基于双发射量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备方法与流程

本发明属于纳米材料和荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于双发射量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备方法，其制备的探针可用于霜脲氰的高效检测。

背景技术：

霜脲氰是一种高效，低毒的杀菌剂，广泛用于黄瓜、葡萄、蕃茄、荔枝等蔬菜与水果的保鲜和储存中。霜脲氰通常与其它农药混合使用，以加强农药的药效。人体每天从蔬菜水果中摄取营养来满足身体需要，瓜果蔬菜中的残留农药会对人类健康造成危害。少量残留的农药人体自身会降解，不会引起急性中毒，但长期食用没有清洗干净带有残留农药的农产品，会对人体健康带来严重危害。霜脲氰广泛用于水果与蔬菜中，在果皮中极易检测出它的残留。农药残留可通过挥发、径流、淋溶等方式分散在水体中，霜脲氰对水生生物也具有极高的毒性，会对水体环境产生长期的不良影响。在欧盟农残限量标准中，霜脲氰最大加入量为0.05毫克/千克，人体过量摄入霜脲氰会导致身体免疫力下降，加重肝脏负担，导致胃肠道疾病，在严重情况下甚至会导致癌症。不合理添加霜脲氰可引发了一系列的安全问题，因此，对霜脲氰进行定量检测具有重要的意义。

anne-claire等采用三种色谱法检测了霜脲氰(pesticideresiduesinraspberriesandlettuce:extrectionandcomparisionofthreechromatographicmethods:hplc,hptlcandgc,anne-clairemartel,mauriceporthault,j.liq.,chrom.&rel.technol.,2000,23,3043–3058)；mattj.等利用气相色谱法检测了霜脲氰(developmentofagaschromatographicmethodforfungicidecymoxanilanalysisindriedhops,mattj.hengel,takayukishibamoto,j.agric.foodchem.,2001,49,570–573)；hulyamercan等利用溶出伏安法检测了农药中霜脲氰含量(determinationofcymoxanilfungicideincommercialformulationandnaturalwaterbysquare-wavestrippingvoltammetry,hulyamercan,recaiclean-soil,air,water2010,38,558–564)。在当前检测霜脲氰的方法中，主要使用色谱分析法，如高液相色谱法(hplc),高效液相色谱-质谱联用法(hplc-ms)和气相色谱法(gc),其它方法包括超声辅助提取法，微波辅助提取法，红外光谱法(ftir)等。使用色谱法时存在检测限较差，许多样品的谱线可能会重叠，无法特异性识别。其它方法也存在一些缺陷，如仪器昂贵，成本高，样品预处理复杂，操作要求高等。

荧光分析法是一种依据特定物质的荧光谱线的位置及其强度来进行物质鉴定和含量测定的仪器分析方法。该方法具有高灵敏性，高选择性，操作简便等诸多优点。在农药检测方面，荧光分析法具备分析灵敏度高，选择性好，操作简便等优点。在当前的荧光检测农药报道中，主要利用荧光量子点与农药的相互作用，引起量子点荧光强度变化来检测农药，这种方法依赖于单一荧光信号输出模式。单一荧光信号检测方法，易受到背景荧光、试剂、系统和环境条件等因素的影响，从而导致测定结果的不稳定性。相比而言，采用双信号比值处理获得信号的强度比率，可具备自校准功能，有效消除了自体和背景信号的干扰，提高了检测结果的准确性和可靠性。基于此，本发明设计了一种基于双发射量子点/银纳米粒复合物的新型比率荧光探针方法，用于霜脲氰的高效检测。截止目前，尚未有采用比率荧光探针方法检测霜脲氰，以及基于双发射量子点/银纳米粒复合物的比率荧光探针来检测霜脲氰的国内外文献和专利的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，设计一种方法简单、成本低廉、灵敏度高的基于双发射碳量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备方法。

为了实现上述目的，本发明涉及的一种基于双发射碳量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备工艺包括以下步骤：

1.一种基于双发射碳量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

(1)银纳米粒的制备：配制100毫摩尔/升的硝酸银，250毫摩尔/升的柠檬酸三钠和5毫摩尔/升的硼氢化钠，将配制好的硝酸银和柠檬酸三钠加入到100毫升二次蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入1毫升硼氢化钠溶液，搅拌反应30分钟后得到黄色溶液，将此溶液离心，乙醇洗涤和低温真空干燥处理，得到银纳米粒，制备的银纳米粒在4℃下避光保存，以供后续实验使用；

(2)碳量子点的制备：将54.5毫克3-氨基苯酚和32.0毫克草酸加入到50毫升二次蒸馏水中，在磁力搅拌下混合均匀，然后在水浴加热下反应，得到透明均质混合溶液，将此溶液转移到高压反应釜中，在180℃加热12小时，反应结束后，将产物溶液冷却至室温，用0.22μm滤膜过滤去除大颗粒杂质，滤液经过旋蒸除水，丙酮和乙醇交替洗涤两次，再进行冷冻干燥处理，直至水份全部蒸出，制备的碳量子点粉末在室温下保存，以供进一步使用；

(3)将步骤(1)制得的银纳米粒配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下反应10分钟，形成银纳米粒均质溶液；

(4)将步骤(2)制得的碳量子点配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下，加入银纳米粒溶液，配置含不同银纳米粒浓度的碳量子点溶液，在磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同银纳米粒浓度下，碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与银纳米粒浓度之间的线性关系；

(5)向步骤(4)制得的含银纳米粒的碳量子点水溶液中加入霜脲氰，磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同的霜脲氰摩尔浓度下，均质溶液中碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与霜脲氰摩尔浓度之间的线性关系，构建出用于霜脲氰检测的比率荧光探针。

本发明涉及的步骤(1)中所述的银纳米粒尺寸为5～20纳米，硝酸银体积用量为100～500微升，柠檬酸三钠体积用量为100～500微升；步骤(2)中所述的碳量子点尺寸为1～10纳米；步骤(3)中所述的银纳米粒质量浓度为0.1～1.0微克/毫升；步骤(4)中所述的碳量子点配制成水溶液的质量浓度为0.1～1.0微克/毫升，银纳米粒质量浓度为0.01～0.2微克/毫升，碳量子点与银纳米粒的质量浓度比为1:5～5:1；步骤(5)中所述的含有银纳米粒的碳量子点溶液与霜脲氰的质量浓度比为1:5～5:1，霜脲氰摩尔浓度的线性检测范围为0.01～1.0微摩尔/升，霜脲氰摩尔浓度的检测极限为0.01～0.5微摩尔/升。

本发明与现有技术相比，采用双发射碳量子点和分散的银纳米粒之间发生内滤效应，引起碳量子点的蓝色荧光淬灭，而霜脲氰与银纳米粒发生特异性结合，导致银纳米粒聚集，双发射碳量子点和分散的银纳米粒之间发生内滤效应，引起碳量子点的绿色荧光淬灭。基于此，建立了碳量子点两个荧光发射峰强度比率与霜脲氰摩尔浓度之间的线性关系，构建出用于霜脲氰检测的比率荧光探针；其制备工艺简单，制备成本低，产品灵敏度高，能够发展成为一种新颖的霜脲氰比率荧光探针，用于农药中霜脲氰的高效检测。

附图说明：

图1为本发明涉及的一种基于双发射碳量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备与霜脲氰比率荧光探针检测的原理示意图；

图2为本发明涉及的霜脲氰比率荧光探针随霜脲氰摩尔浓度增大对双发射碳量子点两个荧光发射峰强度信号的响应，以及荧光峰强度比率与霜脲氰摩尔浓度之间的线性关系。

具体实施方式：

下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

为本发明涉及的一种基于双发射碳量子点/银纳米粒复合物的霜脲氰比率荧光探针的制备与霜脲氰比率荧光信号检测，其制备工艺与原理示意图如图1所示，其具体工艺步骤为：

银纳米粒的制备：配制100毫摩尔/升的硝酸银，250毫摩尔/升的柠檬酸三钠和5毫摩尔/升的硼氢化钠，将配制好的硝酸银和柠檬酸三钠加入到100毫升二次蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入1毫升硼氢化钠溶液，搅拌反应30分钟后得到黄色溶液，将此溶液离心，乙醇洗涤和低温真空干燥处理，得到银纳米粒，制备的银纳米粒在4℃下避光保存，以供后续实验使用。

碳量子点的制备：将54.5毫克3-氨基苯酚和32.0毫克草酸加入到50毫升二次蒸馏水中，在磁力搅拌下混合均匀，然后在水浴加热下反应，得到透明均质混合溶液，将此溶液转移到高压反应釜中，在180℃加热12小时，反应结束后，将产物溶液冷却至室温，用0.22μm滤膜过滤去除大颗粒杂质，滤液经过旋蒸除水，丙酮和乙醇交替洗涤两次，再进行冷冻干燥处理，直至水份全部蒸出，制备的碳量子点粉末在室温下保存，以供进一步使用。

将制得的平均尺寸为5纳米的银纳米粒配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下反应10分钟，形成银纳米粒均质溶液，将制得的平均尺寸为2纳米的碳量子点配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下，加入银纳米粒溶液，配置含不同银纳米粒浓度的碳量子点溶液，在磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同银纳米粒浓度下，碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与银纳米粒浓度之间的线性关系，其中，银纳米粒和碳量子点的质量浓度分别为0.1～0.5微克/毫升和0.01～0.1微克/毫升。

向制得的含银纳米粒的碳量子点水溶液中加入霜脲氰，磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同的霜脲氰摩尔浓度下，均质溶液中碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与霜脲氰摩尔浓度之间的线性关系，构建出用于霜脲氰检测的比率荧光探针，在不同霜脲氰摩尔浓度下测定碳量子点荧光发射光谱，拟合两个荧光发射峰强度比率i425/i525与霜脲氰浓度ccym之间的线性关系(参见图2)即i425/i525＝0.7180+1.7922ccym(r²＝0.9920)，其中霜脲氰浓度范围为0.05～0.50微摩尔/升，霜脲氰检测极限为0.02微摩尔/升。

实施例2：

本实施例中银纳米粒与碳量子点制备的具体工艺步骤同实施例1，其中加入的硝酸银和柠檬酸三钠的体积用量较实施例1有所增加，将制得的平均尺寸为10纳米的银纳米粒配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下反应10分钟，形成银纳米粒均质溶液，将制得的平均尺寸为5纳米的碳量子点配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下，加入银纳米粒溶液，配置含不同银纳米粒浓度的碳量子点溶液，在磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同银纳米粒浓度下，碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与银纳米粒浓度之间的线性关系，其中，银纳米粒和碳量子点的质量浓度分别为0.2～0.8微克/毫升和0.02～0.2微克/毫升，向制得的含银纳米粒的碳量子点水溶液中加入霜脲氰，磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同的霜脲氰摩尔浓度下，均质溶液中碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与霜脲氰摩尔浓度之间的线性关系，构建出用于霜脲氰检测的比率荧光探针，在不同霜脲氰摩尔浓度下测定碳量子点荧光发射光谱，拟合两个荧光发射峰强度比率i425/i525与霜脲氰浓度ccym之间的线性关系，其中霜脲氰浓度范围为0.02～0.5微摩尔/升，霜脲氰检测极限为0.01微摩尔/升。

实施例3：

本实施例中银纳米粒与碳量子点制备的具体工艺步骤同实施例1，其中加入的硝酸银和柠檬酸三钠的体积用量较实施例1有所增加，将制得的平均尺寸为15纳米的银纳米粒配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下反应10分钟，形成银纳米粒均质溶液，将制得的平均尺寸为8纳米的碳量子点配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下，加入银纳米粒溶液，配置含不同银纳米粒浓度的碳量子点溶液，在磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同银纳米粒浓度下，碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与银纳米粒浓度之间的线性关系，其中，银纳米粒和碳量子点的质量浓度分别为0.5～1.0微克/毫升和0.05～0.2微克/毫升，向制得的含银纳米粒的碳量子点水溶液中加入霜脲氰，磁力搅拌下反应20分钟形成均质溶液，测定不同的霜脲氰摩尔浓度下，均质溶液中碳量子点的荧光发射光谱，拟合碳量子点两个荧光发射峰强度比率与霜脲氰摩尔浓度之间的线性关系，构建出用于霜脲氰检测的比率荧光探针，在不同霜脲氰摩尔浓度下测定碳量子点荧光发射光谱，拟合两个荧光发射峰强度比率i425/i525与霜脲氰浓度ccym之间的线性关系，其中霜脲氰浓度范围为0.05～1.0微摩尔/升，霜脲氰检测极限为0.05微摩尔/升。