一种肺癌基因的检测方法及应用

一种肺癌基因的检测方法及应用
【专利摘要】本申请公开了一种肺癌基因的检测方法及应用。本申请的检测方法，包括对cfDNA进行文库构建，并采用针对肺癌相关的105个基因设计的12659条探针对cfDNA文库进行杂交捕获，上机测序，对测序结果进行数据分析，获得全面、准确的肺癌基因信息。本申请的检测方法，只需少量外周血即可进行，真正实现了无创检测。本申请的检测方法针对ctDNA中的肺癌重要基因进行捕获测序分析，在肺癌早期进行筛查，针对肺癌患者提供用药相关基因突变信息，为肺癌早期诊断、个体化精准用药指导、药效评估以及预后动态监测提供了重要的参考依据。
【专利说明】
-种肺癌基因的检测方法及应用
技术领域
[0001] 本申请设及基因检测领域，特别是设及一种肺癌相关基因的检测方法，及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦 称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速 上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿 瘤，5年生存率仅为16.8%，每年新确诊肺癌患者达到160万，肺癌同时也是癌症患者死亡的 首要病因，每年有140万的人口死于肺癌。2015年美国癌症协会（American Cancer Society，ACS)预计将有222，200新发肺癌病例，158，040人死于肺癌，约占美国所有癌症死 亡的27%。肺癌多在40岁W上发病，发病年龄高峰在60~79岁之间，男女患病率为2.3:1。另 外种族、家属史与吸烟对肺癌的发病均有影响。临床上对肺癌有一个简单的分法，将之分为 小细胞肺癌(缩写SCLC)W及非小细胞肺癌(缩写NS化C)。
[0003] 小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的15%，小细胞肺癌肿瘤细胞倍增时间短、 进展快，常伴内分泌异常或类癌综合征；由于患者早期即发生血行转移且对放化疗敏感，故 小细胞肺癌的治疗W全身化疗为主，联合放疗和手术进行综合治疗。综合治疗是治疗小细 胞肺癌成功的关键。非小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的85%。运两种类型的肺癌的 治疗方案是截然不同的。小细胞肺癌患者主要用化学疗法治疗，外科手术治疗对运种类型 肺癌患者并不起主要作用。但是，外科手术治疗对非小细胞肺癌患者来说确实一个很重要 的治疗手段。目前对于肺癌的检测包括X-射线扫描、CT、PET-CT、核磁共振、穿刺活检等，但 是大于70%的患者确诊时已处于癌症晚期。肿瘤的治疗效果与肿瘤的早期发现有很大的关 系，越早发现就越有可能治愈。因此研发一种为肺癌早期诊断提供参考信息的检测技术迫 在眉睫。
[0004] 《ASC0年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下 一个十年趋势之一。循环肿瘤DNA(ci;rculating Uimor DNA，缩写ctDNA)，作为液体活检的 首选已逐渐从科研走向临床。而欧盟批准将ctDNA检测用于易瑞沙的伴随诊断则更是标志 着ctDNA临床应用的大规模实现。循环肿瘤DNA指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的 DNA。由于其基本无创，并且能够获得肿瘤的所有突变信息，很好的解决了肿瘤异质性等问 题，因此是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于肿瘤发展及预后状态的无创检测。 血浆游离DNA(cell-打ee DNA，缩写cfDNA)在很早期就被发现，但是其在肿瘤方面的研究却 经历了漫长的过程。1948年，科学家第一次报告了人体血液中存在DNA循环；1977年，明确提 出癌症患者血液中的DNA循环。人们又花费17年时间指出，运些DNA出现了与癌症有关的突 变。但循环DNA的首次实际使用来自另一个领域。目前就职于中国香港中文大学的化学病理 学家Dennis Lo推断，如果肿瘤涌出携带DNA的血液，胎儿也能如此。1997年，他成功论证了 怀有男婴的孕妇血液中会携带Y染色体。运一发现使得医生可W在孕期初期不干扰胎儿的 前提下检查胎儿性别，并能不依靠侵入性试验筛查唐氏综合征等发育性疾病。运也成为妇 产诊断学领域的革命性成果。但是存在于外周血液中的游离DNA与癌症关系的理解十分缓 慢，部分原因是ctDNA比胎儿DNA更难探测。ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。对患 有晚期癌症的患者而言，外周血中ctDNA的含量相对较高；但一般而言，ctDNA仅占总数的 1 %，甚至少到0.01 %。随着肿瘤的疾病进展，CtDNA在血液中的含量也随之升高。因此，如果 在超早期就能对血液中含有的极微量的CtDNA进行捕获测序，为肿瘤早期诊断及相关突变 提供参考依据，那么对于癌症的早期发现将是革命性的进步。
[0005] CtDNA可能比蛋白质生物标识表现得更好。蛋白质被用于临床疾病诊断，并对正在 接受治疗的患者进行监控。例如，前列腺特异性抗原是前列腺肿瘤的生物标识，但它却会出 现假阳性结果，因为出于其他原因，如机体炎症、甚至饮食等，前列腺特异性抗原在血液中 的含量也会升高，导致假阳性结果。但CtDNA出现假阳性的几率更低，因为它是由具有癌细 胞印记的突变和其他遗传变化定义的。尽管大多数蛋白质生物标识能在血液中存在数周， 而CtDNA的半衰期不到两个小时，运增加了CtDNA检测难度。剑桥团队与约翰斯?霍普金斯 团队分别发现，在监测乳癌和肠癌时，与蛋白质生物标识相比，CtDNA更加敏感，并且在追踪 肿瘤消失、扩散和复发时，CtDNA也更准确。另外，完整的循环肿瘤细胞(缩写CTC)也会在血 流中移动，剑桥团队与约翰斯?霍普金斯团队还发现，CtDNA比CTC更敏感。在实验中，Diaz 研究小组发现，当CtDNA和CTC两者都存在时，CtDNA碎片在数量上要超过循环肿瘤细胞，两 者的数量比例大概是50:1。而化hns Hopkins的研究小组进一步发现，凡是血液里发现了 CTC的也能发现CtDNA，但是发现了 CtDNA的却不见得一定能发现CTC。
[0006] CtDNA检测很好的解决了肿瘤的异质性问题。2012年，化arles Swanton与同事在 英国癌症研究中屯、伦敦研究所从少量肾脏肿瘤组织中提取DNA，W期找到一些不同的变异， 但是单一肿瘤的遗传多样性的宽度让他们十分震惊。扩散到其他部位的继发性肿瘤又出现 了不同。然而CtDNA是来自于肿瘤细胞的碎片DNA，携带原位肿瘤和转移灶的基因变异信息。 CtDNA的检测技术很好的解决了肿瘤的异质性问题。
[0007] 传统的肺癌治疗方式包括外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可W 切除肿瘤，但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移，还可能造成器官损伤及身 体免疫力降低;化疗是一种全身性的治疗，效果明显和迅速，但是在杀伤肿瘤细胞的同时也 可能会把正常细胞一起杀灭，所W，化疗算得上是一种"玉石俱焚"的治疗方法;放疗在某些 肿瘤方面可W达到手术切除的效果，但放疗成本高，周期长，并发症也较多。祀向治疗作为 一种新兴治疗手段，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期W及生活质 量而得到广泛的应用。然而祀向药物的选择依赖于患者的基因分型，祀向药物往往有其对 应的祀基因，当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活，或者是 调控细胞调亡的信号通路被抑制，当使用相应的祀向药物之后，该通路被阻断，肿瘤细胞被 杀死。因此针对肺癌的祀基因 W及其驱动基因的检测技术的开发是应用祀向治疗的基础。 [000引现有的肿瘤基因检测方法主要包括PCR、一代测序、FISH、IHC等。运些方法基本上 都只能针对已知的基因突变信息进行检测，而且检测步骤繁琐，检测基因的数量少，且敏感 度低，况且针对FI甜W及1肥的检测结果还需要有经验的人进行鉴定。
[0009]综上所述，现有的肺癌检测方法存在如下缺陷与不足:第一，传统检测方法不能在 肺癌早期及早发现相关症状;第二，现有的基于肺癌基因的检测方法，通常要求比较高的建 库起始量，测序灵敏度和准确性都比较低；第S，市场上已有的用于肺癌基因检测的panel 囊括的基因不全面，针对肺癌相关基因的捕获非常少，会遗漏很多重要的基因突变信息，又 或者涵盖一些与肺癌不是很相关的基因，不能全面有效的反映肺癌及肺癌相关基因的突 变。

【发明内容】

[0010] 本申请的目的是提供一种肺癌基因的检测方法及其应用。
[0011] 为了实现上述目的，本申请采用了 W下技术方案：
[0012] 本申请的一方面公开了一种肺癌基因的检测方法，包括对血浆中cfDNA进行文库 构建，并采用针对肺癌相关的105个基因设计的12659条捕获探针对构建的cfDNA文库进行 杂交捕获，然后进行测序，并对测序结果进行数据分析，获得全面、准确的肺癌基因信息。 [OOU]本申请的检现[J方法，WctDNA为检测对象，能够实时的反映肺癌相关基因的突变情 况，检测只需要外周血液样品即可，真正实现了无创检测。并且，本申请的检测方法，针对肺 癌相关的105个基因设计了 12659条捕获探针，用于捕获CfDNA文库，能够准确而全面的获得 所有肺癌相关基因的全部信息。本申请中，肺癌相关基因包括与肺癌用药相关的祀标基因、 肺癌相关信号通路的祀标基因等，肺癌用药相关的祀标基因，主要是指影响肺癌治疗或控 制的药物使用的基因，运些基因的突变对用药的效果W及用药的选择都有影响。肺癌相关 基因虽然不是直接的肺癌组织突变的基因，但是，直接或间接的影响肺癌用药或疗效，可W 为肺癌用药或治疗药物、方法的选择提供可靠的分析依据。
[0014]需要说明的是，本申请的肺癌基因的检测方法，其检测结果，仅仅用于分析和判断 祀标基因的生物学信息，并为用药或治疗提供可靠的分析依据。本申请的检测方法可W对 受检对象的外周血中极其微量的ctDNA进行检测，从而为肺癌的早期治疗、个体化精准用药 指导W及预后动态监测等提供了可靠的分析依据。
[001引还需要说明的是，本申请中，C巧NA是指外周血中游离的DNA片段，运些片段包括 CtDNA，并且，如前面提到的，CtDNA在其中的含量很低，甚至少到0.01 % ;因此，本申请提出 了利用肺癌相关的105个基因的12659条捕获探针对CfDNA文库进行捕获，W保障能够有效 的获取极其微量的CtDNA。在本申请的一种优选方案中，还对CfDNA文库的构建进行了详细 限定，进一步保障CtDNA能够全面而有效的检测。
[0016] 优选的，针对CfDNA进行文库构建，具体包括，提取外周血中的CfDNA，并对提取的 rfDNA进行质量控制，测定其片段大小和浓度，依序对提取的CfDNA进行双链末端修复、样品 纯化、3'末端加 T、连接接头、PCR扩增富集，最后对PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化即 获得CfDNA文库;其中，接头中包含有PCR扩增富集的引物结合位点、索引序列;PCR扩增富集 中，PCR循环数根据cfDNA的建库起始量N而定，具体的，rfDNA建库起始量为小于或等于5ng， PCR循环数为11-12个循环，CfDNA建库起始量为5ng《N《 long，PCR循环数为9-11个循环， CfDNA建库起始量为10ng《N《25ng，PCR循环数为8-9个循环，cfDNA建库起始量为25ng《N 《50ng，PCR循环数为7-8个循环，CfDNA建库起始量为50叫《1^《100叫，？0?循环数为5-7个 循环，CfDNA建库起始量为100叫《1^《250叫，？〔时盾环数为3-5个循环，。巧魁建库起始量为 250雌《1^《500雌，？0?循环数为1-3个循环。
[0017] 需要说明的是，本申请的肺癌基因检测方法，其中一个关键步骤就在于CfDNA文库 的构建，CtDNA在外周血中的含量极低，特别是在肺癌初期，其含量甚至低至总DNA的 0.01 %，因此，如何构建DNA文库，w满足超微量ctDNA的检测，是直接影响检测效果和检测 质量的关键因素。本申请在接头中设计引物结合位点，采用PCR扩增富集，并针对不同的 rfDNA建库起始量，对PCR循环数进行优化，详见表1;本申请采用特殊设计的接头序列进行 rfDNA文库构建，并采用PCR扩增富集，能够有效的降低DNA的建库起始量，为肺癌的早期诊 断提供了重要的参考依据。
[001引表1 DNA的建库起始量与PCR循环数
[0019]
[0020] 还需要说明的是，本申请中双链末端修复、样品纯化W及3'末端加 T都可W参考常 规的方法进行，只是，本申请的优选方案中对其中个别步骤进行了特殊限定，运将在后续的 技术方案中详细介绍。
[0021 ]优选的，样品纯化W及PCR产物纯化都采用磁珠吸附法进行。
[0022] 优选的，肺癌相关的105个基因包括，17个肺癌祀向药物祀点基因、18个肺癌化疗 药物祀点基因、8个肺癌耐药基因、49个肺癌信号通路相关基因，W及13个DNA修复相关的基 因。
[0023] 需要说明的是，本申请的检测方法涵盖了所有肺癌相关的105个基因，运些基因包 括已明确临床应用的癌症祀向和化疗用药基因，处于癌症药物适用临床调查阶段的基因， 及所有已知的癌症驱动基因：如对于肺癌治疗，临床已经应用的祀向药物包括了吉非替尼、 厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、克挫替尼、色瑞替尼、曲妥珠单抗等，化疗药物包括顺销、卡 销、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、吉西他滨、依托泊巧、伊立替康、长春碱、丝裂霉素、异环 憐酷胺、培美曲塞等。而还处于临床实验的祀向药物包括阿斯利康的AZD9291、Clovis 化cology的CO-1686、勃林格殷格翰与韩美制药联合推出的歷61713、安斯泰来的ASP8273、 诺华的EGF816等。通过本申请的检测方法能够全面的了解肺癌及其用药相关基因的点突 变、基因重排、扩增、缺失、插入等信息。
[0024] 优选的，捕获探针的3'端具有生物素标记。
[0025] 需要说明的是，生物素标记可W与亲和链霉素的磁珠发生化学反应，从而将探针 W及与探针互补配对的祀标基因调取出来，达到基因捕获的目的。
[0026] 优选的，杂交捕获中，按照一份探针捕获10-12个ctDNA文库的用量添加捕获探针。
[0027] 需要说明的是，通常一份探针可W应用于16个DNA文库的基因捕获，但是，本申请 优选的，将一份探针应用于10-12个CtDNA文库的基因捕获，从而有效的保障基因捕获效率。
[0028] 优选的，在进行测序之前还包括对捕获产物进行PCR扩增，然后采用PCR扩增产物 进行测序，PCR扩增的循环数根据捕获区域的大小而定，具体的，捕获区域为l-499kb，循环 数为12-14个循环，捕获区域大于49化b，并小于或等于1.49Mb，循环数为9-11，捕获区域大 于1.49Mb，循环数为8-10。
[0029] 需要说明的是，为了保障测序质量，本申请在对cfDNA文库进行捕获后，还对其预 先进行了PCR扩增，W放大测序信号，提高检测质量。
[0030] 优选的，数据分析包括去除低质量数据、对数据进行剪裁，W及去除polyN误差信 息；去除低质量数据包括去除mapping质量为Q10的数据；对数据进行剪裁包括剪裁去掉 barcode数据，W及barcode后面7-lOnt，W及reads最后8-lOnt;去除polyN误差信息包括去 除数据中连续20个W上po lyN的数据。
[0031] 本申请的另一面还公开了本申请的检测方法在肺癌检测试剂盒或肺癌检测设备 中的应用。
[0032] 可W理解，本申请的检测方法就是针对肺癌基因设计的，因此，完全可W应用于各 种肺癌检测试剂盒或检测设备，获得实时、准确、全面的肺癌及相关基因的突变信息，从而 为肺癌用药等提供参考依据。
[0033] 本申请的另一面公开了一种肺癌基因检测的试剂盒，试剂盒中含有本申请的肺癌 及肺癌相关的105个基因的12659条捕获探针，并且，试剂盒采用本申请的检测方法对待测 样品进行检测。
[0034] 由于采用W上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0035] 本申请的肺癌基因检测方法，WctDNA为检测对象，并针对肺癌相关的105个基因 设计了 12659条捕获探针，能够全面、准确、实时的反映肺癌相关基因的变异情况。并且，W ctDNA为检测对象，只需要少量的外周血即可完成检测，真正实现了无创检测。本申请的检 测方法针对ctDNA中的肺癌重要基因进行捕获测序分析，在肺癌早期进行疾病筛查，针对肺 癌患者提供用药相关基因的突变等信息，为肺癌早期诊断、个体化精准用药指导、药效评估 W及预后动态监测提供了重要的参考依据。
【附图说明】
[0036] 图1是本申请实施例中提取的CfDNA的质控检测结果图；
[0037] 图2是本申请实施例中构建的CfDNA文库的质控检测结果图；
[0038] 图3是本申请实施例中CtDNA杂交文库的质控检测结果图；
[0039] 图4是本申请实施例中生物信息学分析的流程示意图；
[0040] 图5是本申请实施例中编号为LC2014112的肺癌样本的突变检测结果图；
[0041] 图6是本申请实施例中肺癌基因检测方法的操作流程示意图。
【具体实施方式】
[0042] 21世纪初，随着分子生物学研究的不断深入，可W根据各种分子标志物表达的不 同将NS化C进行分子表型分类，并W与肿瘤发生、发展相关的驱动性基因为祀点，研发新的 药物，进行有针对性的个体化分子祀向治疗。据美国国家综合癌症网(缩写NCCN)NSCLC临床 指南推荐，肺癌患者在使用EGFR-Tki之前应进行EGFR的基因检测，W选择获益人群。2012 年，NCCN NSCLC临床指南推荐，晚期NS化C患者开始治疗前应进行EML4-ALK检测，并建议阳 性患者首先接受克挫替尼治疗。约40%的ALK突变阳性NS化C患者对克挫替尼原发耐药。目 前市场上针对肺癌的基因检测主要是全基因组或者全外显子组检测，或者是针对特定一两 个基因的检测。运些检测手段都存在很多弊端，例如：全基因组或者全外显子组检测，虽然 检测内容丰富，但是成本高，而且检测出来的绝大多数信息与肺癌无关;针对特定一两个基 因的检测，检测信息相当有限。因此迫切需要针对肺癌相关基因进行全面的检测，W获得更 加准确而全面的基因突变信息。
[0043] 本申请正是在运样的基础上，针对目前市场上的肺癌检测方法存在的不足或缺 陷，创造性的提出了一种实时、无创、精准、全面的肺癌基因的检测方法。本申请的检测方法 W外周血中极其微量的ctDNA为检测对象，与传统的通过手术提取病变组织进行检测的方 法相比，不仅实现了真正的无创检测，而且在本申请的一种实现方式中，通过优化cfDNA文 库构建，使得检测方法所需建库起始量低、灵敏度高、准确性好。
[0044] 并且，本申请的检测方法，涵盖了目前已明确临床应用的肺癌祀向和化疗用药基 因，处于癌症药物适用临床调查阶段的基因，W及所有已知的肺癌驱动基因，共计105个基 因，针对运105个基因设计了 12659条捕获探针。可检测所有肺癌相关基因的突变类型，包括 点突变、插入/缺失、基因融合和拷贝数变化等;使得检测结果精准而全面，为用药及预后动 态监测提供了可靠的分析依据。
[0045] 本申请WctDNA为检测对象，ctDNA的检测存在很多技术上的壁垒，不仅因为ctDNA 在血液中的含量很低，而且其半衰期很短，所W难W捕获。虽然运增加了 ctDNA的检测难度， 但是，本申请通过对CfDNA文库构建，捕获探针设计，W及杂交捕获等进行优化，克服了运些 技术问题;其半衰期短反而能够实时的反映肺癌的变化情况。
[0046] 本申请的肺癌基因的检测方法，全面、系统、准确地解读肿瘤药物与基因的关系， 可为癌症祀向用药、生物免疫治疗及化疗用药提供关键的祀标突变位点信息，并可根据患 者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，延长患者生存时 间，提高生活质量。本申请的肺癌基因检测方法也能为癌症的早期筛查提供重要的参考依 据。本申请的一种实现方式中，测序深度能达到l〇,〇〇〇xW上，测序的灵敏度能达到0.1%。
[0047] 本申请的肺癌基因检测方法针对肺癌患者或者高危人群进行无创基因检测，为肺 癌的早期筛查与肺癌患者的个体化精准用药指导W及预后动态监测提供重要的参考依据。 在目前市场上针对肺癌相关基因设计探针的产品非常少，而且也存在很多缺陷的情况下， 本申请提出了基于ctDNA的肺癌相关基因的检测方法，能够捕获超微量的ctDNA、平行扩增， 并且，能且仅能够对肺癌相关基因进行特异性捕获，运样在尽可能减少成本的基础上获得 最有效的信息;检测灵敏度可达到0.1%，解决了 CtDNA含量低、检测难的问题。
[0048] 本申请中设及的名词解释如下：
[0049] 捕获探针，是指针对肺癌相关的105个基因的不同位点设计的12659条短核巧酸序 列，运12659条捕获探针确保了 105个基因能够被全面、准确的捕获，不遗漏，也没有其它基 因的干扰，保障了检测的全面、精准。
[0050] 杂交捕获，是指利用捕获探针对CtDNA进行基因捕获，将血浆游离DNA中包含的105 个基因分离出来的过程。
[0051] PCR扩增富集，是指利用PCR扩增的方法，对外周血中提取的极其微量的rfDNA进行 扩增。
[0052] 下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。W下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0053] 实施例
[0054] 本例的检测方法主要包括，从血液中提取游离循环DNA、构建cfDNA文库，利用设计 的肺癌相关基因的捕获探针进行目标区域的捕获、上机测序，最后利用生物信息学进行大 数据分析，获得肺癌相关基因的变异信息，如图6所示。
[0055] 本例的检测方法主要由=部分组成，其中提出了一种实时、无创、精准、全面的肺 癌CfDNA检测技术解决方案。
[0056] 第一部分，rfDNA的提取、纯化、文库构建。
[0057] 第二部分，ctDNA肺癌相关基因的特异性捕获。
[005引第S部分，CtDNA肺癌基因测序深度10，000xW上的超高深度测序分析，检测出与 肺癌发生发展相关的基因变异信息，配合临床指导用药、预后监测。
[0化9] 第一部分CfDNA文库的构建
[0060] 外周血中的CtDNA含量很低，比例约为1/1000,因此保证血浆CfDNA提取质量至关 重要。本例W来自深圳市人民医院的编号为LC2014112的肺癌样本为例，rfDNA提取方案详 细步骤如下：
[0061 ] 1.外周血CfDNA的提取纯化，通常采用5~lOmL全血，本例具体采用5mL全血进行试 验，在获得血液的化内分离血浆，将全血4 °C 1600g离屯、1 Omin，收集上清至5mL离屯、管中；再 将上清4°C16000g离屯、lOmin，收集上清血浆转移至5mL离屯、管中。分离好的血浆最好是立即 提取DNA，运样是为了保证血浆中DNA的完整性。提取血浆中游离DNA的试剂盒有很多种，如： QIAGEN公司的血浆/血清游离DNA提取试剂盒、厦口艾德公司的血浆游离DNA提取试剂盒、天 根的血浆/血清游离DNA提取试剂盒等。本例具体采用QIAGEN公司的血浆/血清游离DNA提取 试剂盒进行试验，提取步骤参考试剂盒说明书。
[0062] 需要说明的是，如果分离好的血浆不能立即提取DNA也可W放置在-80°C冰箱保 存，W后再提取DNA。
[0063] 2.CfDNA质控，采用Agilent 2100检测提取的CfDNA的片段大小，采用q-PCR测定提 取的CfDNA的浓度。
[0064] 结果显示，LC2014112样本采用5mL全血，最后提取获得的CfDNA浓度为O.Sng/iiL; 提取的CfDNA的片段大小如图1所示，在166bp左右有一个大峰，332bp左右有一个小峰，可 见，样本完整性较好，而且没有基因组DNA污染。
[00化]3.文库构建
[0066] C巧NA文库的构建可W采用市面上多种产品实现，例如：KAPA HTP Libra巧 Preparation Kitlllumina液platfo;rms、NEKNext.?Ultra? dm Libraiy Prep Kit for Tl'l'mn'in'a敏、SureSe 1 ectXT2 Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library，W及深圳市海普洛斯生物科技有限公司的发明专利CU肥-CtDNA Seq 中的建库方法等。
[0067] WLC2014112样本为例，采用Agilent的建库方法（SureSelectXT2 Target Enrichment System for Illumin曰 P曰ired-End Sequencing Libr曰ry)，在有些步骤做了 相应的改进与优化，取5ng rfDNA起始进行建库，具体操作如下：
[006引 （1) CfDNA双链末端修复
[0069] 用nuclease-free water将5ng cfDNA定容至50化，将定容后的50化cfDNA全部加 入表2的反应体系，混匀之后放置在PCR仪上20°C反应30min。
[0070] 表2 ctDNA双链末端修复反应体系
[0071] _
[007^ (2)纯化
[0073 ] 本例采用磁珠法对末端修复的cf DNA进行纯化。具体可W采用的磁珠包括:AMPure XP磁珠、OMEGA磁珠等。C巧NA与磁珠的解育时间为10-15min，在解育过程中每5min溫和混 匀，使得DNA充分与磁珠结合，并使用80 %的新鲜乙醇清洗磁珠，使得小片段的DNA也能够结 合到磁珠上，而不是被乙醇洗去。具体操作如下：
[0074] 7化L rfDNA反应体系中加入12化L的OMEGA磁珠，混匀之后，室溫解育15min，在解 育过程中每5min溫和混匀。15min之后将装有DNAW及磁珠的离屯、管放到磁力架上，室溫静 置3~5min，等磁珠完全吸附到磁力架上之后，吸去上清，加入50化L 80 %的新鲜乙醇，溫和 的上下颠倒磁力架7~10下，然后室溫静置3min左右，吸去上清，重复用乙醇洗涂一次。尽可 能的将所有液体吸取干净，将离屯、管管盖打开，将离屯、管放置在37°C金属浴上惊干，W磁珠 表面没有光泽为止。向磁珠中加入22化nuclease-打ee water,充分重悬磁珠，然后室溫放 置5min左右，使得cf DNA充分溶解于水中。将离屯、管放置到磁力架上，室溫放置5min，将上清 转移至新的PCR管中，即获得纯化的末端修复的cfDNA。
[0075] (3)DNA的 3'末端加 dTTP
[0076] 向步骤（2)中得到的上清中加入20化dT-化iling Master Mix,混匀后将反应体 系放置在PCR仪上，先37°C反应30min，使所有DNA 3'末端加 T，然后60°C反应lOmin使酶失 活。
[0077] (4)adapter 制备
[0078] 本例的adapter采用的是深圳市海普洛斯生物科技有限公司自主发明专利〇]肥- ctDNA Seq中的adaptereadapter从5'端到3'端依序包括hg序列、PolyN序列、发夹序列、第 一索引序列、第一通用引物结合序列、加 TP、第二通用引物结合序列和发夹序列;其中，接头 的5 '端具有憐酸化标记。运种adapter在退火之后通过前后两个发夹序列形成发夹结构，然 后进行一端的延伸，使得两端平齐，但是DNA聚合酶会在延伸DNA的3'端引入一个dATP。运种 特定的adapter能够使得每一个DNA都带上不同的标签，实现单分子标记。具体的，本例设计 的adapter具体为Seq ID No. 1所示序列。
[0079] Seq ID No. 1:
[0080] 5'-P-ACTGNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXTAGAGCAT ACGGCAGAAGACGAACUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT- 3'。
[0081 ] Seq ID No. 1所示序列adapter序列中，由5'端开始，P为憐酸化标记，"ACTG"为化邑 序列，"NNNNNNNNNNNN"为PolyN序列，PolyN序列中N为随机序列， "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC' 为发夹序列/'XXXXXf ' 为第一索引序列，同样的X 表示随机序列，即第一索引序列为随机生成的6bp的序列，叮AGAGCATACGGCAGAAGACGAAC'为 第一通用引物结合序列/'If为dUTP /'AATGATACGGCGACCACCGA护为第二通用引物结合序列， "ATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCr为发夹序列，前后两个发夹序列在退火时形 成发夹结构。本例的adapter序列由1 if e techno logy公司合成。
[0082] (5)DNA 两端连接 adapter
[0083] 向步骤(3)的反应体系中加入扣L Ligation Master MixW及适量的l〇5nm〇l/L的 adapter,最后加入nuclease-free water使总体积为50化。将此反应体系放置在PCR仪上20 °C反应15min。本例经过大量的试验和研究提出，对于5~50ng起始建库DNA量可W加入0.01 ~0.05nmol的adapter,而如果起始量为50~150ng可W加入0.1 nmol的adapter,起始量为 150~250ng可W加入0.化mol的adapter。Adapter的量太高会影响文库扩增W及目标基因 的捕获，adapter的量太低则会影响建库效率。起始DNA:adapter = l: 15~1:20为最佳。
[0084] 具体到本例，WLC2014112样本为例，该样本的rfDNA建库起始DNA含量为5ng，因 此，加入0. 〇1化adapter，adapte;r序列配合Illunima测序平台。本专利多Wlllunima测序 平台示例，不适合于R〇che/454、Life Technologies/lon Proton?等测序平台。
[00化]待测DNA两端连接的单端barcode的adapter序列为Seq ID No. 1所示序列，本例具 体合成的adapter序列中，第一索引序列具体为"ATCACG"。
[0086] 在PCR仪上20°C反应15min后，用磁珠纯化，W除去没有连接至化NA上的adapted及 酶等杂质。具体操作同cfDNA双链末端修复后的纯化，并用80%的乙醇洗涂两次。最后用25y L nuclease-打ee water重悬磁珠，静置5min后放置在磁力架上静置3~5min，然后将上清 转移至新的PCR管中，即获得连接好接头的cfDNA。在PCR扩增之前用USER酶(肥B公司）将 adapter中的U切除，从而形成双链DNA 1 ibrary。具体操作过程见产品说明书
[0087] (5)PCR扩增富集
[0088] 在步骤(4)得到的约24化上清中加入扩增体系，具体配方见表3,混匀之后，将反应 体系放置在PCR仪上，具体反应程序见表4。
[0089] 表3 PCR扩增富集反应体系
[0090]
[0093] 需要说明的是，PCR扩增富集中，PCR循环数根据cfDNA的建库起始量而定的，rfDNA 的建库起始量与PCR循环数的关系如表1所示，本例中建库起始量为5ng，因此，PCR循环数为 12个循环。PCR扩增富集完成即获得本例的rfDNA文库。
[0094] (6)cfDNA 文库纯化
[00M]向PCR扩增富集产物中加入50化磁珠进行纯化，具体操作同cfDNA双链末端修复后 的纯化。最后用25化nuclease-打ee water重悬磁珠，静置5min后放置在磁力架上静置3~ 5min，然后将上清转移至新的1.5mL EP管中，即本例的纯化后的cfDNA文库。
[0096] (7)rfDNA文库质量的鉴定
[0097] 对cfDNA文库进行质检，包括，采用life technology公司的Qubit或者是q-PCR测 定CfDNA浓度，采用Agilent 2100鉴定片段大小。
[009引结果显示，本例的LC2014112样本构建的CfDNA文库的浓度为32ng/iiL，共25化。 rfDNA文库的片段大小如图2所示。根据之前图1所示结果，我们知道提取得到的CfDNA的片 段大小在166bp左右有一个大峰，332bp左右有一个小峰;而CfDNA文库中的DNA是在CfDNA的 基础上两端加上adapter，两端adapter的区域长度加起来是138bp，因此构建文库之后的 rfDNA文库的片段应该在30化P左右有一个大峰而在47化P左右有一个小峰，如图2所示。
[0099] 第二部分ctDNA肺癌及肺癌相关基因的特异性捕获
[0100] 本例的肺癌panel主要基于W下几个方面考虑：
[0101] i.针对多个癌症相关信号通路作为祀点，如EGFR是一个由486个氨基酸组成的受 体蛋白，属于受体酪氨酸激酶家族，可触发一系列信号通路，导致细胞生长、增殖及存活。运 类通路包括RAS-RAF-MEK-E服通路及PI3K-AKT-mT0R通路。因此EGFR是一个大有潜力的转化 治疗祀点。目前还没有可靠的临床表现或特征可W准确预测EGFR突变，因此所有肿瘤均应 进行突变检查。
[0102] ii.基因的耐药突变导致药物疗效差W及相应解决方案：例如：接受第一代EGFR TKI治疗的患者中，有50%的患者在10个月左右后通常会出现耐药现象，运种耐药机制的产 生很大比例是发生了EGFR T790M突变，而目前针对该位点研发的药物主要有阿斯利康的 AZD9291、Clovis Oncology的C0-1686W及勃林格殷格翰与韩美制药联合推出的HM61713。
[0103] iii.收录已明确临床应用的癌症祀向和化疗用药基因，处于癌症药物适用临床调 查阶段的基因，及所有已知的癌症驱动基因，如对于肺癌治疗，临床已经应用的祀向药物包 括了吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、克挫替尼、色瑞替尼、曲妥珠单抗等，化疗药 物包括顺销，卡销，紫杉醇，多西紫杉醇，长春瑞滨，吉西他滨，依托泊巧，伊立替康，长春碱， 丝裂霉素，异环憐酷胺，培美曲塞等。而还处于临床实验的祀向药物包括阿斯利康的 AZD9291、Clovis Oncology的C0-1686、勃林格殷格翰与韩美制药联合推出的HM61713、安斯 泰来的ASP8273、诺华的EGF816等。
[0104] iv.结合多个数据库，包括COSMIC、TCGA、DrugBank、NCCN、I?armGKB、HGMD、CGAP/ Mitelman、0MIM、NIH、KEGG等，用W分析基因的重要性。其中，TCGA是目前最大的癌症基因信 息的数据库。
[0105] V.紧密结合临床研究热点，包括在2015年ASC0W及CSC0等大型会议上都提到的肺 癌研究的S大热点，第一，ALK、RET、R0S1等融合基因的研究。目前至少发现了 14种EML4-ALK 变体。几乎所有研究均显示EML4-ALK融合基因主要存在于NS化C中，其出现频率为5%- 10% dROSI基因重排代表一类新的独特的NS化C分子亚型，其发生频率为1 %-2% dRET融合 基因主要在肺腺癌中出现，约占亚裔与非亚裔肺腺癌的1 %~2 %。第二，MET 14exon skipping,之前针对c-MET的研究主要是对其扩增的研究，而现今MET的14号外显子剪接突 变可能成为一类新的NS化C的亚型，并且克挫替尼对运类突变患者有效。第S，肺癌的免疫 治疗，目前针对免疫检查点的治疗药物主要有默克的Keパruda(pembrolizumab)，即MK- 3475。该药物于2014年9月4日获抑A批准，成为抑A批准的第一个PD-l抗体巧时美施贵宝的 Opdivo(Nivolumab，BMS-936559)，PD-l 抗体。罗氏的 MPDL3280A。该药物为 PD-L1 抗体。阿斯 利康的MEDI4736，PD-L1抗体。
[0106] Vi.多种变异信息检测分析，包括点突变、基因重排、扩增、缺失、插入等;如在肺癌 中常见的EGFR突变、ALK重排、皿R2突变、BRAF突变、MET扩增、R0S1重排、RET重排、KRAS突变 等。
[0107] 基于W上六个方面的考虑，本例的肺癌特异性捕获的祀向基因中包括了 17个祀向 药物祀点基因，18个化疗药物祀点基因，8个耐药基因，49个信号通路相关基因，W及13个 DNA修复相关的基因，共计105个基因。选取运105个基因的全部外显子W及部分内含子区域 并且在区域两端延伸lObp，W获取个别重要的剪接突变信息，如:C-MET的14exon skipping 可能成为非小细胞肺癌的一种新亚型。本例针对运105个基因的各个位点设计了 12659条捕 获探针。本例设计的探针分别在Agilent、Roche公司合成。运105个基因的12659条捕获探针 在一个单管中，因此一次杂交反应即可捕获运105个基因。WEGFR为例，文献报道在肺癌中 运个基因的突变主要发生在18、19、2〇W及21号外显子区域，但是为了发现一些新的变异信 息，本例针对EGFR的所有外显子都设计了捕获探针。EGFR 18号外显子的序列如Seq ID No.2所示，针对EGFR 18号外显子设计了两条捕获探针，两条捕获探针的序列分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列。
[010引 Seq ID No.2：
[0109] 5'-C TTGTGGAGCC TCTTACACCC AGTGGAGAAG CTCCCAACCA AGCTCTCTTG AGGATCTTGA AGGAAACTGA ATTCAAAAAG ATCAAAGTGC TGGGCTCCGG TGCGTTCGGC ACGGTGTATA AG-3'
[0110] Seq ID No.3：
[0111] 5'-GAACACCTCGG AGAATGTGGG TCACCTCTTC GAGGGTTGGT TCGAGAGAAC TCCTAGAACT TCCTTTGACT-biotin-3'
[0112] Seq ID No.4：
[0113] 日'-TCCTAGAACT TCCTTTGACT TAAGTTTTTC TAGTTTCACG ACCCGAGGCC ACGCAAGCCG TGCCACATAT TC-biotin-3'
[0114] 捕获探针与目的基因序列是互补的，并且在捕获探针的3'端有biotin标记，运样 用亲和链霉素的磁珠，利用亲和链霉素与biotin的化学反应，就能将与探针互补配对的目 的基因调取出来，从而实现目的基因的捕获。
[0115] 本例的105个基因捕获方案可W采用多种平台实现，例如Agilent公司的 SureSelect XT/XT2Target Enrichment System、Roche公司的Nimblegen SeqCap EZ L化ra巧等。具体的，本例W肺癌样本LC2014112的cfDNA文库进行试验，采用Agilent公司的 SureSelect XTSl'ai'get Enrichment System捕获试剂进行杂交捕获，具体操作如下：
[0116] UrfDNA文库与捕获探针的杂交，Agilent公司建议对于XT2捕获试剂盒，一个探针 应用于16个DM文库的基因捕获，但是本例经过大量的试验和研究认为，一个探针应用于10 ~12个DNA文库的基因捕获的效率会比较好，因为文库间的竞争关系没有那么强烈。一个探 针对应于1.化g的文库DNA，运1.化g平均分配到10~12个文库中，每个文库的用量是150ng ~125ng。然后将运10~12个文库混合到一个离屯、管中，然后放置在金属浴上蒸干，本专利 推荐金属浴的溫度可^使用45~60°[。然后加入7化的1111(316日36-打66￥日161'^及9化 SureSelect XT2Blocking Mix,充分混匀，本例是溫和混匀一分钟之后37°C解育5min，重复 此操作S次，使得粘附在离屯、管壁上的DNA充分溶解，将此溶液转移至PCR管中，95 °C变性 5min，然后65°CHold。然后加入用RNase inhibitor配置的探针W及37化SureSelect XT2Hyb;ridization 6证'61'。运个操作是在65°[的？〔1?仪上操作，因此需要用带滤忍的枪头 来完成。混匀之后65°C杂交24~36h。
[0117] 2、洗脱，W去除未被探针识别的ctDNAW及一些非特异性结合的DM。采用亲和链 霉素标记的磁珠，因为探针是biotin标记的，biotin能与亲和链霉素发生亲和反应。取50化 磁珠，加入200化SureSelect XT2Binding Buffer,溫和的上下颠倒混匀，放置在磁力架 上，静置3~5min后吸去上清，然后重复上述操作2遍，最后用20化L Binding Buffer重悬磁 珠。将杂交后的反应液转移至此磁珠中，然后放置在混悬仪上，室溫混匀30min。将离屯、管放 置在磁力架上，静置3~5min后吸去上清，加入200化SureSelect XT2Wash Bufferl，洗涂 磁珠一遍。然后用事先65°C溫浴的SureSelectXT2WashBuffer2洗涂6遍，每次加完Wash Buffer2重悬磁珠之后都65°C解育5min。最后磁珠用30化nuclease-free water重悬磁珠， 静置5min后放置在磁力架上静置3~5min，然后将上清转移至新的1.5mL EP管中，分成两管 做 PCR。
[0118] 3、捕获后的DNA扩增，按照表5配置PCR扩增反应体系配制反应液，向反应液中加入 1化L杂交捕获、洗脱的产物即捕获的ctDNA，进行PCR扩增反应，反应程序见表6。
[0119] 表5 PCR反应体系 「/"H
[0123]表6中，PCR扩增的循环数根据捕获区域的大小而定，捕获的区域越大，PCR的循环 数约少，循环数与捕获区域的大小关系如表7所示。本例的肺癌panel大小为0.7M，因此PCR 循环数采用10个循环。
[0124]表7 PCR循环数与捕获区域大小 r01951
[01%] 4、ctDNA杂交文库质量的鉴定，包括，采用life technology公司的Qubit测定 ctDNA杂交文库的浓度，采用Agilent 2100鉴定片段大小。本例的ctDNA杂交文库即从cfDNA 文库中捕获的ctDNA进行洗脱、PCR扩增，获得的PCR扩增产物，该ctDNA杂交文库直接用于后 续测序。
[0127] 质检的结果显示，LC2014112样本血浆cfDNA libraiT与肺癌panel杂交之后的浓 度为24ngAiL，共25化。CtDNA杂交文库的片段大小如图3所示，可见片段大小主要集中在 300bp左右。根据分析，由于杂交过程中探针对短目的片段的一定偏好性，使得杂交后PCR产 物大小主要集中在3(K)bp左右，因此，图3所示结果符合理论要求。
[01%] 5、ctDNA杂交文库稀释变性，采用illumina的操作手册，最后上机测序。采用 illumina Nextseq 500 2*75测序试剂盒进行测序，本例中，每个样本的测序深度达到10， OOOxW上。例如CtDNA: rfDNA= 1:1000,那么我们的测序深度也能检测到运个突变10次。因 此，可W检测低含量的CtDNA。
[0129] 第=部分，测序数据的生物信息学分析，采用深圳市海普洛斯生物科技有限公司 研发的自动化分析流程，如图4所示，具体包括：
[0130] 1、首先进行base cal ling过程，提取碱基信息。
[0131] 2、然后进行数据质量控制过程，包括去除低质量数据，对数据进行剪裁，去除 polyX等误差信息;所述数据质量控制包括，去除低质量数据通常去除mapping质量为Q10的 数据，对数据进行剪裁去掉barcode的数据，W及barcode后面的7~lOnt, W及reads最后的 8~lOnt，去除polyN误差信息如果数据中有连续20个W上ployN就直接去掉运样的数据。
[0132] 3、进行数据比对，去重，错误校正等操作，例如:运用BWA，PICARD，GATK等算法进行 数据处理。
[0133] 4、获取变异信息，基因型信息，SNP和IN呢L等，变异信息会进一步地进行校正和过 滤，W获得更高质量的变异信息；例如：GATK Realigner Target Creato;r，GATK Indel Reali即er,GATK Base Recalibrator,GATK 化plotypeCaller等算法进行突变信息的分 析。
[0134] 5、变异信息注释，分析，包括蛋白序列变化分析，蛋白功能预测和注释等等；
[0135] 6、在获得W上注释结果后，结合数据库进行变异和注释信息的解读，并生成解读 报告，由专人进行审核和复核；
[0136] 7、将报告交予医生或者相关的单位，由其根据报告和患者本身的信息进行诊断和 指导；
[0137] 8、通过医生对患者信息的反馈和追踪，将患者相关的特征信息加入数据库，进行 机器学习；
[0138] 9,原始数据、重要的中间数据、报告信息W及知识库都永久存储。具体见图4。
[0139] 本例对肺癌病人LC2014112样本的ctDNA进行捕获，建库起始量为5ng，检测结果显 示，最后发现运个患者EGFR 20号外显子发生了T790M的EGFR-Tki耐药突变，突变率为 0.208%，突变检测结果见图5。结果显示，在7号染色体的油的:55249071位置，本身是碱基 C，而患者中运个位点存在C突变成T，在蛋白水平表现为T790M突变，即一代EGFR-TKi耐药。 患者在此次基因检测之前已经服用一代EGFR-TKi易瑞沙9个月，并出现疾病进展，通过检测 结果，建议该病人换用S代EGFR-TKi(AZD9291、C0-1686、HM61713)，该患者服用AZD9291 - 个月后，影像学资料显示肿瘤明显缩小。可见，通过本例的检测，能够为患者提供准确的用 药f目息，提局治疗效果。
[0140] 本例的肺癌基因检测方法，WctDNA为检测对象，具有灵敏度高的优势，可W从微 量的rfDNA中检测出CtDNA，CtDNA在10化gW上都可W进行检测。采用本例的肺癌基因检测 方法，抽取5-lOmL外周血液，通过对CtDNA的测序分析，动态评估癌症发展变化，制定精准医 疗方案，整个检测过程无创伤，对病患没有任何负面影响;并且，本例的检测方法，可W全面 的检测出祀向及化疗药物直接作用祀点基因、祀点相关信号通路基因、DNA损伤修复基因、 表观遗传学基因 W及其它高频突变基因，运为个体化精准用药指导提供了重要的参考依 据。本例的检测方法，结合国际领先的基因捕获技术，检测血液CtDNA的变异情况，具有10， OOOxW上的测序深度，测序的灵敏度能达到0.1 %;并且，能够检测点突变、插入缺失、基因 融合，基因拷贝数变化等基因变异信息，给出最精准的用药指导信息。
[0141] W上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申 请的具体实施只局限于运些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本申请构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护 范围。
【主权项】
1. 一种肺癌基因的检测方法，其特征在于:对cfDNA进行文库构建，并采用针对肺癌相 关的105个基因设计的12659条探针对cfDNA文库进行杂交捕获，上机测序，对测序结果进行 数据分析，获得全面、准确的肺癌基因信息。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述对cfDNA进行文库构建，具体包 括，提取外周血中的cfDNA，并对提取的cfDNA进行质量控制，测定其片段大小和浓度，依序 对提取的cfDNA进行双链末端修复、样品纯化、3 '末端加 T、连接接头、PCR扩增富集，最后对 所述PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化即获得cfDNA文库;其中，所述接头中包含有PCR 扩增富集的引物结合位点、索引序列;所述PCR扩增富集中，PCR循环数根据cfDNA的建库起 始量N而定，具体的，cfDNA建库起始量5ng时，PCR循环数为11-12个循环，cfDNA建库起始 量为5ng<N< 10ng时，PCR循环数为9-11个循环，cfDNA建库起始量为10ng<N<25ng时，PCR 循环数为8-9个循环，cfDNA建库起始量为25ng<N<50ng，PCR循环数为7-8个循环，cfDNA建 库起始量为5〇1^<~彡100叫，？0?循环数为5-7个循环，〇仰财建库起始量为100叫<~彡 250ng，PCR循环数为3-5个循环，cfDNA建库起始量为250ng<N<500ng，PCR循环数为1-3个 循环。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述样品纯化以及PCR产物纯化都采 用磁珠吸附法进行。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述肺癌相关的105个基因包括，17个 肺癌革巴向药物祀点基因、18个肺癌化疗药物祀点基因、8个肺癌耐药基因、49个肺癌信号通 路相关基因，以及13个DNA修复相关的基因。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述捕获探针的3'端具有生物素标 记。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述杂交捕获中，按照一个探针捕获 10-12个cfDNA文库的用量添加捕获探针。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:在进行测序之前还包括对捕获产物进 行PCR扩增，然后采用PCR扩增产物进行测序，所述PCR扩增的循环数根据捕获区域的大小而 定，具体的，捕获区域为l_499kb，循环数为12-14个循环，捕获区域大于499kb，并小于或等 于1.49Mb，循环数为9-11，捕获区域大于1.49Mb，循环数为8-10。8. 根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于:所述数据分析包括去除低质 量数据、对数据进行剪裁，以及去除polyN误差信息;所述去除低质量数据包括去除mapping 质量为Qio的数据;所述对数据进行剪裁包括剪裁去掉barcode数据、barcode后面7-10nt， 以及reads最后8-10nt ;所述去除polyN误差信息包括去除数据中连续20个以上polyN的数 据。9. 根据权利要求1-8任一项所述的检测方法在肺癌检测试剂盒或肺癌检测设备中的应 用。10. -种肺癌检测的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有肺癌及肺癌相关的105个 基因的12659条捕获探针，并且，所述试剂盒采用权利要求1-8任一项所述的检测方法对待 测样品进行检测。
【文档编号】C12Q1/68GK106047998SQ201610363675
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】钟果林, 张晓妮, 黄探霄, 许明炎
【申请人】深圳市海普洛斯生物科技有限公司