Smchd1在制备诊断冠心病产品中的应用
【专利摘要】本发明公开了SMCHD1基因及其编码蛋白可以作为冠心病诊断的分子标志物。通过检测受试者血液中SMCHD1基因及其表达产物的含量可以判断受试者是否患有冠心病或者诊断受试者是否存在患有冠心病的风险。本发明的研究成果为临床上提供了一种无创、特异、灵敏的冠心病诊断方法。
【专利说明】
SMCHD1在制备诊断冠心病产品中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及冠屯、病诊断、预测预后领域，更具体地，本发明设及W检测SMCHD1异常 为手段的冠屯、病诊断、预测预后方法。
【背景技术】
[0002] 冠状动脉粥样硬化性屯、脏病（简称冠屯、病），是屯、脏病中最常见的一种，屯、血管疾 病是全球导致病人死亡的重大疾病之一，在众多致死病因中居第二位，发病率约为319/ 100000。在中国由于缺乏标准的疾病登记和分类体系，所W无法得到很准确的中国人的流 行病学数据。自1980年开始，国内开始使用国际标准的登记系统。在2004年一年内的死亡人 数占到了城市人口死亡的9%，屯、血管疾病死亡人数的22% ;农村相应数据分别为4%和 13%。同年，有40万的冠屯、病病人死亡，65万的新诊断病例。世界范围内，每年将近250万的 病人死于冠屯、病相关疾病。随着统计数字的不断准确和城市化进程，中国的冠屯、病病人正 在越来越多。预计屯、血管疾病死亡人数到2020年会巧到所有死亡人的=分之一。问题越来 越严峻。
[0003] 冠屯、病的发病机制十分复杂，既有环境因素，也有遗传特征，、在众多前瞻性或回 顾性分析研究的基础上发现，在中国人中高血压、吸烟、肥胖(高胆固醇、和糖尿病与冠屯、病 相关性最高，运不仅仅是由于运几个因素是的危险因素，更为重要的是高血压、吸烟和超重 在中国现代化进程过程中国人由于生活方式改变带来的最重要的改变。在巳有的研究中已 经证实，脂类代谢异常、吸烟、糖尿病和高血压是的主要致病因素，在患者发病因素中约占 左右。此外，就是基因因素影响。近年来，分子诊断成为了研究热点，因为分子诊断可W在疾 病的早期即可对患者作为诊断或者为受试者提供患有冠屯、病的风险概率，W提醒有风险者 采取相应的措施预防冠屯、病的发生。因此，寻找一种新的特异性和灵敏性高的冠屯、病分子 诊断标志物是本发明的研究重点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测SMCHD1基因或蛋白表达差异来诊断冠 屯、病的方法。
[0005] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测SMCHD1基因或蛋白表达差异来预测冠 屯、病预后的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了检测SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的产品在制备冠屯、病诊断工具中的 用途。
[000引本发明还提供了检测SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的产品在制备预测冠屯、病预后工 具中的用途。
[0009] 进一步，所述检测SMC皿1基因或SMC皿1蛋白的产品包括检测SMC皿1基因或SMC皿1 蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合SMCHD1基因的核酸或者能够结合SMCHD1蛋 白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测s M C H D1基因的表达水平；所述物质能够检测 SMCHD1蛋白的表达水平。
[0010] 本发明的检测SMCHD1基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能： 如PCR、如Southern杂交、Nodhern杂交、点杂交、巧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、AS0法、 高通量测序平台等。使用该产品可W定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0011] 包含在上述产品中的核酸可W通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0012] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Ampl if ication RefractoiT Mutation System,扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增 的核酸可W通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特异性寡核巧酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可扩增片段长度多态性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (单链构象多态性)法来检测。
[0013] 上面所述的核酸包括扩增SMCHD1基因的引物，产品中包括的引物可W通过通过化 学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过 化学合成来制备。
[0014] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列)所示。
[0015] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可W通过化学合成来制备，通过使用本 领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可W通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。
[0016] 本发明的检测SMCHD1蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例 如，可W包括化ISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Wes tern印迹等。
[0017] 本发明的检测SMCHD1蛋白的产品包括特异性结合SMC皿1蛋白的抗体或其片段。可 W使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合祀蛋白质即 可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可W是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保 留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肤。抗体片段可W 包括F(ab/ )2、化1/、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区 (双抗体）、或含有CDR的肤。本发明的检测SMCHD1蛋白的产品可W包括编码抗体或编码抗体 片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0018] 抗体可W通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分祀 蛋白质的多肤或整合编码它们的多核巧酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免 疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞W获得杂交瘤。然后从杂交 瘤培养物收集抗体。最后可W通过使用被用作抗原的SMCHD1蛋白或其部分对获得的抗体实 施抗原特异性纯化来获得针对SMCHD1蛋白的单克隆抗体。可W如下制备多克隆抗体：用与 上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使 用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可W通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的 抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0019] 标记物与抗体或其片段的结合可W通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可 W如下巧光标记蛋白质或肤：用憐酸盐缓冲液清洗蛋白质或肤，添加用DMSO、缓冲剂、等准 备的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸 如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH (DojindoLaboratories);碱性憐酸酶标记试剂盒诸如碱性憐酸酶标记试剂盒-N肥、碱性憐 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories);巧光标记试剂盒诸如巧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte FluoHTM) 555标记试剂盒-N肥、HiLyte Fluo;r(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLi曲t 547和DyLi曲t647(Techno 化emical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluo;r(TM)抗体 标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒（Invitrogen Coloration)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(化nakoshi Co巧oration)。为了正确标记，可W使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。
[0020] 在本发明中，"预后"是指冠屯、病患者在通过手术处理等抑制或缓解冠屯、病后的过 程或结果。在本说明书中，预后可W是通过手术处理抑制或缓解冠屯、病后1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可^通过检查生物标志物即51(：皿1蛋白或编码 SMC皿1蛋白的基因来预测。预后预测可W运样进行:根据生物标志物的有或无，或者升高或 降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0021] 在本发明中，"预后良好"是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解冠屯、病之后， 患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。预后良好最优选的状态 是长期无疾病的存活。
[0022] 在本发明中，"预后不良"是指患者在通过手术处理等抑制或缓解冠屯、病后的短时 期(例如1、2、3、4、5年或更短）内发生致命状况。
[0023] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能W100%的准确度预测 患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增力日，而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本 发明而言，本发明中SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的水平升高或降低的患者中，与不显示该特 征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
[0024] 进一步，所述检测SM畑D1基因或SM畑D1蛋白的产品可W是检测SM畑D1基因或 SMCHD1蛋白的试剂、也可W是包含所述试剂的试剂盒、忍片、试纸等，也可W是使用所述试 剂的高通量测序平台。
[0025] 利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的表达 水平，与正常人相比，受试者样本中的SMCHD1基因或SMC皿1蛋白的表达水平升高，则诊断该 受试者为冠屯、病患者或该受试者的预后差。
[0026] 作为依照本发明的检测产品的样本，可W使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可W包括组织、血液、血浆、 血清、淋己液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材 料。
[0027]在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
[00%]本发明还提供了一种诊断冠屯、病的工具，所述工具能够检测受试者样本中SMC皿1 基因或SMCHD1蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合SMCHD1基因的核酸或者能够结合 SMCHD1蛋白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测SMCHD1基因的表达水平;所述物质能够 检测SMCHD1蛋白的表达水平。
[0029] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0030] 进一步，所述诊断冠屯、病的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量测序 平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断冠屯、病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一 个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表 达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SMCHD1基因的异 常与冠屯、病相关也属于SMCHD1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0031] 本发明还提供了一种预测冠屯、病预后的工具，所述工具能够检测受试者样本中 SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的表达水平，所述预测冠屯、病预后工具包括能够结合SMCHD1基 因的核酸或者能够结合SMCHD1蛋白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测SMCHD1基因的 mRNA水平;所述物质能够检测SMCHD1蛋白的表达水平。
[0032] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0033] 进一步，所述预测冠屯、病预后的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量 测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断冠屯、病的工具，随着高通量测序技术的发展， 对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基 因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SMC皿1基因 的异常与冠屯、病相关也属于SMCHD1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0034] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗SMCHD1抗体或其片段所识别的氨基酸的 数目没有特别限制，只要抗体能够结合SMCHD1即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能 够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制SMCHD1功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目 是至少一个，更优选至少S个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可W是1肖6、1肖1、1肖4、1姐、 I曲或I巧。
[0035] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗SMCHD1抗体的其他性质同前面所述。
[0036] 进一步，所述受试者样本可W使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样 本不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可W包括组织、血液、血浆、血清、淋己 液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明 的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
[0037] 本发明还提供了一种诊断冠屯、病或预测冠屯、病预后的方法，所述方法包括如下步 骤：
[0038] (1)获取冠屯、病受试者的样品；
[0039] (2)检测受试者样品中SMCHD1基因或蛋白的表达水平；
[0040] (3)将测得的SMCHD1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0041] (4)与对照相比，SMC皿1基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为冠屯、 病，或该受试者被确定为预后不良。
[0042] 在本发明的上下文中，"诊断冠屯、病"既包括判断受试者是否已经患有冠屯、病、也 包括判断受试者是否存在患有冠屯、病的风险。
[0043] 本发明的优点和有益效果：
[0044] 本发明的发现了一种诊断冠屯、病的分子标志物，使用该分子标志物可W在冠屯、病 发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0045] 另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。
【附图说明】
[0046] 图1显示利用基因忍片检测SMCHD1基因在冠屯、病患者与正常人中的表达情况；
[0047] 图2显示利用QPCR检测SMCHD1基因在冠屯、病患者与正常人中的表达情况；
[004引图3显示利用Western blot检测SMCHD1蛋白在冠屯、病患者与正常人中的表达情 况。
[0049] 具体的实施方式
[0050] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0051 ] 实施例1 SMCHD1基因的差异表达 [0化2] 1、研究对象：
[0053]收集冠屯、病患者5例，正常人5例。
[0化4] 冠屯、病组的纳入标准：按照世界卫生组织制定的缺血性屯、脏病的诊断标准，选择 经冠状动脉造影证实有一支或多支血管狭窄程度>50%的冠屯、病患者。对照组的入选标准 为：1)在流行病学调查时筛选年龄、性别、民族均与CAD组相匹配，经过问卷调查、体格检查、 屯、脏超声检查及屯、电图检查及相关实验室检查没有冠屯、病的临床表现及主要危险因素的 体检者;2)住院行健康体检并行冠状动脉造影检查排除冠屯、病并年龄、性别、民族与CAD组 匹配者;符合W上任何一条者入选为对照组。两组在纳入研究前签署知情同意书。
[0055] 剔除标准:CAD组-临床资料不全者及同时合并W下疾病之一者予W剔除。
[0056] (如:先天性屯、脏病者、主动脉夹层、多脏器功能衰竭、风湿性屯、脏病W及具有精神 障碍不能配合者）。对照组:有精神障碍者或经多普勒检查证实有颈动脉斑块或狭窄者，予 W剔除。
[0化7] 2、血液中总RNA的提取
[0化引（1)匀浆处理(Homogenization)
[0化9] 要求研究对象空腹至少12h，于次日清晨7:00~8:00室溫下，抽取10ml静脉血于乙 二胺四乙酸巧DTA)抗凝管，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室溫放置10分钟，10,0(K)rpm 离屯、1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-20化1血液收集的白细胞沉淀加入1ml T民IzoId
[0060] (2)分层（Phase Separation)
[0061] a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。
[0062] b.每1ml TRIzol加入200til氯仿，剧烈振荡纔匀后室温放置3-5min使其自然分相。
[0063] (3)RNA沉淀(RNA Precipitation)
[0064] 3.4°[12,000巧111离屯、10-151]1；[]1。样品会分成^层:黄色的有机相，中间层和无色的 水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取55化1)转移到新管中。
[0(?日]b .在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室溫放置10-20miru4°C 12，000巧m离屯、 lOmin，弃上清，RNA沉淀于管底。
[0066] (4)RNA漂洗(RNA Wash)
[0067] a.RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇（用RNase-打ee水配制），溫和振荡离屯、管，悬浮沉 淀。每1ml TRIzol加入1ml 75%乙醇。
[006引 b. 4°C5，000-8，000巧m离屯、l-2min，弃上清；短暂快速离屯、，用移液器小屯、吸弃上 清，室溫放置1-2分钟惊干沉淀。
[0069] (5)溶解RNA(Redissolving the RNA)
[0070] 沉淀中加入50-100iil RNase-打ee水，轻弹管壁，w充分溶解RNA，-70°C保存。
[oow 3、RNA质量和纯度检测
[0072] RNA质量:通过RNA完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：1.2%胶； 0.5 X TBE电泳缓冲液;150v，15分钟)检测完整性。
[0073] RNA纯度：0D260/0D280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA样品，0D260/0D280值（1 OmM Tri S，抑7.5)在2.0左右。
[0074] 4、测序:将上述RNA送交上海伯豪生物技术有限公司采用Solexa测序技术对样品 进行测序。
[00巧]5、数据分析
[0076] 5.1原始数据处理
[0077] 测序仪产生的原始图像数据经Base Calling转化为序列数据，我们称之为原始序 列数据，结果WFASTQ文件格式存储。由于原始序列数据可能包含低质量序列、接头序列等 杂质序列数据，不能直接用于生物信息分析，所W原始序列数据必需经过数据处理转换为 高质量序列数据，利用To曲at (version :2.0.6)软件的spliced mapping算法对高质量序列 数据进行基因组比对，采用基因组版本为SscrofalO.2。
[007引 5.2差异基因的筛选
[0079] 基因表达量的计算使FPKM法。根据基因的表达量(FPKM值)计算该基因在不同样本 间的差异表达倍数。差异表达基因定义为抑R《〇.01且倍数差异在2倍及W上的基因。
[0080] 6、结果
[0081 ] 结果显示(如图1所示），与正常人相比，冠屯、病患者血液中SMC皿1基因的mRNA水平 显著升高，差异具有统计学意义(P<〇.05)。
[0082] 实施例2 QPCR实验验证冠屯、病患者和正常人中差异表达的基因
[0083] 1、研究对象：
[0084] 筛选标准同实施例1，冠屯、病患者和正常人各50例。
[0085] 2、血液中总RNA的提取 [00化]步骤同实施例1。
[0087] 3、逆转录
[0088] 用逆转录缓冲液对liig总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25iU反应体系，每个样品 取1 iig总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入W下组分：DEPC水，5 X逆转录缓冲液， lOmmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30wiimol/l Oligo dT，200UAU M-MLV，模板RNAe42°C解育 化，72 °C 1 Omin，短暂离屯、。
[0089] 4、QPCR
[0090] (1)引物设计
[0091] 根据Genbank中SMCHDl基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0092] SMCHD1基因：
[0093] 正向引物为5'-ATTCATTGTCTGCTACTTCTC-3'（沈Q ID N0.3);
[0094] 反向引物为5'-TCCTCTTCCATTATCTATCACT-3'（沈Q ID N0.4),
[0095] GAro蜡因：
[0096] 正向引物为5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（沈Q ID N0.5);
[0097] 反向引物为5'-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3'（沈Q ID N0.6)。
[009引（2)按照表1配制PCR反应体系：
[0099] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0100] 表1 PCR反应体系
[0101]
[0102]
[0103] (3化〇?反应条件：951：5111111，（951：53,601：453)*45个循环。^5￥服0'6611作为巧 光标记物，在Li曲t切cler巧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定 目的条带，A A CT法进行相对定量。
[0104] 5、统计学方法
[0105] 结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统 计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0106] 6、结果
[0107] 结果如图2所示，与正常人相比，冠屯、病患者血液中SMCHD1基因的mRNA水平显著增 加，差异具有统计学意义(P<〇.05)，结果同基因忍片实验。
[0108] 实施例3 SMCHD1蛋白差异表达检测
[0109] 1、研究对象
[0110] 同实施例2。
[0111] 2、单核细胞分离
[0112] 无菌采集静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸 管加入等体积的皿SS(NaCl 8.0g，化2册〇4 0.132g，K此P〇4 0.06g，KCl 0.4g，酪红 1ml， 化肥化0.35g，D-葡萄糖1 .Og，溶于1000ml双蒸水），W降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋己细 胞分层液置50ml离屯、管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在 20°C2 00化/min离屯、30min，小屯、吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋己细胞 层，加入另一支离屯、管中，用5倍体积的皿SS洗涂2次，依次W2 00化/min、1 50化/min在室 溫下离屯、10min，W便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合Imin，使残 余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8 %化C1溶液，2 00化/min离屯、，去上清，经细胞计数后 用皿SS溶液调整细胞至1 X 106个/ml备用。
[0113] 3、单核细胞总蛋白质提取
[0114] 将上述实验所得细胞悬液(浓度为1X106个/ml)室溫1 0(K)r/min离屯、lOmin，弃上 清后加入10化1裂解缓冲液，4°C震荡化，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4°C12 00化/min离屯、化;取上清用化an壯ord法定量蛋白，分装成2.化g/jil，-80°C冰箱保存备用。
[0115] 4、Weste;rn blot检测
[0116] 将提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗解育、二抗解育、显 色。
[0117] 5、统计学处理
[0118] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，We-actin为内参，将目的白条 带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[0119] 6、结果
[0120] 结果如图3所示，与正常人相比，冠屯、病患者血液中SMCHD1蛋白含量高，差异具有 统计学意义(P<〇.〇5)。
[0121] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的产品在制备诊断冠心病或预测冠心病预后的工具 中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的产品 包括检测SMCHD1基因或SMCHD1蛋白的表达水平的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的SMCHD1 基因或SMCHD1蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的SMCHD1基因或SMCHD1蛋白 的表达水平升高，则诊断该受试者为冠心病患者或该受试者的预后差。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合SMCHD1 基因的核酸或者能够结合SMCHD 1蛋白的物质；所述核酸能够检测SMCHD 1基因的表达水平； 所述物质能够检测SMCHD1蛋白的表达水平。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增SMCHD1基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。7. -种诊断冠心病或预测冠心病预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受 试者样本中的SMCHD 1基因或SMCHD 1蛋白的表达水平的工具。8. 根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合SMCHD1基因的核酸 或者能够结合SMCHD1蛋白的物质；所述核酸能够检测SMCHD1基因的表达水平;所述物质能 够检测SMCHD1蛋白的表达水平。9. 根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增SMCHD1基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。10. 根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是血 液。
【文档编号】G01N33/68GK106048006SQ201610383238
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】杨承刚, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司