一种高效价噬菌体的生产方法
【专利摘要】本发明提供了一种高效价噬菌体的生产方法，在生产过程中，定时检测噬菌体培养液的OD值，当噬菌体的宿主菌液培养到增殖活性最强的对数生长期时，静置后进行扩大培养，离心裂解后滤过除菌得到大规模的高效价噬菌体液。本发明所述的高效价噬菌体的生产方法，方法合理，应用方便，生产效率高，生产的噬菌体效价高，热稳定性好。
【专利说明】
一种高效价噬菌体的生产方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和微生物制品领域，具体地，涉及一种高效价噬菌体的生产 方法。
【背景技术】
[0002] 噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对一些细菌具 有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动植物没 有毒性。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于疾病诊断、水处理等多个领域。 由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究 工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
[0003] 然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行扩大生产，现有技术的噬菌体生产方式 条件复杂，并且往往效率不高，生产效果不好，严重制约了对噬菌体应用的发展。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种高效价噬菌体的生产方法。
[0005] 技术方案:本发明提供了一种高效价噬菌体的生产方法，包括以下步骤：
[0006] 1)冻存的噬菌体母液按照体积比1:1-2加入到菌液中，混合均匀；
[0007] 2)将上述混合液于32-40°C温度下，以80-120r/min的速度振荡培养10-20min;
[0008] 3)将步骤2)的混合液均匀涂布在固体培养基上，于32-40°C条件下倒置培养8-16h；
[0009] 4)将固体培养基上的单一菌落溶解于噬菌体缓冲液中，置于3_6°C条件下3_4h，并 每间隔20-30min摇晃2-3次，得噬菌体母液；
[0010] 5)噬菌体母液加入母液体积200-1000倍的噬菌体培养基中，于32-40°C条件下振 荡培养0.5-4h，每间隔20-30min取样检测0D值，培养至OD55Q-600值为0.2-0.5;
[0011] 6)静置噬菌体液0.5-2h;
[0012] 7)将步骤6)中的噬菌体液转接到体积20-200倍的新鲜噬菌体培养基中，于32-40 °(：条件下振荡培养8-16h，得到大规模高效价噬菌体液；
[0013] 8)所述大规模高效价噬菌体液于8000-12000g离心10-20min;
[0014] 9)上清液经过0.22-0.45μπι滤膜，得大规模高效价噬菌体悬液；
[0015]上述的噬菌体培养基以重量组分计，包括以下组分:牛肉膏4-8份、蛋白胨5-12份、 酵母膏粉0.8-1.2份、葡萄糖0.6-1份、乳糖1-1.6份、梓檬酸钠0.2-0.5份、梓檬酸铁0.1-0.3 份、硫代硫酸钠0.2-0.8份、氯化钙0.6-1.2份、氯化镁0.05-0.2份、硫酸钠0.6-0.8份、硫酸 锰0.1-0.3份、甘露醇0.8-1.2份、磷酸二氢钾0.03-0.3份、磷酸氢二钠0.05-0.2份、三羟甲 基氨基甲烧盐酸盐0.6-2份和水100份。
[0016]本发明所述的高效价噬菌体的生产方法，方法合理，应用方便，在生产过程中，定 时检测噬菌体培养液的0D值，当噬菌体的宿主菌液培养到增殖活性最强的对数生长期时， 静置使其稳定于对数生长期后进行扩大培养，离心裂解后滤过除菌得到大规模的噬菌体 液。生产后的噬菌体效价高，热稳定性好。此外，噬菌体培养基组分合理，营养丰富，生产效 率高。
[0017] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法，所述固体培养基以重量组分计，包括 以下组分:蛋白胨0.8-1.2份、酵母膏粉0.8-1.5份、琼脂糖1-2份、乳糖0.3-0.6份、氯化钠 0.3-0.8份、氯化钾0.1-0.5份、硫酸镁0.5-2份、磷酸氢二钠0.1-0.3份和水100份。固体培养 基的营养丰富，培养效果好。
[0018] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法，所述噬菌体母液中噬菌体的滴度为 106-1012PFU/mL。高滴度的噬菌体母液可以使整个噬菌体的大规模生产效率更高。
[0019]进一步的，上述的高效价菌体的生产方法，所述振荡速度为150-260r/min。条件 温和，易于实现。
[0020] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法，所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包 括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8-15份、氯化钠0.05-0.2份、氯化钾1 -5份、硫酸镁5-20份、磷酸氢二钾1-3份、磷酸二氢钠8-12份、明胶0.05-0.1份和水100份，并且调节pH到7-7.5。噬菌体缓冲液组分合理，使用方便，可以用于噬菌体的溶解和重悬，并且不影响噬菌体 的活性。
[0021] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法，所述蛋白胨为胰蛋白胨。胰蛋白胨作 为一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色 浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状，应用方便。
[0022] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法，所述的水为去离子水或纯化水。去离 子水或纯化水可以保证噬菌体大规模生产过程质量稳定、可控。
[0023] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法的制备方法，使用稀盐酸和/或氢氧化 钠调节溶液pH。原料来源广，调节十分方便，并且应用成本低。
[0024] 进一步的，上述的高效价噬菌体的生产方法，所述步骤在4-6%的湿度条件下完 成。4-6%的湿度条件下溶菌活性最佳，生产效果最好。
[0025] 有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明所述的高效价噬菌体的 生产方法，方法合理，应用方便，生产效率高，生产的噬菌体效价高，热稳定性好。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明所述使用实施例1-4生产方法制备的噬菌体温度稳定性检测图。
【具体实施方式】
[0027] 下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题， 并不是一种限制。
[0028] 实施例1
[0029] -种高效价乳杆菌噬菌体的生产方法，步骤在4%的湿度条件下完成，包括以下步 骤：
[0030] 1)冻存的乳杆菌噬菌体母液按照体积比1:1加入到乳杆菌菌液中，混合均匀;所述 噬菌体母液中噬菌体的滴度为1 〇6PFU/mL;
[0031] 2)将上述混合液于32°C温度下，以80r/min的速度振荡培养lOmin;
[0032] 3)将步骤2)的混合液均匀涂布在固体培养基上，于32°C条件下倒置培养8h;所述 固体培养基以重量组分计，包括以下组分:胰蛋白胨0.8份、酵母膏粉0.8份、琼脂糖1份、乳 糖0.3份、氯化钠0.3份、氯化钾0.1份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钠0.1份和去离子水100份； [0033] 4)将固体培养基上的单一菌落溶解于lmL的噬菌体缓冲液中，置于3°C条件下3h， 并每间隔20min摇晃2次，得噬菌体母液;所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分： 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8份、氯化钠0.05份、氯化钾1份、硫酸镁5份、磷酸氢二钾1份、磷酸 二氢钠8份、明胶0.05份和去离子水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7; [0034] 5)噬菌体母液加入母液体积200倍的噬菌体培养基中，于32 °C条件下振荡培养 0.5h，振荡速度为150r/min，每间隔20min取样检测OD值，培养至OD55Q值为0.2;上述的噬菌 体培养基以重量组分计，包括以下组分:牛肉膏4份、蛋白胨5份、酵母膏粉0.8份、葡萄糖0.6 份、乳糖1份、柠檬酸钠0.2份、柠檬酸铁0.1份、硫代硫酸钠0.2份、氯化钙0.6份、氯化镁0.05 份、硫酸钠0.6份、硫酸锰0.1份、甘露醇0.8份、磷酸二氢钾0.03份、磷酸氢二钠0.05份、三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐〇. 6份和去离子水100份；
[0035] 6)静置噬菌体液0.511;
[0036] 7)将步骤6)中的噬菌体液转接到体积20倍的新鲜噬菌体培养基中，于32°C条件下 振荡培养8h，得到大规模高效价噬菌体液；
[0037] 8)所述大规模高效价噬菌体液于8000g离心20min;
[0038] 9)上清液经过0.22μπι滤膜，得大规模高效价噬菌体悬液。
[0039] 实施例2
[0040] -种高效价溶藻弧菌噬菌体的生产方法，步骤在6%的湿度条件下完成，包括以下 步骤：
[0041 ] 1)冻存的溶藻弧菌噬菌体母液按照体积比1:2加入到溶藻弧菌菌液中，混合均匀； 所述噬菌体母液中噬菌体的滴度为1012PFU/mL;
[0042] 2)将上述混合液于40°C温度下，以120r/min的速度振荡培养20min;
[0043] 3)将步骤2)的混合液均匀涂布在固体培养基上，于40°C条件下倒置培养16h;所述 固体培养基以重量组分计，包括以下组分:胰蛋白胨1.2份、酵母膏粉1.5份、琼脂糖2份、乳 糖0.6份、氯化钠0.8份、氯化钾0.5份、硫酸镁2份、磷酸氢二钠0.3份和纯化水100份；
[0044] 4)将固体培养基上的单一菌落溶解于0.5mL的噬菌体缓冲液中，置于6°C条件下 4h，并每间隔30min摇晃3次，得噬菌体母液;所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组 分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15份、氯化钠0.2份、氯化钾5份、硫酸镁20份、磷酸氢二钾3份、 磷酸二氢钠12份、明胶0.1份和纯化水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7.5;
[0045] 5)噬菌体母液加入母液体积1000倍的噬菌体培养基中，于40 °C条件下振荡培养 4h，振荡速度为260r/min，每间隔30min取样检测OD值，培养至OD6QQ值为0.5;上述的噬菌体 培养基以重量组分计，包括以下组分:牛肉膏8份、蛋白胨12份、酵母膏粉1.2份、葡萄糖1份、 乳糖1.6份、柠檬酸钠0.5份、柠檬酸铁0.3份、硫代硫酸钠0.8份、氯化钙1.2份、氯化镁0.2 份、硫酸钠0.8份、硫酸锰0.3份、甘露醇1.2份、磷酸二氢钾0.3份、磷酸氢二钠0.2份、三羟甲 基氨基甲烧盐酸盐2份和纯化水100份；
[0046] 6)静置噬菌体液2h;
[0047] 7)将步骤6)中的噬菌体液转接到体积200倍的新鲜噬菌体培养基中，于40°C条件 下振荡培养16h，得到大规模高效价噬菌体液；
[0048] 8)所述大规模高效价噬菌体液于12000g离心10min;
[0049] 9)上清液经过0.45μπι滤膜，得大规模高效价噬菌体悬液。
[0050] 实施例3
[0051] -种高效价分歧杆菌噬菌体的生产方法，步骤在5%的湿度条件下完成，包括以下 步骤：
[0052] 1)冻存的分歧杆菌噬菌体母液按照体积比1:1.5加入到分歧杆菌菌液中，混合均 匀;所述噬菌体母液中噬菌体的滴度为1 〇9PFU/mL;
[0053] 2)将上述混合液于37°C温度下，以100r/min的速度振荡培养15min;
[0054] 3)将步骤2)的混合液均匀涂布在固体培养基上，于37°C条件下倒置培养10h;所述 固体培养基以重量组分计，包括以下组分:胰蛋白胨0.9份、酵母膏粉1份、琼脂糖1.5份、乳 糖0.5份、氯化钠0.6份、氯化钾0.3份、硫酸镁0.9份、磷酸氢二钠0.2份和去离子水100份；
[0055] 4)将固体培养基上的单一菌落溶解于0.8mL的噬菌体缓冲液中，置于4°C条件下 3.5h，并每间隔25min摇晃3次，得噬菌体母液;所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下 组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10份、氯化钠0.1份、氯化钾3份、硫酸镁10份、磷酸氢二钾2 份、磷酸二氢钠10份、明胶0.08份和去离子水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH 至 IJ7.2;
[0056] 5)噬菌体母液加入母液体积500倍的噬菌体培养基中，于37°C条件下振荡培养2h， 振荡速度为200r/min，每间隔25min取样检测0D值，培养至0D58Q值为0.4;上述的噬菌体培养 基以重量组分计，包括以下组分:牛肉膏5份、蛋白胨10份、酵母膏粉1份、葡萄糖0.8份、乳糖 1.2份、梓檬酸钠0.3份、梓檬酸铁0.2份、硫代硫酸钠0.5份、氯化钙0.8份、氯化镁0.1份、硫 酸钠0.7份、硫酸锰0.2份、甘露醇1份、磷酸二氢钾0.2份、磷酸氢二钠0.1份、三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐1份和去离子水100份；
[0057] 6)静置噬菌体液lh;
[0058] 7)将步骤6)中的噬菌体液转接到体积100倍的新鲜噬菌体培养基中，于37 °C条件 下振荡培养12h，得到大规模高效价噬菌体液；
[0059] 8)所述大规模高效价噬菌体液于10000g离心15min;
[0060] 9)上清液经过0.22μπι滤膜，得大规模高效价噬菌体悬液。
[0061 ] 实施例4
[0062] -种高效价大肠杆菌噬菌体的生产方法，步骤在6%的湿度条件下完成，包括以下 步骤：
[0063] 1)冻存的大肠杆菌噬菌体母液按照体积比1:2加入到大肠杆菌菌液中，混合均匀； 所述噬菌体母液中噬菌体的滴度为10 6PFU/mL;
[0064] 2)将上述混合液于35°C温度下，以120r/min的速度振荡培养20min;
[0065] 3)将步骤2)的混合液均匀涂布在固体培养基上，于37°C条件下倒置培养10h;所述 固体培养基以重量组分计，包括以下组分:胰蛋白胨1.2份、酵母膏粉1.5份、琼脂糖2份、乳 糖0.6份、氯化钠0.5份、氯化钾0.4份、硫酸镁1份、磷酸氢二钠0.1份和纯化水100份；
[0066] 4)将固体培养基上的单一菌落溶解于lmL的噬菌体缓冲液中，置于4°C条件下3h， 并每间隔30min摇晃3次，得噬菌体母液;所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分： 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15份、氯化钠0.05份、氯化钾3份、硫酸镁10份、磷酸氢二钾1份、磷 酸二氢钠12份、明胶0.05份和纯化水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7; [0067] 5)噬菌体母液加入母液体积800倍的噬菌体培养基中，于32°C条件下振荡培养4h， 振荡速度为260r/min，每间隔20min取样检测0D值，培养至OD55Q值为0.5;上述的噬菌体培养 基以重量组分计，包括以下组分:牛肉膏8份、蛋白胨12份、酵母膏粉0.8份、葡萄糖1份、乳糖 1份、梓檬酸钠0.4份、梓檬酸铁0.1份、硫代硫酸钠0.5份、氯化钙0.6份、氯化镁0.05份、硫酸 钠0.8份、硫酸锰0.3份、甘露醇0.8份、磷酸二氢钾0.2份、磷酸氢二钠0.1份、三羟甲基氨基 甲烧盐酸盐2份和纯化水100份；
[0068] 6)静置噬菌体液2h;
[0069] 7)将步骤6)中的噬菌体液转接到体积100倍的新鲜噬菌体培养基中，于35°C条件 下振荡培养14h，得到大规模高效价噬菌体液；
[0070] 8)所述大规模高效价噬菌体液于12000g离心10min;
[0071 ] 9)上清液经过0.45μπι滤膜，得大规模高效价噬菌体悬液。
[0072] (1)对实施例1-4的噬菌体进行效价测定
[0073]采用Adams双层平板法，使用稀释1000倍的噬菌体液和处于增殖对数期的宿主菌 按照体积比1:2,混匀后铺双层平板，静置45min后，倒置于37°C恒温箱中培养8h，测定噬菌 斑数，并评价效价。（参考文献：Adams MH · Bacteriophages .New York: Interscience Publishers，1959.)。如表1所示，实施例1-4的噬菌体效价均在109PFU/mL以上。
[0074]表1噬菌体效价测定
[0075]
[0076] (2)对实施例1-4的噬菌体进行温度稳定性测定
[0077] 将107PFU/mL的实施例1-4中的噬菌体液分别于50 °C、60 °C、70 °C的水浴中保温 30min，采用双层琼脂平板法测定噬菌斑数，进一步测定存活率。如图1所示，经70°C处理 30min后，噬菌体完全失活，经60°C处理30min后，65%以上的噬菌体存活，而经过经50°C处 理30min后，80%以上的噬菌体存活，热稳定性好。
[0078]以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:包括以下步骤： 1) 冻存的噬菌体母液按照体积比1:1-2加入到菌液中，混合均匀； 2) 将上述混合液于32-40°C温度下，以80-120r/min的速度振荡培养10-20min; 3) 将步骤2)的混合液均匀涂布在固体培养基上，于32-40 °C条件下倒置培养8-16h; 4) 将固体培养基上的单一菌落溶解于噬菌体缓冲液中，置于3-6°C条件下3-4h，并每间 隔20-30min摇晃2-3次，得噬菌体母液； 5) 噬菌体母液加入母液体积200-1000倍的噬菌体培养基中，于32-40°C条件下振荡培 养0.5-4h，每间隔20-30min取样检测OD值，培养至OD 55Q-6QQ值为0.2-0.5; 6) 静置噬菌体液0.5-2h; 7) 将步骤6)中的噬菌体液转接到体积20-200倍的新鲜噬菌体培养基中，于32-40°C条 件下振荡培养8_16h，得到大规模高效价噬菌体液； 8) 所述大规模高效价菌体液于8000-12000g离心10_20min; 9 )上清液经过0.22-0.45μπι滤膜，得大规模高效价噬菌体悬液； 上述的噬菌体培养基以重量组分计，包括以下组分： 牛肉膏4-8份、蛋白胨5-12份、酵母膏粉0.8-1.2份、葡萄糖0.6-1份、乳糖1-1.6 份、柠檬酸钠0.2-0.5份、柠檬酸铁0.1-0.3份、硫代硫酸钠0.2-0.8份、氯化钙0.6-1.2 份、氯化镁0.05-0.2份、硫酸钠0.6-0.8份、硫酸锰0.1-0.3份、甘露醇0.8-1.2份、磷酸 二氢钾0.03-0.3份、磷酸氢二钠0.05-0.2份、三轻甲基氨基甲烧盐酸盐0.6-2份和水100 份。2. 根据权利要求1所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述固体培养基以重 量组分计，包括以下组分:蛋白胨0.8-1.2份、酵母膏粉0.8-1.5份、琼脂糖1-2份、乳糖 0.3-0.6份、氯化钠0.3-0.8份、氯化钾0.1-0.5份、硫酸镁0.5-2份、磷酸氢二钠0.1-0.3 份和水100份。3. 根据权利要求1所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述噬菌体母液中噬 菌体的滴度为106_10 12PFU/mL。4. 根据权利要求1所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述振荡速度为150-260r/min〇5. 根据权利要求1所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述噬菌体缓冲液以 重量组分计，包括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8-15份、氯化钠0.05-0.2份、氯化 钾1-5份、硫酸镁5-20份、磷酸氢二钾1-3份、磷酸二氢钠8-12份、明胶0.05-0.1份和水 100份，并且调节pH到7-7.5。6. 根据权利要求1或2所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述蛋白胨为胰 蛋白胨。7. 根据权利要求1或2或5所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述的水为去 离子水或纯化水。8. 根据权利要求2所述的高效价噬菌体的生产方法的制备方法，其特征在于:使用稀盐 酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。9. 根据权利要求1所述的高效价噬菌体的生产方法，其特征在于:所述步骤在4-6%的湿 度条件下完成。
【文档编号】C12N7/00GK106085967SQ201610415392
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610415392.7, CN 106085967 A, CN 106085967A, CN 201610415392, CN-A-106085967, CN106085967 A, CN106085967A, CN201610415392, CN201610415392.7
【发明人】许维素, 宋增福, 陈彪
【申请人】苏州埃瑞特生物技术有限公司