胶质瘤细胞中gdnf基因启动子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，步骤一：提取胶质瘤细胞；步骤二：细胞培养；步骤三：药物处理；步骤四：mRNA提取；步骤五：反应：95℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s;72℃延伸15s，扩增40个循环；步骤六：计算：样品以GAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量(2?△△CT)法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。引物的序列为：GAPDH：F:5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’；R:5’AGATCCACAACGGATACATT3’GDNF:F:5’GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’；R:5’TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’。通过本发明通过本发明处理过程后，经过检测的胶质瘤细胞2^?△△CT表达水平更高，同时通过两者方差对比，本发明的检测方法，2^?△△CT的表达水平更加稳定。
【专利说明】
胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明设及医学检测方法，更具体的说是设及一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子 检测方法。
【背景技术】
[0003] 胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)是胶质瘤发性胶质瘤细胞的重要促生长因 子，在原发性胶质瘤组织和多种胶质瘤细胞系中转录异常升高。目前，基因高转录对胶质瘤 细胞恶性增殖与迁移机制的研究已经很多，然而鲜见对其高转录发生机制的报道。本课题 组前期的研究发现，gdnf基因的高转录与基因突变无关，推测基于非DNA序列改变的表观 遗传修饰可能参与其高转录调控过程。近来的研究表明，翻译后组蛋白的乙酷化修饰在调 苄基因转录过程中发挥了重要作用。
[0004] 通过现有技术的发展，GDNF基因 mRNA表达及其启动子I区组蛋白H3K9的乙酷 化修饰状态，GDNF基因上mRNA与基因癌变有重要关系，现有技术中也有记载检测GDNF基 因上mRNA的方法，但是现有技术中的方法由于受到外界影响过大，检测出来的未定型不 局。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高稳定性胶质瘤细胞中 GDNF基因启动子mRNA检测方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案： 一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法，步骤一：提取胶质瘤细胞:取4她内 的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %膜酶溶液在37°C条件下消化5min;收集细胞 培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次;在原代培养7-9天后，将培养瓶 置于恒溫摇床37°C，200巧m，2化震荡纯化，W去除小胶质细胞及少突胶质细胞； 经GFAP免疫巧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质 瘤细胞株； 步骤二:细胞培养:胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、lOOU/ml青霉素，lOOU/ml链霉素 的培养基，置于37 °C，5% C02培养箱中培养； 步骤=:药物处理:取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为 25~100皿ol/L的姜黄素继续培养2地； 步骤四：mRNA提取，采用TRIzol-步法从细胞中提取总RNA，取RNA模板化g用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再W逆转录反应液化1作为模板， 加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为： GAP畑：F: 5 ' TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3 ' R:5 ' AGATCCACAACGGATACATT3 ' GDNF: F:5 ' GACTTGGGTTTGGGCTACGA3 ' R:5 ' TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3 '； 步骤五:反应:95 °C预变性30s;95°C变性20S，60°C退火15s; 72°C延伸15s，扩增40个 循环； 步骤六:计算:样品WGAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量（2~-AACT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。
[0007]作为本发明的进一步改进:所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行 一次清洗，之后通过清洗液中浸泡15min后，在用清洗液冲洗至少=次，所述清洗液包括下 列重量份组成： 去离子水 800~1000份 氯化钢 5~10份 氯化钟 0.1~1份 憐酸二氨钟0.1~1份 憐酸氨二钢1~2份 憐酸甘油 1~2份 海藻糖 0.1~1份； 再加入0.25 %膜酶溶液在37 °C条件下消化5min，所述膜酶溶液包括：0.25%的膜酶、 0.02%的邸TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量为PBS缓冲液。
[000引作为本发明的进一步改进:所述步骤二中，培养基为WDMEM/F12培养液为基体，再 添加海藻糖、壳聚糖、琉基乙醇、亚砸酸钢，所述海藻糖添加量为DMEM/F12培养液质量的 0.5%，壳聚糖为DMEM/F12培养液质量的^5 %，所述亚砸酸钢最终浓度为5~化g/L。
[0009] 作为本发明的进一步改进:所述步骤=中，在加入姜黄素进行乙酷化的过程中，同 时加入去甲氧基姜黄素，所述去甲氧基姜黄素用量为姜黄素用量的^5%。
[0010] 作为本发明的进一步改进:所述步骤一中，膜酶溶液完成消化后，加入膜酶抑制剂 解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，通过高速离屯、机将整个 混合液进行离屯、，将上清液弃去后，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。
[0011] 作为本发明的进一步改进:所述步骤一种，分离得到去膜酶的细胞后，再通过清洗 液浸泡5min，浸泡过后在使用清洗剂清洗至少S次，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的 DMHM/F12培养液。
[0012] 作为本发明的进一步改进:所述步骤二中的培养基中还添加有载体，所述载体为 聚乳酸、淀粉、聚苯乙締 W葡萄糖水溶液为介质在60~80°C下通过聚合反应生成的微孔材 料。
[0013] 作为本发明的进一步改进:所述载体中W重量份计：聚苯乙締为30~50份，聚乳酸 为5~15份，淀粉为5~15份，葡萄糖水溶液浓度为5~10%。
[0014] 作为本发明的进一步改进:所述步骤二中，在培养过程中，保持揽拌，所述揽拌速 度为 30 ~SOr/min。
[0015] 作为本发明的进一步改进:所述步骤=中，在提取细胞时，先在步骤二培养基中加 入0.25%的膜酶、0.02%的抓TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量为PBS缓 冲液，消化5min后，使得细胞从载体上脱落，取出载体，通过PBS缓冲液冲洗至少立次，冲下 来的液体倒回原培养基，加入膜酶抑制剂解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、 甘油醇进行稀释，经过告诉离屯、后的到的细胞，取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行 药物处理，加入终浓度为25~lOOwnol/L的姜黄素继续培养2地。
[0016] 本发明的有益效果，通过本发明的方法进行检测的胶质瘤细胞GDNF基因 mRNA的表 达更加稳定。
[0017] 首先，经过步骤一处理的胶质瘤细胞，能够在被处理完过后，仍然能够保持较好的 活性，加入膜酶，将细胞与细胞之间分离，W便后续处理能够是的细胞能够W单个细胞存 在。膜酶的处理时间不宜过长，过长会导致细胞被膜酶分解，从而被破坏。之后将分离的细 胞放入培养基中培养。运样就能够培养出完整性较好的细胞。最后制得细胞株。
[0018] 之后将细胞株进一步培养，胎牛血清主要是给细胞生长提供营养，而青霉素和链 霉素主要是保证细胞不会被感染，保证细胞的存活率的同时，也保证不会导入其他DNA或者 RNA。
[0019] 而步骤=中，选用姜黄素作为乙酷化的试剂，能够更好地将组织蛋白乙酷化。乙酷 化程度更高。使得之后进入步骤四mRNA提取过程中，逆转录的表达更加准确。
[0020] 在步骤五中，通过设定的参数，能够得到更加准确的诗句。最后通过对比，得到 mRNA的表达水平。
[0021 ]而在步骤一中，先将样本碎片通过酒精清洗，先初步清洗掉黏附在样本细胞表面 的杂质，之后通过清洗剂浸泡，清洗剂中的去离子水、氯化钢、氯化钟、憐酸二氨钟、憐酸氨 二钢能够形成适应细胞生存的体系，特别是胶质瘤细胞，其细胞活性能够得到极大限度的 保证，同时通过憐酸甘油和海藻糖的加入，能够进一步保证细胞的活性，特别是蛋白质的活 性，是的后期mRNA的表达更加准确。同时，膜酶溶液中EDTA能够提高膜酶的分离细胞的效 果，同时海藻糖、丙=醇、憐酸甘油的加入，一方面保证了膜酶溶液的活性，同时液保护细胞 组织不会被膜酶过度分解导致细胞失活。
[0022] 另外在步骤二中的培养基中添加海藻糖、壳聚糖、琉基乙醇、亚砸酸钢，海藻糖能 够对肿瘤细胞起到保护作用，使得细胞活性更高，同时亚砸酸钢能够提供细胞生长所需要 的微量元素，而壳聚糖不仅仅能够起到保护细胞，提高活性，还能够调整整体液体的粘稠 度，是使得细胞生存的环境更加稳定。
[0023] 在步骤=中姜黄素乙酷化过长中加入去甲氧基姜黄素，能够提高姜黄素的稳定 性，提高其乙酷化的表达。
[0024] 步骤一中，在完成膜酶消化后，通过膜酶抑制剂的加入能够彻底抑制膜酶的分解 反应，使得膜酶失活，而不会造成肿瘤细胞的失活，之后再清洗过程中，加入的甘油醇也同 样能够对肿瘤细胞形成保护，目的是为了防止膜酶抑制剂对肿瘤细胞产生损伤。
[0025] 在分离膜酶后，浸泡清洗液也是为了能够去除肿瘤细胞表面的杂质W外，还能够 对肿瘤细胞起到一个保护作用。使得后期培养前就保证了肿瘤细胞的活性。
[0026] 另外，在培养过程中，加入了载体，通过聚乳酸、淀粉、聚苯乙締制备的载体，是一 种环保型载体，给细胞生长提供了一个优质的环境，载体是一个多孔材料是的细胞生长能 够有更多的贴壁面积，更好的模拟了生物体内的环境，保证了其细胞培养的成活率W及活 性。
[0027]而在使用载体后，为了使得细胞从载体上脱落就需要用膜酶溶液进行浸泡，之后 冲洗，冲洗下来的冲洗液为了充分利用，倒回到培养基中，进行肿瘤细胞的提取。
【具体实施方式】 [002引 实施例： 步骤一:提取胶质瘤细胞:取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %膜酶 溶液在37°C条件下消化5min;收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换 液两次;在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒溫摇床37°C，200rpm，2化震荡纯化，W去除小 胶质细胞及少突胶质细胞； 经GFAP免疫巧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质 瘤细胞株； 所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行一次清洗，之后通过清洗液中浸 泡15min后，在用清洗液冲洗至少=次，所述清洗液包括下列重量份组成： 去离子水 800~1000份 氯化钢 5~10份 氯化钟 0.1~1份 憐酸二氨钟0.1~1份 憐酸氨二钢1~2份 憐酸甘油 1~2份 海藻糖 0.1~1份； 再加入0.25 %膜酶溶液在37 °C条件下消化5min，所述膜酶溶液包括：0.25%的膜酶、 0.02%的邸TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量为PBS缓冲液。
[0029] 所述步骤一中，分离得到去膜酶的细胞后，再通过清洗液浸泡5min，浸泡过后在使 用清洗剂清洗至少=次，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。
[0030] 步骤二:细胞培养:胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、lOOU/ml青霉素，100U/ml链 霉素的培养基，置于37°C ,5% C02培养箱中培养;所述步骤二中，培养基为WDMEM/F12培养 液为基体，再添加海藻糖、壳聚糖、琉基乙醇、亚砸酸钢，所述海藻糖添加量为DMEM/F12培养 液质量的0.5%，壳聚糖为DMEM/F12培养液质量的^5 %，所述亚砸酸钢最终浓度为5~7ng/L。 所述步骤二中的培养基中还添加有载体，所述载体为聚乳酸、淀粉、聚苯乙締 W葡萄糖水溶 液为介质在60~8(TC下通过聚合反应生成的微孔材料。在培养过程中，保持揽拌，所述揽拌 速度为30~50r/min。
[0031] 所述载体中W重量份计:聚苯乙締为30~50份，聚乳酸为5~15份，淀粉为5~15份，葡 萄糖水溶液浓度为5~10%。
[0032] 步骤=:药物处理:取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓 度为25~100皿ol/L的姜黄素继续培养2地； 所述步骤=中，在加入姜黄素进行乙酷化的过程中，同时加入去甲氧基姜黄素，所述去 甲氧基姜黄素用量为姜黄素用量的^5%。
[0033] 作为本发明的进一步改进:所述步骤一中，膜酶溶液完成消化后，加入膜酶抑制剂 解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，通过高速离屯、机将整个 混合液进行离屯、，将上清液弃去后，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。
[0034] 所述步骤S中，在提取细胞时，先在步骤二培养基中加入0.25%的膜酶、0.02%的 抓TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量为PBS缓冲液，消化5min后，使得 细胞从载体上脱落，取出载体，通过PBS缓冲液冲洗至少=次，冲下来的液体倒回原培养基， 加入膜酶抑制剂解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，经过告 诉离屯、后的到的细胞，取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为 25~100皿ol/L的姜黄素继续培养2地。
[0035] 步骤四：mRNA提取，采用TRIzol -步法从细胞中提取总RNA，取RNA模板化g用 Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再W逆转录反应液化1作 为模板，加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为： GAP畑：F: 5 ' TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3 ' R:5 ' AGATCCACAACGGATACATT3 ' GDNF: F:5 ' GACTTGGGTTTGGGCTACGA3 ' R:5 ' TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3 '； 步骤五:反应:95 °C预变性30s;95°C变性20S，60°C退火15s; 72°C延伸15s，扩增40个 循环； 步骤六:计算:样品WGAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量（2~-AACT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。
[0036] 本发明的有益效果，通过本发明的方法进行检测的胶质瘤细胞GDNF基因 mRNA的表 达更加稳定。
[0037] 首先，经过步骤一处理的胶质瘤细胞，能够在被处理完过后，仍然能够保持较好的 活性，加入膜酶，将细胞与细胞之间分离，W便后续处理能够是的细胞能够W单个细胞存 在。膜酶的处理时间不宜过长，过长会导致细胞被膜酶分解，从而被破坏。之后将分离的细 胞放入培养基中培养。运样就能够培养出完整性较好的细胞。最后制得细胞株。
[0038] 之后将细胞株进一步培养，胎牛血清主要是给细胞生长提供营养，而青霉素和链 霉素主要是保证细胞不会被感染，保证细胞的存活率的同时，也保证不会导入其他DNA或者 RNA。
[0039] 而步骤=中，选用姜黄素作为乙酷化的试剂，能够更好地将组织蛋白乙酷化。乙酷 化程度更高。使得之后进入步骤四mRNA提取过程中，逆转录的表达更加准确。
[0040] 在步骤五中，通过设定的参数，能够得到更加准确的诗句。最后通过对比，得到 mRNA的表达水平。
[0041 ]而在步骤一中，先将样本碎片通过酒精清洗，先初步清洗掉黏附在样本细胞表面 的杂质，之后通过清洗剂浸泡，清洗剂中的去离子水、氯化钢、氯化钟、憐酸二氨钟、憐酸氨 二钢能够形成适应细胞生存的体系，特别是胶质瘤细胞，其细胞活性能够得到极大限度的 保证，同时通过憐酸甘油和海藻糖的加入，能够进一步保证细胞的活性，特别是蛋白质的活 性，是的后期mRNA的表达更加准确。同时，膜酶溶液中EDTA能够提高膜酶的分离细胞的效 果，同时海藻糖、丙=醇、憐酸甘油的加入，一方面保证了膜酶溶液的活性，同时液保护细胞 组织不会被膜酶过度分解导致细胞失活。
[0042] 另外在步骤二中的培养基中添加海藻糖、壳聚糖、琉基乙醇、亚砸酸钢，海藻糖能 够对肿瘤细胞起到保护作用，使得细胞活性更高，同时亚砸酸钢能够提供细胞生长所需要 的微量元素，而壳聚糖不仅仅能够起到保护细胞，提高活性，还能够调整整体液体的粘稠 度，是使得细胞生存的环境更加稳定。
[0043] 在步骤=中姜黄素乙酷化过长中加入去甲氧基姜黄素，能够提高姜黄素的稳定 性，提高其乙酷化的表达。
[0044] 步骤一中，在完成膜酶消化后，通过膜酶抑制剂的加入能够彻底抑制膜酶的分解 反应，使得膜酶失活，而不会造成肿瘤细胞的失活，之后再清洗过程中，加入的甘油醇也同 样能够对肿瘤细胞形成保护，目的是为了防止膜酶抑制剂对肿瘤细胞产生损伤。
[0045] 在分离膜酶后，浸泡清洗液也是为了能够去除肿瘤细胞表面的杂质W外，还能够 对肿瘤细胞起到一个保护作用。使得后期培养前就保证了肿瘤细胞的活性。
[0046] 另外，在培养过程中，加入了载体，通过聚乳酸、淀粉、聚苯乙締制备的载体，是一 种环保型载体，给细胞生长提供了一个优质的环境，载体是一个多孔材料是的细胞生长能 够有更多的贴壁面积，更好的模拟了生物体内的环境，保证了其细胞培养的成活率W及活 性。
[0047] 而在使用载体后，为了使得细胞从载体上脱落就需要用膜酶溶液进行浸泡，之后 冲洗，冲洗下来的冲洗液为了充分利用，倒回到培养基中，进行肿瘤细胞的提取。
[004引对比例1: 选用中国科学院细胞库的大鼠 C6胶质瘤细胞株，大鼠 C6胶质瘤细胞株用含10%胎 牛血清、lOOU/ml青霉素，lOOU/ml链霉素的DMEM/F12培养基，置于37°C，5% C02培养箱中培 养。取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，分别加入Curcumin继续培养 2地。
[0049] 采用TRIzol-步法从细胞中提取总RNA，取RNA模板化g用Prime ScriptTM II逆 转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再W逆转录反应液化1作为模板，加入相应引 物进行PCR扩增。引物序列见表1。反应条件设置如下:95 °C预变性30s ;95°C变性20S，60°C 退火15s; 72°C延伸15s，扩增40个循环。通过溶解曲线分析PCR产物特异性。每个样品W GAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量（2-AACT)法计算目的基因在各样品 中相对mRNA的表达水平。
[0050] 对比例二： 取出生48 h内的SD大鼠的双侧大脑皮质，剪碎并用PBS冲洗数次，加入0.25 %膜酶37 °C消化5min。收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次。在原代 培养7-9天后，将培养瓶置于恒溫摇床37°C，200rpm，20h震荡纯化，W去除小胶质细胞及少 突胶质细胞。经GFAP免疫巧光鉴定阳性的细胞视为成熟的星形胶质细胞。取第4代的处于 对数生长期的细胞用于实验研究。
[0051 ] 采用TRIzol-步法从细胞中提取总RNA，取RNA模板化g用Prime ScriptTM II逆 转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再W逆转录反应液化1作为模板，加入相应引 物进行PCR扩增。引物序列见表1。反应条件设置如下:95 °C预变性30s ;95°C变性20S，60°C 退火15s; 72°C延伸15s，扩增40个循环。通过溶解曲线分析PCR产物特异性。每个样品W GAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量（2~-AACT)法计算目的基因在各样 品中相对mRNA的表达水平。
[0化2] 上述实施例和对比例一均做10次检测，W及对比例二为空白试验对照组，并且记 录其2 A ACT，进行对比，同时记录其标准差。
[0化3] 表1
通过上述数据，可W得出，在癌变细胞中，2-AACT的表达水平有明显提高。同时通过 实施例和对比例一的对比，能够得，通过本发明处理过程后，经过检测的胶质瘤细胞2~-A ACT表达水平更高，同时通过两者方差对比，本发明的检测方法，2~-AACT的表达水平更 加稳定。
[0054] W上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施 例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，运些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于： 步骤一:提取胶质瘤细胞:取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶 溶液在37°C条件下消化5min;收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换 液两次;在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒温摇床37°C，200rpm，20h震荡纯化，以去除小 胶质细胞及少突胶质细胞； 经GFAP免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质 瘤细胞株； 步骤二:细胞培养:胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、l〇〇U/ml青霉素，100U/ml链霉素 的培养基，置于37 °C，5% C02培养箱中培养； 步骤三:药物处理:取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为 25~100ymol/L的姜黄素继续培养24h; 步骤四：mRNA提取，采用TRIzol -步法从细胞中提取总RNA，取RNA模板2yg用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液ΙμL作为模板， 加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为： GAPDH:F:5 ' TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3 ' R:5 ' AGATCCACAACGGATACATT3 ' ⑶NF: F:5' GACTTGGGTTTGGGCTACGA3' R:5，TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3，； 步骤五：反应:95 °C预变性30s;95°C变性20S，60°C退火15s; 72°C延伸15s，扩增40个 循环； 步骤六:计算:样品以GATOH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量（2~-AACT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。2. 根据权利要求1所述的大鼠 C6胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在 于:所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行一次清洗，之后通过清洗液中浸泡 15min后，在用清洗液冲洗至少三次，所述清洗液包括下列重量份组成： 去离子水 800~1000份 氯化钠 5~10份 氯化钾 0.1~1份 磷酸二氢钾0.1~1份 磷酸氢二钠1~2份 磷酸甘油 1~2份 海藻糖 0.1~1份； 再加入0.25 %胰酶溶液在37 °C条件下消化5min，所述胰酶溶液包括：0.25%的胰酶、 0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液。3. 根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于:所述步 骤二中，培养基为以DMEM/F12培养液为基体，再添加海藻糖、壳聚糖、巯基乙醇、亚硒酸钠， 所述海藻糖添加量为DMEM/F12培养液质量的0.5%，壳聚糖为DMEM/F12培养液质量的1~5 %， 所述亚硒酸钠最终浓度为5~7ng/L。4. 根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于:所述步 骤三中，在加入姜黄素进行乙酰化的过程中，同时加入去甲氧基姜黄素，所述去甲氧基姜黄 素用量为姜黄素用量的1~5%。5. 根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法，其特征在于:所 述步骤一中，胰酶溶液完成消化后，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入 PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，通过高速离心机将整个混合液进行离心，将上清液弃去后，收 集细胞培养于含有1 〇%胎牛血清的DMEM/F12培养液。6. 根据权利要求5所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于:所述步 骤一种，分离得到去胰酶的细胞后，再通过清洗液浸泡5min，浸泡过后在使用清洗剂清洗至 少三次，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。7. 根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于:所述步 骤二中的培养基中还添加有载体，所述载体为聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯以葡萄糖水溶液为介 质在60~80 °C下通过聚合反应生成的微孔材料。8. 根据权利要求7所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法，其特征在于:所 述载体中以重量份计:聚苯乙烯为30~50份，聚乳酸为5~15份，淀粉为5~15份，葡萄糖水溶液 浓度为5~10%。9. 根据权利要求8所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于:所述步 骤二中，在培养过程中，保持搅拌，所述搅拌速度为30~50r/min。10. 根据权利要求9所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于:所述 步骤三中，在提取细胞时，先在步骤二培养基中加入0.25%的胰酶、0.02%的EDTA、0.02%的海 藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液，消化5min后，使得细胞从载体上脱 落，取出载体，通过PBS缓冲液冲洗至少三次，冲下来的液体倒回原培养基，加入胰酶抑制剂 解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，经过高速离心后的到的 细胞，取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μ mol/L的 姜黄素继续培养24h。
【文档编号】C12Q1/68GK106048002SQ201610372267
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】陈茂华, 孙军, 陆川, 陈献东, 巴华君, 蔡建勇
【申请人】温州市中心医院