禾本科七个主要牧草属dna条形码通用序列的筛选方法
【专利摘要】一种禾本科七个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法，包括以下步骤：(1)首先根据GenBank中禾本科牧草matk和rbcl基因的核苷酸序列，设计4对通用引物，建立针对禾本科七个主要牧草属八种牧草11个样品的目的片段的扩增条件进行扩增；(2)然后对扩增产物进行测序和分析，经分别比对，筛选出七个主要牧草属的四个标记位点5’端和3’端保守序列，对各标记位点保守区内的核苷酸进行单核苷酸多态性的单倍型分析，可知matk1、matk2、matk3分别有6个单倍型、7个单倍型和3个单倍型，rbcl基因有5个单倍型；(3)然后根据matk和rbcl基因筛选的四个标记位点，建立八种牧草相对应的特异DNA识别码。本发明引物通用性好，扩增效果很理想，同时物种识别率高。
【专利说明】
禾本科-t个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法，具体设及一种禾本科屯 个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法。
【背景技术】
[0002] DNA条形码(DNA barcoding)技术又称DNA条形编码，其因快速、简便、精准等特点 常被用作物种鉴定，其原理是基于物种种内特异性和种间多样性，利用一个或几个标准的 DNA片段化NA barcode)构建生物鉴别数据库。胎bert等在对11种不同口的动物的研究中发 现C0ICytochrome coxi-dase subunit 1)基因序列的种间变异能够较好地区分物种，而 植物中的C0I或其他线粒体基因的变异度较低，不适用于植物物种的鉴定。据报道，植物中 的叶绿体基因虽相对保守，但其单亲遗传避免了基因重组，且含量丰富，扩增能力强，故在 叶绿体基础上进行植物物种的鉴定成为一种可行的办法。现今，由于植物条形码研究还处 于对片段的研究阶段，其分析方法与动物有所不同。首先进行序列比对和人工校正，种间距 离通常采用pairwise uncorrected p-distance或Kimura-2-parameter distance(K2P)模 型计算，通过MEGA或PAUP计算种内和种间的K2P距离，然后采用分子系统学方法，通过构建 多种系统发育树对条形码进行分析(如NJ、UPGM、ML和MP等)并检验每个物种的单系情况。
[0003] 目前，生物DNA条形码联盟(Conso;rtium for the Barcode of Life,CB0L)提议的 植物DNA条形码候选片段有matKjpoBjpoCl、;rb(3L、psbA-1:;rnH等序列，其中;rb(3L、matK和 ITS为核屯、条形码，付址-psbA为补充条形码。相关研究认为matK具有进化速率快，较好的种 间鉴别能力，但主要的缺陷是引物通用性差，化等对葡萄科崖爬藤属的试验中得到结论，认 为matK扩增成功率达到93.5%，扩增效果很理想，但单独使用matk进行鉴别时，其物种识别 率不高，仅为22.2% jbcl序列具有通用、易扩增、易比对的特点，但其变异主要存在于种W 上水平，物种水平上通常变异不够大。
[0004] 禾本科牧草作为家畜的主要饲草来源，分布较广，饲用意义较大的包括30属，大多 为牲畜所喜食，但是DNA条形码技术在牧草鉴别中应用较为罕见，因此，若能建立禾本科屯 个属牧草品种的DM条码，可进一步开展品种鉴别提供理论依据和方法参考。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种禾本科屯个主要牧草属物种识别率较高 的DNA条形码通用序列的筛选方法。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种禾本科屯个主要牧草属DNA条形 码通用序列的筛选方法，包括W下步骤：
[0007] (1)根据GenBank中禾本科牧草matk和rbcl基因的核巧酸序列，设计4对通用引物， 建立针对禾本科屯个主要牧草属(高梁属、玉蜀泰属、巧巧草属、针茅属、黑麦草属、羊茅属 和早熟禾属)八种牧草11个样品的目的片段的PCR扩增条件进行扩增；
[000引（2)然后对扩增产物进行测序和分析，经分别比对，筛选出屯个主要牧草属的四个 标记位点5'端和3'端保守序列，对各标记位点保守区内的核巧酸进行单核巧酸多态性 (SNPs)的单倍型分析，结果表明：matkl、matk2、matk3分别有6个单倍型化l\HlB、HlG、HlD、 HIE和H1F)、7个单倍型化2\肥8、肥G、肥d、H2E、肥F和肥G)和3个单倍型化肥B和H2G)，rbcl基 因有5个单倍型化，H4B，H4E，H4D，H4E);
[0009] (3)根据matk(matkl，matk2，matk3)和rbcl基因筛选的四个标记位点为八种牧草 建立了相对应的特异DNA识别码，W此可W对高梁属、玉蜀泰属、巧巧草属、针茅属、黑麦草 属、羊茅属和早熟禾属的八种牧草进行准确鉴别。
【附图说明】
[0010] 图1为引物F-M1/R-M433PCR扩增凝胶电泳检测图（其中，M:DL1000;1:高丹；2:玉 米;3:针茅;4:"贝克"黑麦草;5:"凯蒂莎"黑麦草;6:甘肃羊茅;7:"净峰"紫羊茅;8:"梦神" 紫羊茅;9:巧胜'早熟禾;10:"钻石'早熟禾;11:哀巧草）。
[001。 图2为引物F-M118/R-M434PCR扩增凝胶电泳检测图（其中，M: DL1000; 1:高丹;2:玉 米;3:针茅;4:"贝克"黑麦草;5:"凯蒂莎"黑麦草;6:甘肃羊茅;7:"净峰"紫羊茅;8:"梦神" 紫羊茅;9:巧胜'早熟禾;10:"钻石'早熟禾;11:哀巧草）。
[001 ^ 图3为引物F-M1262/R-M1472扩增凝胶电泳检测图（其中，M: DL500; 1:高丹；2:玉 米;3:针茅;4:"钻石"早熟禾;5:"百胜"早熟禾;6:甘肃羊茅;7:"净峰"紫羊茅;8:"梦神"紫 羊茅;9:"凯蒂莎'黑麦草(测序失败）；10:"贝見'黑麦草(测序失败）；11:哀巧草）
[OOU]图4为引物F-rbcl/R-rbcl扩增凝胶电泳检测图（其中，M:DL1000;1:高丹；2:玉米； 3:针茅;4:"贝見'黑麦草;5:巧巧草(测序失败）；6:甘肃羊茅;7:"净峰'紫羊茅;8:"梦冲'紫 羊茅;9:"百胜"早熟禾;10:"钻石"早熟禾;11:"凯蒂莎"黑麦草）。
[0014] 图5为NJ系统发育树。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和实施例对本发明进一步加 W说明。
[0016] -、样品
[0017] 采集禾本科牧草屯个属八个种共11个样品，样品信息详见表1。
[0018] 表1-禾本科牧草样品信息
[0019]
[0020] 二、PCR引物设计
[0021 ] 参照GenBank中叶绿体matk和rbcl基因的核巧酸序列，采用Primers 5.0进行引物 设计。其中，matk基因参照高梁属（AF164418、册558520)、羊茅属（DQ786940)、燕麦属 (611367310、61]367311)、大麦属(48078131、48078133)、稻属(4。489915、4￥768779)和针茅属 (KC129652、KC129653)等设计3对引物；rbcl基因参照巧巧草属（HQ600430)、针茅属 化E573441)、高梁属化Q600085)和羊茅属(FN668434、FN668435)等设计1对引物。引物由上 海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表2。
[00剖表2-引物信息
[00731
[0024] 实施例1
[0025] 一、基因组DM提取、PCR扩增和测序
[0026] 称取植物叶片约lOmg，用液氮研磨至粉末后，采用CTAB法提取基因组DNA，TE溶解。 PCR扩增采用50ul体系：dNTP(2.5mmol/L)化L，10XBuffer 化LJaq DNA聚合酶巧 11/化)0.4 化，DNA模板化L，上、下游引物各化L( 10皿ol/L)，加 d地2〇至50化。PCR反应条件：94°C预变性 2min;94°C 变性 40s，退火 30s、72°C 延伸 30s(30 个循环）；72°C 延伸 10min;4°C 保存。PCR 扩增 产物经琼脂糖凝胶电泳（30min，150V)检验。PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进 行测序。
[00的]二、数据处理
[0028] 利用chromas 2.33对测序结果进行校对和编辑，并利用MEGA 5.0进行序列比对， 同时借助化asp 5.10分析单倍型和变异位点。
[00巧]=、结果与分析
[0030] 1、引物筛选
[0031] 根据设计的4对通用引物，针对禾本科屯个属八个种共11个牧草建立并优化目的 片段PCR扩增条件，获得的最佳退火溫度见表3。
[0032] 表3-引物PCR反应最伟很火温麼表
[0033]
[0034] 由图1~4可知，电泳检测结果获得的目的条带清晰，片段大小与预期结果相符，经 测序获得较高质量的核巧酸序列，说明实施例1筛选的引物，可用于DNA条码的筛选。
[0035] 2、DNA保守区识别
[0036] 利用chromas 2.33对测序结果进行校对和编辑后，通过MEGA 5.0进行序列比对， 分别筛选标记位点5 '端和3 '端高度保守区，见表4。
[0037] 表4标记位点保守区识别
[00；3 引
[0039] 3、单倍型分析
[0040] (l)matkl
[0041] 基于Dnasp5.10进行单倍型分析，结果表明：八种牧草11个样品彼此间有24个变异 位点，因此界定6个单倍型(见表5)，其中化A，化B，化D，化E和化F分别为高丹，针茅，玉米，黑麦 草和紫羊茅的特有单倍型;hie为早熟禾，甘肃羊茅和巧巧草的共享单倍型。另外，同一种牧 草的不同品种间均具有共享单倍型。
[0042] 表5-matkl单倍型《态位点
[0043]
[0044]
[0045] (2)matk2
[0046] 八种牧草11个样品彼此间有8个变异位点，分为7个单倍型（见表6):其中H2A，H2G， 肥D，H2E，肥呀肌分别为甘肃羊茅，针茅，高丹，玉米，黑麦草和紫羊茅六种牧草的特有单倍 型;H2B为其余两种牧草巧巧草和早熟禾的共享单倍型。另外，同一种牧草的不同品种间均 具有共享单倍型。
[0047] 表6-matk2单倍型多态位点
[004引
[0049]
[0050] (3)matk3
[0051] 在matk3片段上设计的引物未能成功扩增出黑麦草的2个品种贝克和凯蒂莎，扩增 得到9个样品彼此间有5个变异位点，分为3个单倍型(见表7):其中，仅针茅有其特有单倍型 册B;册4为甘肃羊茅，巧巧草，早熟禾，紫羊茅四种牧草的共享单倍型;H3E为高丹和玉米的共 享单倍型。
[0化2] 表7-matk3单倍型多态位点 [0化3]
[0化4] (4)rbcl 序列
[0055]在rbcl片段上设计的引物未成功扩增出巧巧草，扩增所得到的10个样品中有33个 变异位点，分为5个单倍型（见表8):其中H4B，H少和H4D为早熟禾，针茅和黑麦草S种牧草的 特有单倍型;H4B为高丹和玉米的共享单倍型;H4E为紫羊茅和甘肃羊茅的共享单倍型。
[0化6] 表8-rbcl单倍型多态位点
[0化7]
[0化引 4、DNA Barcoding数据库的建立
[0059] 基于matkS个标记位点(matkl，matk2，matk3)和rbcl基因在牧草种属间表达的特 异性建立了八种牧草的DNA条形码数据库（见表9)，该数据库由matkS个标记位点(matkl、 matk2、matk3)和rbcl基因的特异性引物(见表2)、标记位点5'端和3'端保守序列（见表4)W 及DNA识别码(见表9)共同组成。同一种牧草的不同品种，如早熟禾化a pratensi S L两个品 种钻石和百胜具有共同的DNA barcoding，与其他属的牧草DNA barcoding完全不同，验证 DNA条形码种内无差异，种间允许有较大差异的特征，达到鉴别的标准。
[0060] 表9八种牧草的DNA Barcoding数据库
[0061]
[0062]
[0063] 注："M"代表"matk基因"，"R"代表"rbcl基因"，"H"代表"单倍型"，其后的"1、2和3" 分别代表"matkl、matk2和matk3" S个标记位点，"4"代表rbcl的标记位点，上标字母代表对 应标记位点核巧酸单倍型类别。
[0064] 5、系统发育树的构建
[0065] 利用K imura2-parame t e；K K2P)模型构建的NJ系统发育树，结果见图5。四个标记位 点(matkl，matk2，matk3和rbcl )5'端和3'端保守序列按照首尾相接的方式组合而成，全长 为99化P，八种牧草分列于不同的进化支，而同一中的不同品种聚在不同的进化支上。
[0066] 6、结论
[0067] (1)禾本科候选序列的筛选
[006引DNA条形码的核屯、为PCR扩增，而退火溫度是影响PCR扩增的重要参数，在Tm值允许 范围内，选择较高的复性溫度可相对减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR扩增的特 异性。电泳结果表明本发明选择各引物的退火溫度最佳，对八种牧草均具有较强的扩增能 力，电泳条带明亮单一，且确定DNA条形码引物PCR反应条件是适宜的。
[0069] 本发明比较matk基因的S个标记位点单倍型分析结果发现，matk基因 S个标记位 点(matkl，matk2，matk3)保守区片段大小依次较小，同时，变异位点数也依次降低。在属水 平上，matkl无法区分早熟禾属，羊茅属和巧巧草属，对于其余四个属的牧草能准确鉴别，属 水平的鉴别成功率为57.1 %，种水平的鉴别成功率为62.5% "matk2无法区分巧巧草属和早 熟禾属，属水平鉴别成功率为71.4%，种水平鉴别成功率为75%。而matk3扩增成功率较低， 未扩增出黑麦草的两个品种，存在5个变异位点，将八种牧草分为=个单倍型，仅区分出针 茅属，属水平鉴别成功率仅为16.7%，与种水平相同。
[0070] 本发明分析rbcl鉴别结果发现:在rbcl标记位点设计的引物未能扩增出巧巧草 属，保守区内存在33个变异位点，相比于matk基因的S个标记位点，rbcl变异最高。单倍型 结果表明，rbcl基因仅能鉴别出早熟禾属和黑麦草属两个属的不同种牧草，其余六种牧草 存在共享单倍型，无法鉴别。该结果再次证明rbcl基因需与其他片段组合使用。
[0071] 本发明选择matk和rb化基因联合使用进行禾本科牧草的鉴别，四个标记位点的单 倍型组合构成DNA识别码，每种牧草都有其特异的DNA识别码，在属水平和种水平鉴别成功 率均达到100 %。
[0072] (2)基于系统发育树的辅助鉴定
[0073] 实施例1采用线粒体D环作为分子标记，通过分析多态位点，W种间特异性单倍型 的特征性碱基作为种间鉴别的依据，同时利用K2P模型构建系统发育树，八种牧草分列于不 同的进化支，再次验证了 matk和rbcl片段组合后，其鉴别效率明显高于单片段。系统发育多 样性不受物种分类地位变更的影响，是生物多样性研究的一个里程碑式的指数。可见，本发 明通过构建系统发育树，充分证明了禾本科牧草各物种的单系性，其结果满足DM barcoding对包含足够系统进化信息进行物种在分类系统(科、属等)定位中的要求。
[0074] 综上可知，matk序列(matkl，matk2，matk3)和rbcl序列在种水平上的鉴定成功率 最高，是运批序列中较适用的序列。将两种片段组合后能将禾本科八种牧草完全区分，鉴定 效率达到100%。因此，将matk与rcbl联合应用作为禾本科牧草的DNA条形码通用序列组合。
【主权项】
1. 一种禾本科七个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 首先根据GenBank中禾本科牧草matk和rbcl基因的核苷酸序列，设计4对通用引物， 建立针对禾本科七个主要牧草属八种牧草11个样品的目的片段的PCR扩增条件进行扩增； (2) 然后对扩增产物进行测序和分析，经分别比对，筛选出七个主要牧草属的四个标记 位点5'端和3'端保守序列，对各标记位点保守区内的核苷酸进行单核苷酸多态性的单倍型 分析，可知matkl、matk2、matk3分别有6个单倍型、7个单倍型和3个单倍型，rbcl基因有5个 单倍型； (3) 然后根据matk和rbcl基因筛选的四个标记位点，建立八种牧草相对应的特异DNA识 别码。2. 根据权利要求1所述的禾本科七个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法，其特 征在于，步骤(1)中，所述禾本科七个主要牧草属为高粱属、玉蜀黍属、芨芨草属、针茅属、黑 麦草属、羊茅属和早熟禾属。3. 根据权利要求1所述的禾本科七个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法，其特 征在于，步骤(1)中，所述4对通用引物分别为标记位点matkl的引物对： F-M1：5-TATACCCACTTATTTTTCGGGAGTATA-3 R-M433：5-ATGGATAGGATATGGTATTCGTATATCTG-3； 标记位点matk2的引物对： F-M118：5-TTGTAAAACGTTTAATTACTCGAATGTAT-3 R-M434：5-ATGGATAGGATATGGTATTCGTATATCTG-3； 标记位点matk3的引物对： F-M1262：5-TATATACTTCGGCTTTCTTGTATTAAAACTT-3 R-M1472：5-CGTTTCTGAAAAGAATATCCAAATACCAAA-3； 标记位点rbcl的引物对： F-rbcl：5-CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT-3 R-rbcl：5-AGACATTCATAAACAGCTCTACCGT-3 〇4. 根据权利要求1所述的禾本科七个主要牧草属DNA条形码通用序列的筛选方法，其特 征在于，步骤（1)中，所述PCR扩增条件为反应采用50ul体系：dNTP(2.5mmol/L)2yL，10X Buffer 5yL，Taq DNA聚合酶（5U/yL) 0.4yL，DNA模板2yL，上、下游引物各lyL(1 Ομπιο 1 /L)，加 (1诎2〇至5(^1^?0?反应条件：94°(：预变性2111丨11;94°(：变性4〇8，退火3〇8、72°(：延伸3〇8,30个循 环;72°C延伸10min;4°C保存。
【文档编号】C12Q1/68GK106047999SQ201610364938
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】焦婷, 赵生国, 吴建平, 李永青, 梁建勇, 文禹粱, 安雪姣
【申请人】甘肃农业大学