一株竹黄菌及其在发酵生产竹红菌素中的应用
【专利摘要】本发明公开了一株竹黄菌及其在发酵生产竹红菌素中的应用，将分别采于安徽黄山地区，浙江衢州地区和四川宜宾地区的竹黄，经分离得到三株竹黄菌，进行基础培养基培养，离子束处理之后，得到一株活力最为旺盛的菌株，其分类命名为竹黄 (Shiraia bambusicola) NJTECH?1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.11617。本发明得到的竹黄菌，具有很高的代谢活力，发酵生产竹红菌素的产量高。可以应用田间废弃的秸秆和禽畜粪便作为发酵基质，可以减少秸秆焚烧的数量，在节约成本的同时，降低环境污染。CGMCC NO.1161720151130
【专利说明】
一株竹黄菌及其在发酵生产竹红菌素中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株竹黄菌及其在发酵生产竹红菌素中的应用。
【背景技术】
[0002]竹黄主要分布于中国东南方部分省份，另外，在亚洲的日本也有分布，其他国家则未见报道。竹黄菌产生的竹红菌素，有良好的散淤活血、祛风利湿、补中益气和促进新陈代谢、增强体质等功效，在临床上多用于治疗胃气痛、风湿性关节炎、跌打损伤以及坐骨神经痛等疾病。并且这种色素安全无毒、色泽鲜红、着色力强且富有保健功能，作为食用色素也有着广阔的前景。
[0003]传统的竹红菌素生产方法，一般分为生物合成法和化学合成法，生物合成法主要是利用玉米粉，麸皮，小麦等粮食作物为原料，利用竹黄菌发酵生产竹红菌素，再进行分离纯化，虽然相对于其他生产方式来讲产量有所增加，但在粮食价格逐步攀升的时代，这种方法也使得最终产物的成本提高了许多，不利于竹红菌素的大规模应用。另外一种为化学合成法，利用3，5_ 二羟基苯甲酸为最初反应物，经过12步化学反应，合成了竹红菌素，但是本方法反应步骤较多且复杂，副反应多，所用试剂毒性较大，成本也高，并不是生产竹红菌素的好方法。
[0004]2005年，中国玉米秸杆就已经达到约20207 X 104t，并且秸杆还田的比例很低，虽然国家明令禁止焚烧秸杆，但是仍然不能完全根治秸杆过多的问题。寻求合理利用废弃秸杆的方法尤为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株竹黄菌及其在发酵生产竹红菌素中的应用，该竹黄菌的竹红菌素产量高，且可有效利用废弃秸杆、废弃禽畜粪便等物质发酵生产竹红菌素，降低生产成本且安全环保。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
本发明将分别采于安徽黄山地区，浙江衢州地区和四川宜宾地区的竹黄，经分离得到三株竹黄菌，进行基础培养基培养，离子束诱变处理后，得到一株活力最为旺盛的竹黄菌，其分类命名为竹黄{Shiraia bambusicola) NJTECH-1，已于2015年11月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC N0.11617。
[0007]所述菌株是通过如下方法筛选得到的:分别采于安徽黄山地区，浙江衢州地区和四川宜宾地区的竹黄，分离得到三株竹黄菌，利用液态土豆汁培养基进行基础培养，26 °C培养五天之后，同时测定生物量和竹红菌素分泌量，得到一株活力最为旺盛的菌株即为采集自四川宜宾的菌株，命名为Super-3，作为优势菌株。
[0008]用生理盐水将Super-3的孢子洗下，接于液态种子培养基中培养。将培养好的竹黄菌孢子悬液按10倍稀释法稀释至细胞数为107/mL，取菌液0.1 mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(90、135、180、225、270) X 2.6 X 113N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用I mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，26 °C倒置培养4-5 d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌丝生长速度快且竹红菌素分泌率最高的菌株，命名为竹黄{Shiraia bambusicola) NJTECH-10
[0009]所述竹黄(Shiraiabambusicola) NJTECH-1 的培养条件为:
该菌种采用好氧培养的方式。用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖，蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、大米、玉米等材料;用于培养该菌株的氮源可以是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、硫酸铵等材料。该菌株生长的最佳温度范围为24-28°C，pH范围4-9，最佳pH范围为5-
7。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，磷酸镁等无机盐类。
[0010]所述竹黄(Shiraia bambusicola) NJTECH-1的生理形态特征为:
平板培养形态:在PDA平板上生长良好，培养至第三天菌落开始以放射状生长;菌丝为白色绒毛状，中间部分较两边菌丝发达;菌落中心部分培养基为红色，是菌体分泌的色素，色素在培养基中成暗红色，形成环状同心圆，中间颜色深，周围颜色浅。培养五天左右，培养基全部变为红色，背面明显可以看到大量黑色成团孢子，显微镜下可见管状菌丝，孢子约1.1wn左右ο
[0011]所述的竹黄{Shiraia bambusicola) NJTECH-1在发酵生产竹红菌素中的应用。包括如下步骤:
1)种子培养:用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中，24?30°C培养40?48h;
2)取步骤I)的种子液5mL接入固态培养基中进行发酵培养，培养温度为26°030 °C，生产竹红菌素。
[0012]步骤I)中所述液体种子培养基包括如下质量百分比的组分:碳源2%?3%，氮源0.2%-0.4%，无机盐0.05%?0.1 %，pH自然，其中所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、大米、玉米中的至少一种;所述氮源选自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、硫酸铵中的至少一种，所述无机盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸镁中的至少一种。
[0013]步骤2)中所述固体培养基可以为用粮食作为配置的培养基，例如，包括如下质量百分比的组分:玉米粉68.9%-75%，麸皮5%-10%，米糠15%_20%，葡萄糖1%_3%，KH2PO4
0.1%-0.2% ,MgSO4.7H20 0.05%-0.07%。
[0014]也可以为用野草、玉米秸杆、禽畜粪便(以鸡粪和牛粪为主)、石膏以及少量豆柏为原料发酵制备得到固体培养基，具体发酵方法为:先将野草和玉米秸杆与禽畜粪便混合，，预湿处理过后再添加石膏、豆柏等辅料，在发酵隧道中进行一次发酵，待温度升至70-80°C时保温4-5天，而后降温，降温期间翻堆若干次，得到含水量为70%-80%的培养料。后进行二次发酵，将一次发酵所得培养料转入二次发酵隧道内，利用培养料中的微生物发酵，待温度达到55-60°C时，保温9-llh，再将培养料进行为期4-5天的腐熟发酵阶段，最终得到含水量为65%-70%的培养基料，可以作为培养竹黄菌的固态基质。
[0015]上述各物料的比例关系可以根据实际情况进行调整。比如先将野草和玉米秸杆与禽畜粪便按1:1:0.7左右比例混合，预湿处理过后再按混合物料与辅料以1:2.5左右的比例添加石膏、豆柏等辅料。
[0016]该培养基配方中野草，玉米秸杆，禽畜粪便(以鸡粪和牛粪为主)，石膏以及少量豆柏均为低价易得的原料，利用它们作为竹黄菌的发酵基质，不仅大大降低竹红菌素的生产成本，而且可以对秸杆进行有利的二次利用，保护环境。
[0017]用秸杆发酵处理之后用于竹黄菌固态发酵以生产竹红菌素有着很大的市场潜力，主要表现在:2005年，中国玉米秸杆就已经达到约20207*104t，并且秸杆还田的比例很低，此举可以充分利用废弃秸杆，不仅来源广泛，而且还能有效保护环境。由于竹红菌素在药学，生物学中有很大的应用前景，但是价格却很昂贵，导致不能广泛使用，此种方法大大降低了生产成本，为竹红菌素的大范围使用提供了可能。
[0018]有益效果:本发明与现有技术相比具有如下优势:
1.与其他菌种相比，本发明的竹黄菌具有很高的代谢活力，发酵生产竹红菌素的产量尚O
[0019]2.与传统的生物法相比，将培养的原料从粮食作物(玉米粉等)变成了田间废弃的秸杆和禽畜粪便，从成本上来说，得到了很大幅度的降低，而且可以减少秸杆焚烧的数量，在节约成本的同时，降低环境污染。
[0020]3.与传统化学法相比，本发明方法简便，进一步降低成本，带来巨大的经济效益。
【具体实施方式】
[0021]通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
[0022]实施例1竹黄{Shiraia bambusicola) NJTECH-1 的诱变筛选
将分别采于安徽黄山地区，浙江衢州地区和四川宜宾地区的竹黄，分离得到三株竹黄菌，利用液态土豆汁培养基进行基础培养，26 °C培养五天之后，同时测定生物量和竹红菌素分泌量，得到一株活力最为旺盛的菌株即为采集自四川宜宾的菌株，命名为Super-3，作为优势菌株。
[0023]用生理盐水将Super-3的孢子洗下，接于液态种子培养基中，26°C培养12小时，将培养好的竹黄菌孢子悬液按10倍稀释法稀释至细胞数为107/mL，取菌液0.1 mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(90、135、180、225、270)X 2.6 X 113NVcm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用I mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，26 °(:倒置培养4-5 d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌丝生长速度快且竹红菌素分泌率最高的菌株，命名为竹黄{Shiraia bambusicola)NJTECH-1。
[0024]实施例2竹黄(Shiraia bambusicola) NJTECH-1的培养及生理学特征所述竹黄、Shiraia bambusicola) NJTECH-1的培养条件为:
该菌种采用好氧培养的方式，用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、大米、玉米等材料;用于培养该菌株的氮源可以是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、硫酸铵等材料;该菌株生长的最佳温度范围为24-28°C，pH范围4-9，最佳pH范围为5-7，在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，磷酸镁等无机盐类。
[0025]所述竹黄(Shiraia bambusicola) NJTECH-1的生理形态特征为: 平板培养形态:在PDA平板上生长良好，培养至第三天菌落开始以放射状生长;菌丝为白色绒毛状，中间部分较两边菌丝发达;菌落中心部分培养基为红色，是菌体分泌的色素，色素在培养基中成暗红色，形成环状同心圆，中间颜色深，周围颜色浅。培养五天左右，培养基全部变为红色，背面明显可以看到大量黑色成团孢子，显微镜下可见管状菌丝，孢子约1.1wn左右ο
[0026]实施例3竹黄(Shiraia bambusicola) (LBR-SB6)发酵生产竹红菌素A 用生理盐水将竹黄菌(LBR-SB6)(由江南大学工业生物技术教育部重点实验室保藏)
的孢子洗下，接入液体种子培养基中，26°C，120rpm培养40h，取5mL种子液接入固态培养基中，温度控制在26°C培养。液体种子培养基包括如下组分:葡萄糖2g/L，磷酸氢二钾0.lg/L，无水硫酸镁0.05g/L，牛肉膏0.3g/L，pH自然。
[0027]种子液接入固态培养基中进行发酵培养，培养温度为26t>3(TC，生产竹红菌素。固态培养基包括如下质量比的成分(％):60目的玉米粉68.9，麸皮9.85，米糠20，葡萄糖I, KH2PO4 0.2 ,MgSO4.7H20 0.05。
[0028]发酵结果，主要转化物为竹红菌素A，产量约为40mg/kg。
[0029]实施例4竹黄{Shiraia bambusicola) NJTECH-1发酵生产竹红菌素A
种子培养:用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中，26 °C培养40h;液体种子培养基包括如下组分:葡萄糖2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，无水硫酸镁0.05g/L，牛肉膏 0.3g/L，pH 自然。
[0030]种子液接入固态培养基中进行发酵培养，培养温度为26t>3(TC，生产竹红菌素。固态培养基包括如下质量比的成分(％):60目的玉米粉68.9，麸皮9.85，米糠20，葡萄糖
I,KH2PO4 0.2 ,MgSO4.7H20 0.05。
[0031]发酵结果，主要转化物为竹红菌素A，产量为78.1mg/kg。
[0032]实施例5竹黄(Shiraia bambusicola) NJTECH-1以秸杆发酵生产竹红菌素A 固态培养基的制备:用野草、玉米秸杆、禽畜粪便(以鸡粪和牛粪为主)、石膏以及少量豆柏为原料，先将野草和玉米秸杆与禽畜粪便按1:1:0.7左右比例混合，预湿处理过后再按1: 2.5左右的比例添加石膏、豆柏等辅料，在发酵隧道中进行一次发酵，温度升至70-80 °C时保温4-5天，而后降温，降温期间翻堆若干次，得到含水量为70%-80%的培养料。后进行二次发酵，将所得培养料转入二次发酵隧道内，利用培养料中的微生物发酵，待温度达到55-60°(:时，保温9-1111，再将培养料进行为期4-5天的腐熟发酵阶段，最终得到含水量为65%-70%的培养基料，作为培养竹黄菌的固态基质。
[0033]种子培养:用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中，26°C培养40h;液体种子培养基包括如下组分:葡萄糖2g/L，磷酸氢二钾0.lg/L，无水硫酸镁0.05g/L，牛肉膏0.3g/L，pH自然。
[0034]取种子液5mL接入固态培养基中进行发酵培养，培养温度为26°030°C，生产竹红菌素，168h后测定竹红菌素A的含量，发酵结束。发酵结果，主要转化物为竹红菌素A，产量为4mg/kg。
[0035]实施例6竹黄(Shiraia bambusicola) NJTECH-1以秸杆发酵生产竹红菌素A 固态培养基的制备:用野草，玉米秸杆，禽畜粪便(以鸡粪和牛粪为主)，石膏以及少量豆柏为原料，先将野草和玉米秸杆与禽畜粪便按1:1:1左右比例混合，预湿处理过后再按1:3左右的比例添加石膏，豆柏等辅料，在发酵隧道中进行一次发酵，待温度升至70-80°C时保温4-5天，而后降温，降温期间翻堆若干次，得到含水量为70%-80%的培养料。后进行二次发酵，将所得培养料转入二次发酵隧道内，利用培养料中的微生物发酵，待温度达到55-60Γ时，保温9-1 Ih，再将培养料进行为期4-5天的腐熟发酵阶段，最终得到含水量为65%-70%的培养基料，作为培养竹黄菌的固态基质。
[0036]种子培养:用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中，26°C培养40h;液体种子培养基包括如下组分:葡萄糖2g/L，磷酸氢二钾0.lg/L,无水硫酸镁0.05g/L，牛肉膏0.3g/L，pH自然。
[0037]种子液接入固态培养基中进行发酵培养，培养温度为26t>3(TC，生产竹红菌素，168h后测定竹红菌素A的含量，发酵结束，发酵液中主要转化物为竹红菌素A，产量为8.5mg/
kg ο
以上实施例中竹红菌素A采用如下方法测定:
先测定出竹红菌素A的标准曲线:精确称取竹红菌素A标品3.6mg，置于1ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，得标准品溶液浓度为0.36mg/ml，用无水乙醇稀释成一系列浓度(10，20，30，50，100，120，180，240，单位:yg/ml)，将一系列不同浓度的标品溶液在464nm处测吸光度，以竹红菌素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行回归计算，得到竹红菌素标准回归方程为y=0.0403x-0.0283,R2=0.9997。
[0038]竹红菌素含量的测定:将固态培养基放入干燥箱干燥，用食品加工机粉碎，取0.1g的粉碎物与50ml无水乙醇混合，搅拌浸提2h，浸提后取浸提液高速离心，取上清液，得到澄清色素溶液，用无水乙醇稀释若干倍之后，采用分光光度计法在464nm波长处测定吸收度，根据标准回归方程计算竹红菌素的含量。
【主权项】
1.一株竹黄菌，其分类命名为竹黄(Shiraiabambusicola) NJTECH-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.11617。2.权利要求1所述的竹黄菌在发酵生产竹红菌素中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤: 1)种子培养:用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中，24?30°C培养40~48h； 2)取步骤I)的种子液接入固态培养基中进行发酵培养，培养温度为260C-30°C，生产竹红菌素。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤I)中所述液体种子培养基包括如下质量百分比的组分:碳源2%?3%，氮源0.2%~0.4%，无机盐0.05%~0.1%，pH自然，其中所述碳源选自葡萄糖、鹿糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、大米、玉米中的至少一种;所述氮源选自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、硫酸铵中的至少一种，所述无机盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸镁中的至少一种。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述固体培养基为用野草、玉米秸杆、禽畜粪便、石膏或者豆柏中的至少一种为原料，发酵得到含水量为65%-70%的培养基料。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述固体培养基包括如下质量百分比的组分:玉米粉68.9%?75%，麸皮5%?10%，米糠15%?20%，葡萄糖1%?3%，KH2PO4 0.1%-.0.2%，MgSO4.7H20 0.05%?0.07%。
【文档编号】C12R1/645GK105925493SQ201610496366
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】郝宁, 胡洁, 丁叶, 刘兆星, 许琳, 欧阳平凯
【申请人】南京工业大学