _3_ 色 氨酸偶联制备1_乙酰基_ β _味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OB zl ; (4) 将 1-乙酰基-β - P专卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl 脱保护制备1-乙酰基-β -卩专卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-IIe-Ser-Lys-ProD3. 权利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的 纳米结构。4. 权利要求1的1-乙酰基-β -味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在 制备抗肿瘤药物中的应用。5. 权利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在 制备抗肿瘤细胞粘附、迀移和侵袭药物中的应用。6. 权利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在 制备抗肿瘤转移药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105884863SQ201410772094
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月16日
【发明人】彭师奇, 赵明, 王玉记, 吴建辉, 于翔
【申请人】首都医科大学