一种从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法，属于蜗牛酶提取技术领域。本发明以蛞蝓为原料，粉碎得匀浆液与制得的咪唑盐离子液体混合，搅拌萃取，过滤得含有蜗牛酶的离子液体，加入磷酸盐溶液，分层后在向其中加入硫酸铵，离心得沉淀，再向沉淀物中加入三羟甲基氨基甲烷?盐酸缓冲溶液，经透析浓缩，得蜗牛酶液，进行冻干，从而得到从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法。实例证明，本发明方法独特新颖，利用蛞蝓为原料，变害为宝，且在提取的过程中无需对原料内脏进行分离，简化了工艺，缩短了时间，最终制得的蜗牛酶纯度高达95％以上，收率提高至90％以上，在常温下活性保持良好，可进行大规模量产，具有良好的经济效益和社会效益。
【专利说明】
一种从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法，属于蜗牛酶提取技术领域。
【背景技术】
[0002]蜗牛酶是很有价值的一种酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，可以用于酵母细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究；它可做饲料添加剂，从而提高饲料的消化率;也可用作果汁澄清，橘子脱囊衣，果酱制作等。
[0003]在现有技术中，蜗牛酶的提取主要活体蜗牛在刺激下自身分泌出来的蜗牛粘液和蜗牛的内脏为原料，蜗牛粘液成分包括蛋白质，蜗牛酶，黏液素，硫酸软骨素蛋白多糖，羟基乙酸等;蜗牛的嗦囊及消化道中含有20多种酶，蜗牛酶是多种混合酶;其中有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等;价值高，广泛应用在细胞学，基因工程学领域，在医学上，饲料的添加剂，保健品都有应用。
[0004]目前蜗牛酶的提取方法存在工艺复杂、操作性差和提纯率低的缺陷，保存条件高使得蜗牛酶价格居高不下，不能实现量产，除此以外，国内并有没有完成有效的提取蜗牛酶的提取技术，一方面蜗牛粘液的提取非常困难，不能对蜗牛内脏进行有效的分离，在提取的过程中，蜗牛酶损害严重，而且蜗牛酶的保存困难，影响保管运输。
[0005]蛞蝓又称水蜒蚰、鼻涕虫，是一种软体动物，是一种食性复杂和食量较大的有害动物。蛞蝓是蔬菜作物的主要有害生物之一，对叶菜类蔬菜以及果瓜、豆类蔬菜幼苗造成很大的为害，蔬菜被害后，叶片或叶球被食成孔洞或缺刻，排出的粪便污染叶面或包球，使细菌易侵入，造成菜叶或叶球腐烂，不堪食用，也极大地影响了蔬菜的品质。
[0006]因此，目前提供一种工艺简单、操作性强，提纯率高并且能够有效提高蜗牛酶得率的方法。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统方法在提取蜗牛酶的过程中，仍存在工艺复杂、操作性差和提纯率低问题，另外在提取过程中对蜗牛内脏不能有效进行分离，导致蜗牛酶损害严重，不能实现量产的现状，提供了一种以蛞蝓为原料，粉碎得匀浆液与制得的咪唑盐离子液体混合，搅拌萃取，过滤得含有蜗牛酶的离子液体，加入磷酸盐溶液，分层后在向其中加入硫酸铵，离心得沉淀，再向沉淀物中加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，经透析浓缩，得蜗牛酶液，进行冻干，从而得到从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法。该方法独特新颖，利用蛞蝓为原料，变害为宝，且在提取的过程中无需对原料内脏进行分离，简化了工艺，缩短了时间，最终制得的蜗牛酶纯度高达95%以上，收率提高至90%以上，在常温下活性保持良好，可进行大规模量产，具有良好的经济效益和社会效益。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(I)用清水洗净两只重量均为30?40g新鲜活体野蛞蝓，将洗净的蛞蝓放入烧杯中，向烧杯中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸盐溶液，将烧杯中的物质倒入高速组织捣碎机中，以8000?lOOOOr/min的速度匀浆20?30min，充分粉碎得匀浆液，备用；
(2)量取200?300mL去离子水加入到单口烧瓶中，向单口烧瓶中加入2?3gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制温度为O?5°C，边搅拌边向烧瓶中加入100?200mL质量浓度为40%六氟磷酸溶液，搅拌反应2?3h，自然冷却至室温，分液，得有机相，用饱和碳酸钠洗涤有机相，直至有机相呈中性，再减压蒸馏，得到无色液体，即咪唑盐离子液体；
(3)将上述咪唑盐离子液体和I?2g磷酸氢二钾加入到上述步骤(I)备用的匀浆液中，搅拌萃取40?50min，过滤，得滤液，将滤液静置分层，去上层，得到含有蜗牛酶的离子液体；
(4)向上述含有蜗牛酶的离子液体中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸盐溶液，搅拌50?60min，静置分层，分液得到含有蜗牛酶的磷酸盐溶液，即粗酶液；
(5)向上述粗酶液中加入3?5g硫酸钱，搅拌10?20min，于O?4°C冰箱内，静置5?6h，用4000?6000r/min离心机离心10?20min，得沉淀，将沉淀加入到盛有100?200mLpH7.4?7.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的烧杯中，搅拌10?20min后，装入透析袋中用去离子水透析72?74h，将保留液置于浓缩罐中浓缩3?4h，得到蜗牛酶液；
(6)将上述蜗牛酶液置于-10?-15°C真空冷冻干燥器内，冻干24?26h，得到白色粉末，即蜗牛酶。
[0009]本发明的应用方法是:在本发明制得的蜗牛酶中加入去离子水稀释10倍，之后将退楽后的纯棉纺织用品在8 O?8 5 °C的温水中漂洗I?3次，洗后扎干，以5?8m /m i η的速度浸扎稀释后的蜗牛酶液，扎后在60?65°C蒸汽条件下堆置，并用80?85°C的温水再次漂洗I?3次后烘干即可。经检测，加入本发明制得的蜗牛酶后，处理纯棉纺织用品润湿时间由原来的30?32s提升至10?12s，百度值Wr由原有的55?56提升至78?80，效果极其显著。
[0010]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法独特新颖，原料简单易得，利用蛞蝓为原料，变害为宝，且在提取的过程中无需对蛞蝓内脏进行分离，简化了工艺的同时缩短了时间，绿色环保；
(2)本发明制得的蜗牛酶纯度高达95%以上，收率提高至90%以上，在常温下保持8?10年，活性仍保持良好，可进行大规模量产，具有良好的经济效益和社会效益。
【具体实施方式】
[0011]首先用清水洗净两只重量均为30?40g新鲜活体野蛞蝓，将洗净的蛞蝓放入烧杯中，向烧杯中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸盐溶液，将烧杯中的物质倒入高速组织捣碎机中，以8000?10000r/min的速度匀浆20?30min，充分粉碎得匀浆液，备用；然后量取200?300mL去离子水加入到单口烧瓶中，向单口烧瓶中加入2?3g1-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制温度为O?5°C，边搅拌边向烧瓶中加入100?200mL质量浓度为40%六氟磷酸溶液，搅拌反应2?3h，自然冷却至室温，分液，得有机相，用饱和碳酸钠洗涤有机相，直至有机相呈中性，再减压蒸馏，得到无色液体，即咪唑盐离子液体;接下来将上述咪唑盐离子液体和I?2g磷酸氢二钾加入到上述备用的匀浆液中，搅拌萃取40?50min，过滤，得滤液，将滤液静置分层，去上层，得到含有蜗牛酶的离子液体;之后向上述含有蜗牛酶的离子液体中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸盐溶液，搅拌50?60min，静置分层，分液得到含有蜗牛酶的磷酸盐溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入3?5g硫酸钱，搅拌10?20min，于O?4°C冰箱内，静置5?6h，用4000?6000r/min离心机离心10?20min，得沉淀，将沉淀加入到盛有100?200mLpH7.4?7.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的烧杯中，搅拌10?20min后，装入透析袋中用去离子水透析72?74h，将保留液置于浓缩罐中浓缩3?4h，得到蜗牛酶液;最后将上述蜗牛酶液置于-10?-15°C真空冷冻干燥器内，冻干24?26h，得到白色粉末，即蜗牛酶。
[0012]实例I
首先用清水洗净两只重量均为30g新鲜活体野蛞蝓，将洗净的蛞蝓放入烧杯中，向烧杯中加入300mLpH7.4磷酸盐溶液，将烧杯中的物质倒入高速组织捣碎机中，以8000r/min的速度匀浆20min，充分粉碎得匀浆液，备用；然后量取200mL去离子水加入到单口烧瓶中，向单口烧瓶中加入2g1-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制温度为O 0C，边搅拌边向烧瓶中加入10mL质量浓度为40%六氟磷酸溶液，搅拌反应2h，自然冷却至室温，分液，得有机相，用饱和碳酸钠洗涤有机相，直至有机相呈中性，再减压蒸馏，得到无色液体，即咪唑盐离子液体;接下来将上述咪唑盐离子液体和Ig磷酸氢二钾加入到上述备用的匀浆液中，搅拌萃取40min，过滤，得滤液，将滤液静置分层，去上层，得到含有蜗牛酶的离子液体;之后向上述含有蜗牛酶的离子液体中加入300mLpH7.4磷酸盐溶液，搅拌50min，静置分层，分液得到含有蜗牛酶的磷酸盐溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入3g硫酸铵，搅拌1min，于O V冰箱内，静置5h，用4000r/min离心机离心1min，得沉淀，将沉淀加入到盛有100mLpH7.4三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的烧杯中，搅拌1min后，装入透析袋中用去离子水透析72h，将保留液置于浓缩罐中浓缩3h，得到蜗牛酶液;最后将上述蜗牛酶液置于-10°C真空冷冻干燥器内，冻干24h，得到白色粉末，即蜗牛酶。
[0013]本实例操作简便，使用时，在本发明制得的蜗牛酶加入去离子水稀释10倍，之后将退浆后的纯棉纺织用品在80°C的温水中漂洗I次，洗后扎干，以5m/min的速度浸扎稀释后的蜗牛酶液，扎后在60°C蒸汽条件下堆置，并用80°C的温水再次漂洗I次后烘干即可。经检测，加入本发明制得的蜗牛酶后，处理纯棉纺织用品润湿时间由原来的30s提升至10s，百度值Wr由原有的55提升至78，效果极其显著。
[0014]实例2
首先用清水洗净两只重量均为35g新鲜活体野蛞蝓，将洗净的蛞蝓放入烧杯中，向烧杯中加入350mLpH7.5磷酸盐溶液，将烧杯中的物质倒入高速组织捣碎机中，以9000r/min的速度匀浆25min，充分粉碎得匀浆液，备用;然后量取250mL去离子水加入到单口烧瓶中，向单口烧瓶中加入2.5gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制温度为3°C，边搅拌边向烧瓶中加入150mL质量浓度为40%六氟磷酸溶液，搅拌反应2.5h，自然冷却至室温，分液，得有机相，用饱和碳酸钠洗涤有机相，直至有机相呈中性，再减压蒸馏，得到无色液体，即咪唑盐离子液体;接下来将上述咪唑盐离子液体和1.5g磷酸氢二钾加入到上述备用的匀浆液中，搅拌萃取45min，过滤，得滤液，将滤液静置分层，去上层，得到含有蜗牛酶的离子液体;之后向上述含有蜗牛酶的离子液体中加入350mLpH7.5磷酸盐溶液，搅拌55min，静置分层，分液得到含有蜗牛酶的磷酸盐溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入4g硫酸铵，搅拌15min，于3°C冰箱内，静置5.5h，用5000r/min离心机离心15min，得沉淀，将沉淀加入到盛有150mLpH7.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的烧杯中，搅拌15min后，装入透析袋中用去离子水透析73h，将保留液置于浓缩罐中浓缩3.5h，得到蜗牛酶液;最后将上述蜗牛酶液置于-13°C真空冷冻干燥器内，冻干25h，得到白色粉末，即蜗牛酶。
[0015]本实例操作简便，使用时，在本发明制得的蜗牛酶加入去离子水稀释10倍，之后将退浆后的纯棉纺织用品在83°C的温水中漂洗2次，洗后扎干，以7m/min的速度浸扎稀释后的蜗牛酶液，扎后在63°C蒸汽条件下堆置，并用83°C的温水再次漂洗2次后烘干即可。经检测，加入本发明制得的蜗牛酶后，处理纯棉纺织用品润湿时间由原来的31s提升至11s，百度值Wr由原有的55.5提升至79，效果极其显著。
[0016]实例3
首先用清水洗净两只重量均为40g新鲜活体野蛞蝓，将洗净的蛞蝓放入烧杯中，向烧杯中加入400mLpH7.6磷酸盐溶液，将烧杯中的物质倒入高速组织捣碎机中，以10000r/min的速度匀浆30min，充分粉碎得匀浆液，备用；然后量取300mL去离子水加入到单口烧瓶中，向单口烧瓶中加入3gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制温度为5°C，边搅拌边向烧瓶中加入200mL质量浓度为40%六氟磷酸溶液，搅拌反应3h，自然冷却至室温，分液，得有机相，用饱和碳酸钠洗涤有机相，直至有机相呈中性，再减压蒸馏，得到无色液体，即咪唑盐离子液体；接下来将上述咪唑盐离子液体和2g磷酸氢二钾加入到上述备用的匀浆液中，搅拌萃取50min，过滤，得滤液，将滤液静置分层，去上层，得到含有蜗牛酶的离子液体;之后向上述含有蜗牛酶的离子液体中加入400mLpH7.6磷酸盐溶液，搅拌60min，静置分层，分液得到含有蜗牛酶的磷酸盐溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入5g硫酸铵，搅拌20min，于4°C冰箱内，静置6h，用6000r/min离心机离心20min，得沉淀，将沉淀加入到盛有200mLpH7.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的烧杯中，搅拌20min后，装入透析袋中用去离子水透析74h，将保留液置于浓缩罐中浓缩4h，得到蜗牛酶液;最后将上述蜗牛酶液置于-15°C真空冷冻干燥器内，冻干26h，得到白色粉末，即蜗牛酶。
[0017]本实例操作简便，使用时，在本发明制得的蜗牛酶加入去离子水稀释10倍，之后将退浆后的纯棉纺织用品在85°C的温水中漂洗3次，洗后扎干，以8m/min的速度浸扎稀释后的蜗牛酶液，扎后在65°C蒸汽条件下堆置，并用85°C的温水再次漂洗3次后烘干即可。经检测，加入本发明制得的蜗牛酶后，处理纯棉纺织用品润湿时间由原来的32s提升至12s，百度值Wr由原有的56提升至80，效果极其显著。
【主权项】
1.一种从蛞蝓中提取蜗牛酶的方法，其特征在于具体提取步骤为: (1)用清水洗净两只重量均为30?40g新鲜活体野蛞蝓，将洗净的蛞蝓放入烧杯中，向烧杯中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸盐溶液，将烧杯中的物质倒入高速组织捣碎机中，以8000?10000r/min的速度匀浆20?30min，充分粉碎得匀浆液，备用； (2)量取200?300mL去离子水加入到单口烧瓶中，向单口烧瓶中加入2?3gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制温度为O?5°C，边搅拌边向烧瓶中加入100?200mL质量浓度为40%六氟磷酸溶液，搅拌反应2?3h，自然冷却至室温，分液，得有机相，用饱和碳酸钠洗涤有机相，直至有机相呈中性，再减压蒸馏，得到无色液体，即咪唑盐离子液体； (3)将上述咪唑盐离子液体和I?2g磷酸氢二钾加入到上述步骤(I)备用的匀浆液中，搅拌萃取40?50min，过滤，得滤液，将滤液静置分层，去上层，得到含有蜗牛酶的离子液体； (4)向上述含有蜗牛酶的离子液体中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸盐溶液，搅拌50?60min，静置分层，分液得到含有蜗牛酶的磷酸盐溶液，即粗酶液； (5)向上述粗酶液中加入3?5g硫酸钱，搅拌10?20min，于O?4°C冰箱内，静置5?6h，用4000?6000r/min离心机离心10?20min，得沉淀，将沉淀加入到盛有100?200mLpH7.4?.7.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的烧杯中，搅拌10?20min后，装入透析袋中用去离子水透析72?74h，将保留液置于浓缩罐中浓缩3?4h，得到蜗牛酶液； (6)将上述蜗牛酶液置于-10?-15°C真空冷冻干燥器内，冻干24?26h，得到白色粉末，即蜗牛酶。
【文档编号】C12N9/00GK105936894SQ201610477420
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】董晓, 张明, 孟浩影
【申请人】董晓