一种H+改性的红色荧光金纳米团簇及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光检测材料，具体是一种h⁺改性的红色荧光金纳米团簇及其制备方法和应用。

背景技术：

fe³⁺在许多的生理和病理过程(包括细胞代谢，酶催化和氧运输)中具有重要的作用。体内fe³⁺的缺乏会限制细胞的氧输送，从而导致低血压，免疫力下降和贫血。但是过量的fe³⁺会导致环境污染，在人体内会产生活性氧，导致核酸、蛋白质和脂质的损伤。

作为常见的食品防腐剂，添加剂和缓蚀剂，亚硝酸盐已广泛应用于饮用水，食品和环境系统。然而，人体内亚硝酸盐过高会加速血红蛋白不可逆氧化成高铁血红蛋白，从而导致血红蛋白失去携氧能力，体内缺氧。此外，亚硝酸盐与胺反应形成有毒和致癌的亚硝胺。过量的亚硝酸盐不仅对环境是致命的，而且还对人类健康产生不良影响。因此，开发快速，灵敏，方便的fe³⁺和亚硝酸盐检测技术具有重要意义。

已经开发出多种检测方法，如色谱，荧光分光光度法，毛细管电泳和电化学方法，用于fe³⁺和亚硝酸盐检测。然而，大多数报道的检测技术涉及一些缺陷，例如使用有毒试剂，复杂的仪器，样品制备繁琐且耗时，昂贵的成本和有限的选择性。相比之下，荧光探针具有操作简单，快速，灵敏度高，成本低等优点，更有利于fe³⁺和亚硝酸盐的检测。

目前，金纳米团簇的合成主要是通过还原剂将haucl4中au³⁺还原成au⁺，然后与封端配体之间形成au-s键来合成发荧光的auncs。在这个过程中，还原剂和封端配体的种类和用量会影响auncs的尺寸和发射波长。由于这种合成方法比较单一，限制了多样性的金纳米团簇的制备。为了解决这个问题，研究者们在已有的金纳米团簇的基础上外加不同的修饰基团，得到了与原金纳米团簇的物理和化学性质不同的新型金纳米团簇。由于外加修饰的基团的种类不尽相同，引起的auncs的物理和化学性质的变化也不相同，这影响了auncs进一步的应用。

本发明以鸡蛋清为模板的金纳米团簇(auncs@ew)为基础，通过h⁺修饰制备了发红色荧光的h⁺改性的金纳米团簇(auncs@ew/h⁺)。将其成功应用于特异性识别fe³⁺和no2^-，细胞成像。更重要的是auncs@ew/h⁺可有效用于食品中亚硝酸盐的检测，为与亚硝酸盐有关的疾病预防提供了新的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种h⁺改性的发红色荧光的金纳米团簇及其制备方法和应用，所述制备方法简单、快速；制得的纳米团簇可检测铁离子，检测亚硝酸根离子，并用于实际样品中如肉制品中no2^-的含量检测。

本发明提供的一种红色荧光的h⁺改性的金纳米团簇的制备方法，包括如下步骤：

取蛋清于烧杯中，加入适量的水，搅拌5-10min后，将其收集置于离心机中以7000rpm离心10-20min，并收集上清液，最后将其定容至蛋清体积的25倍得到蛋清溶液。配置haucl4的水溶液(2.5mm)按体积比2:1将它们混合，搅拌3-5min，然后向其中加入naoh调节ph至11后移至微波装置中，90℃下反应20-40min即得到auncs@ew。

将所制备的auncs@ew溶液，加入不同的酸(hcl，hac或h2so4)将ph调节至2-3，然后放入微波反应器中密封，90℃下反应至少10min。反应完成后，将反应后的混合物离心去沉淀，得到强烈红色荧光发射h⁺改性的金纳米团簇(auncs@ew/h⁺)。之后放入4℃冰箱备用。

所述的auncs@ew溶液，加入不同的酸(hcl，hac或h2so4)后ph优选为3。

所述的，auncs@ew加入h⁺后，所述的微波反应器中反应条件优选为90℃下10min。

上述制备的发红色荧光的h⁺改性的金纳米团簇可应用于检测铁离子以及亚硝酸根离子，也可用于检测实际样品如食品中no2^-的含量。

与现有技术相比本发明的有益效果：本发明的h⁺改性的金纳米团簇荧光强，反应时间短，反应条件绿色无污染；auncs@ew/h⁺显示出对阳离子fe³⁺以及阴离子no2^-的快速灵敏检测；并可用于实际样品如市场上销售的肉制品中no2^-含量的检测。

附图说明

图1为不同ph条件对auncs@ew/h⁺荧光的影响。其中：a、在不同ph条件下合成auncs@ew/h⁺的荧光光谱图，b、在不同ph条件下合成auncs@ew/h⁺的荧光强度折线图，c、在不同ph条件下合成auncs@ew/h⁺的上清液(顶部)和沉淀(底部)在紫外灯照射下的照片。

图2为auncs@ew/h⁺的荧光图。其中：a、auncs@ew/h⁺荧光激发和发射光谱，b、auncs@ew和auncs@ew/h⁺的荧光发射光谱，c、auncs@ew/h⁺(1)和auncs@ew(2)的水溶液在可见光(顶部)和紫外光(底部)下的照片。

图3为auncs@ew和auncs@ew/h⁺的固体在可见光(1,3,5,7)和紫外光(2,4,6,8)下的照片。其中：a、auncs@ew，b、auncs@ew/hac，c、auncs@ew/hcl，d、auncs@ew/h2so4。

图4auncs@ew/h⁺的表征。其中：a、auncs@ew和auncs@ew/h⁺的紫外可见吸收光谱，b、auncs@ew和auncs@ew/h⁺的ftir光谱，c、auncs@ew/h⁺的xrd图。

图5tem图像。其中：a、auncs@ew的tem图像，b-d、auncs@ew/h⁺在不同比例尺下的tem图像。

图6粒径分布图。其中：a、auncs@ew，b、auncs@ew/hcl，c、auncs@ew/h2so4，d、auncs@ew/hac。

图7auncs@ew/h⁺和auncs@ew的粒径分布和zeta电位柱状图。其中：a、粒径分布柱状图，b、zeta电位图。

图8不同ph条件下的发射光谱(a-c)和荧光强度折线图(d-f)。其中：a和d、auncs@ew，b和e、auncs@ew/hcl，c和f、auncs@ew/hac。

图9auncs@ew/h⁺的相对荧光强度(f/f0，其中f和f0分别是有和没有金属离子(0.1mm)的auncs@ew/h⁺的荧光强度)。其中a、auncs@ew/hcl(插图为紫外灯照射下在auncs@ew/hcl溶液中添加不同的金属离子的照片)，b、auncs@ew/hac，c、auncs@ew/h2so4。

图10通过金属离子淬灭和i^-恢复auncs@ew/h⁺的荧光强度的示意图。

图11auncs@ew/hcl对铁离子的灵敏度。其中：a、不同浓度的fe³⁺加入到auncs@ew/hcl中的的荧光发射光谱，b、用不同浓度的fe³⁺与auncs@ew/hcl的荧光强度(f0-f)图，c、相对荧光强度与fe³⁺浓度的线性图。

图12auncs@ew/hac对铁离子的灵敏度。其中：a、不同浓度的fe³⁺加入到auncs@ew/hac中的的荧光发射光谱，b、用不同浓度的fe³⁺与auncs@ew/hac的荧光强度(f0-f)图，c、相对荧光强度与fe³⁺浓度的线性图。

图13auncs@ew/h⁺的相对荧光强度(f/f0，其中f和f0分别是有和没有阴离子(0.1mm)的auncs@ew/h⁺的荧光强度)。其中：a、auncs@ew/hcl(插图为紫外灯照射下在auncs@ew/hcl溶液中添加不同的金属离子的照片)，b、auncs@ew/hac，c、auncs@ew/h2so4，d、auncs@ew。

图14auncs@ew/hcl对no2^-的灵敏度。其中：a、不同浓度的no2^-加入到auncs@ew/hcl中的的荧光发射光谱，b、用不同浓度的no2^-与auncs@ew/hcl的荧光强度(f0-f)图，c、相对荧光强度与no2^-浓度的线性图。

图15auncs@ew/hac对no2^-的灵敏度。其中：a、不同浓度的no2^-加入到auncs@ew/hac中的的荧光发射光谱，b、用不同浓度的no2^-与auncs@ew/hac的荧光强度(f0-f)图，c、相对荧光强度与no2^-浓度的线性图。

图16hepg2细胞与auncs@ew/h⁺孵育不同时间后的荧光显微镜成像。

具体实施方式

以下为实施例中使用的材料：

四氯金酸(haucl4·4h2o，分子量为411.9)为上海展云化学试剂厂生产

肉制品(双汇润口香肠王(玉米风味肠)，双汇王中王(优级火腿肠)，三只松鼠猪肉铺，贤哥老坛酸菜鱼仔，无穷烤鸡小腿(蜂蜜味))在太原市场上购买

各种阳离子(mg²⁺，pb²⁺，k⁺，cd²⁺，cr³⁺，bi³⁺，zn²⁺，na⁺，al³⁺，ca²⁺，ag⁺，mn²⁺，ba²⁺，cu²⁺，co²⁺，ni²⁺，hg²⁺)和阴离子(i^-，cl^-，so4^2-，br^-，s2o3^2-，ac^-，no^3-，co3^2-，no^2-，c2o4^2-，f^-，so3^2-)

实施例1

称取四氯金酸(haucl4·4h2o)，在避光的容器中配制2.5mm浓度的haucl4溶液；取蛋清于烧杯中，加入适量的水，搅拌10min后，将其收集置于离心机中以7000rpm离心20min，并收集上清液，最后将其定容至蛋清体积的25倍得到蛋清溶液。将鸡蛋清和haucl4的水溶液按体积比2:1将它们混合，然后在室温下搅拌5分钟，用naoh溶液将混合溶液的ph调节至11后，将溶液置于微波反应器中并密封，90℃下反应30min得到auncs@ew溶液。

根取lml所制备的auncs@ew溶液，加入不同的酸(hcl，hac或h2so4)将ph调节至3，然后放入微波反应器中密封在90℃下反应10min。反应完成后，将反应后的混合物离心去沉淀，得到具有强烈红色荧光的淡黄色溶液auncs@ew/h⁺。(图1为制备材料时改变ph以确定最佳的反应ph)

实施例2

h⁺改性的金纳米团簇(auncs@ew/h⁺)荧光表征。

取200μl制得的auncs@ew/h⁺溶液加入800μl二蒸水进行稀释，测定荧光发射曲线。图2a显示出具有强烈红色荧光auncs@ew/h⁺的最佳激发波长在380nm处，最佳发射波长在640nm处。与auncs@ew相比，加入h⁺改性后的金纳米团簇最佳发射峰由660nm蓝移至640nm，并且荧光增强(图2b)。图2c为可见光和紫外灯照射下auncs@ew和auncs@ew/h⁺水溶液的照片。

实施例3

auncs@ew/h⁺的固体在日光灯和紫外灯下的照片。

将auncs@ew以及加入不同酸获得的auncs@ew/hac，auncs@ew/hcl和auncs@ew/h2so4用冷冻干燥机干燥成粉末，分别在日光灯和365nm的紫外灯下拍照。

auncs@ew和auncs@ew/h⁺的固体在可见光和紫外灯下的照片，可以看出auncs@ew/hcl和auncs@ew/hac的固体表面有光亮的晶体。与之不同的是，加入h2so4后的auncs@ew/h2so4没有光亮晶体，并且颜色相较于auncs@ew/hcl和auncs@ew/hac来说更暗，这可能是由于h2so4中的硫原子以sp3杂化轨道成键，硫原子位于四面体的中心位置上，很容易与金属离子结合造成的。而auncs@ew表面类似蛋白质疏松多孔结构，且没有光亮的晶体。这些结果最初证实了auncs@ew/h⁺的形成。

实施例4

auncs@ew/h⁺的结构表征。

分别取200μl制得的auncs@ew和auncs@ew/h⁺溶液加入800μl二蒸水进行稀释，测定紫外吸收曲线。

图4a中的紫外可见光谱中auncs@ew/h⁺在280nm处有明显的吸收峰，而auncs@ew在280nm处并没有明显的吸收。

将所制得的auncs@ew/h⁺液体经过冷冻干燥器干燥得到固体。分别取auncs@ew与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱；接着取所制得的auncs@ew/h⁺与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱。

图4b显示了auncs@ew/h⁺和auncs@ew(红色)的ftir光谱。与auncs@ew相比auncs@ew/hcl在787nm^-1处吸收峰增加，这是由于c-cl的振动。而auncs@ew/h2so4在617nm^-1和1174nm^-1处吸收增强并且吸收峰变宽，这是由于so4^2-基团吸附到auncs@ew的表面。同样的，ch3coo^-的存在导致auncs@ew/hac在1398nm^-1处吸收明显增强。

为了观察所制得的auncs@ew/h⁺的晶型状态，将所制得的auncs@ew/h⁺液体样品经过冷冻干燥器干燥得到固体，并研磨制样测量。

图4c中的xrd图谱显示auncs@ew/h⁺的特征衍射峰位于31.8°，45.3°对应于晶格面(111)和(200)，偏离了典型的纯au面心立方(fcc)相应的衍射峰。65.9°和75.0°的两个峰对应于衍射指数(220)和(311)。这些表明auncs@ew/h⁺是面心立方(fcc)结构。

实施例5

auncs@ew/h⁺的形貌表征。

为了确认auncs@ew/h⁺形貌，将auncs@ew/h⁺溶液超声半小时滴在铜网上制样，待液体挥发，用透射电镜进行观察。

图5为auncs@ew和auncs@ew/h⁺的透射电镜(tem)图。与auncs@ew的tem相比，auncs@ew/h⁺的形状近似球形，且粒径明显变大，这是由于h⁺的加入导致团簇本身的严重聚集。从图5d中可以看出auncs@ew/h⁺的表面有晶格，晶格间距为0.25±0.016nm，归因于石墨的(100)晶面，说明其类似于石墨结构。

实施例6

auncs@ew/h⁺的动态光散射(dls)表征。

将auncs@ew/h⁺溶液超声放入马尔文粒度仪中测量粒径。

我们用dls分析其粒径大小。如图6所示，auncs@ew的平均粒径为4.187±0.32nm，经h⁺修饰后auncs@ew/hcl的尺寸增加到约326.2±5.38nm。同样的，auncs@ew/h2so4和auncs@ew/hac的粒径分别增加到213.99±6.12nm和173.3±4.56nm，这显示出用h⁺修饰后auncs@ew/h⁺的粒径明显变大。其中，图6中显示在横坐标靠近原点处，有一小部分超小粒径分布的团簇，这可能是表面没有吸附上h⁺的auncs@ew。

实施例7

auncs@ew/h⁺的粒径分布和zata电位柱状图。

将auncs@ew/h⁺溶液超声放入马尔文粒度仪中测量zata电位。

图7a为这auncs@ew/h⁺粒径分布的柱状图，这结果和tem结果一致。图7b为auncs@ew和auncs@ew/h⁺的电位图。auncs@ew的电位为-19.2±1.89mv，经h⁺修饰后auncs@ew/hcl，auncs@ew/h2so4和auncs@ew/hac的电位分别增加至22.5±1.62mv，20±1.35mv和23.6±2.07mv。h⁺修饰后电位由负值变为正值，这是由于h⁺附着在团簇表面造成的。

实施例8

auncs@ew/h⁺的ph稳定性。

分别取100μl的auncs@ew或auncs@ew/h⁺溶液，将其滴入到2ml不同ph的hepes缓冲溶液中，用荧光光谱仪测量荧光光谱。

图8a显示auncs@ew仅在中性条件下稳定，而auncs@ew/hcl在ph3-12范围稳定，auncs@ew/hac在ph2-9范围内稳定(图4.8b和4.8c)。

实施例9

阳离子选择性检测。

用hepes溶液将所制备的auncs@ew/h⁺稀释10倍。通过添加10μl0.1m各种金属阳离子(mg²⁺，pb²⁺，k⁺，cd²⁺，cr³⁺，bi³⁺，zn²⁺，na⁺，al³⁺，ca²⁺，ag⁺，mn²⁺，ba²⁺，cu²⁺，co²⁺，ni²⁺，hg²⁺)到1ml的auncs@ew/h⁺溶液中。1分钟后记录荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm。

如图9a所示，通过添加hg²⁺和fe³⁺使auncs@ew/hcl在640nm处的荧光强度猝灭。紫外灯照射下在auncs@ew/hcl溶液中添加不同金属离子的的照片(图9a插图)也显示auncs@ew/hcl对hg²⁺和fe³⁺的高特异性，而auncs@ew/hcl的荧光几乎不受其他阳离子的影响。同样的auncs@ew/hac和auncs@ew/h2so4也显示出对hg²⁺和fe³⁺的特异性识别(图9b和9c)。

实施例10

hg²⁺的掩蔽。

由于hg²⁺易于和i^-配位形成[hgi4]^2-，在这里我们用掩蔽剂i^-将hg²⁺掩蔽来检测fe³⁺。用hepes溶液将所制备的auncs@ew/h⁺稀释10倍，在稀释后的auncs@ew/h⁺溶液中加入10μl0.1m的i^-、hg²⁺和fe³⁺，然后再在加入10μl0.1m的hg²⁺和fe³⁺溶液中加入10μl0.1m的i^-分别测其荧光强度。

如图10所示，加入i^-后忽略hg²⁺对其淬灭作用，检测fe³⁺对auncs@ew/h⁺的荧光强度的影响。

实施例11

auncs@ew/hcl对fe³⁺的检测。

将auncs@ew/hcl溶液用hepes缓冲溶液稀释10倍，加入各种浓度的fe³⁺标准溶液。1分钟后记录荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm。

根据图11a和11b，auncs@ew/hcl的荧光强度随着fe³⁺浓度的增加而逐渐淬灭。fe³⁺在0-6.5nm，6.5-90nm以及0.09-138μm的范围内auncs@ew/hcl的相对荧光强度与fe³⁺浓度之间呈直线关系(图11c)，检出限为1.4nm(r²＝0.96)。

实施例12

auncs@ew/hac对fe³⁺的检测。

将auncs@ew/hac溶液用hepes缓冲溶液稀释10倍，加入各种浓度的fe³⁺标准溶液。1分钟后记录荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm。

根据图12a和12b，auncs@ew/hac的荧光强度同样地随着fe³⁺浓度的增加而逐渐淬灭。fe³⁺在0-65.4nm以及12-34μm的范围内，auncs@ew/hac的相对荧光强度与fe³⁺浓度之间呈直线关系(图12c)，检出限为23nm(r²＝0.99)。

实施例13

阴离子选择性检测。

用hepes溶液将所制备的auncs@ew/h⁺稀释10倍。通过添加10μl0.1m各种阴离子(i^-，cl^-，so4^2-，br^-，s2o3^2-，ac^-，no^3-，co3^2-，no^2-，c2o4^2-，f^-，so3^2-)到1ml的auncs@ew/h⁺系统进行阴离子选择性研究。

如图13a所示，通过添加no2^-使auncs@ew/hcl在640nm处的荧光强度显著猝灭，而其他阴离子对auncs@ew/hcl的荧光基本没有影响。紫外灯照射下在auncs@ew/hcl溶液中添加不同金属离子的的照片(图13a插图)也显示auncs@ew/hcl对no2^-的高特异性。同样的auncs@ew/hac和auncs@ew/h2so4也显示出对no2^-的特异性识别(图13b和13c)。作为对照组，auncs@ew对阴离子no2^-没有选择性(图13d)。这可能是由于h⁺加载到auncs@ew/h⁺的表面，使其表面正电荷增加。由于auncs@ew/h⁺表面的正电荷与no2^-的负电荷静电作用，使no2^-附着在auncs@ew/h⁺的表面，从而导致荧光淬灭。

实施例14

auncs@ew/hcl对no2^-的检测。

将auncs@ew/hcl溶液用hepes缓冲溶液稀释10倍，加入各种浓度的no2^-标准溶液。1分钟后记录荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm。

根据图14a和14b，随着no2^-浓度的增加，auncs@ew/hcl的荧光强度逐渐减弱直至淬灭。当no2^-的浓度在0-24nm以及0.5-60μm的范围内时，auncs@ew/hcl的相对荧光强度与no2^-浓度之间呈线性关系(图14c)，检出限为2.83nm(r²＝0.99)。

实施例15

auncs@ew/hac对no2^-的检测。

将auncs@ew/hac溶液用hepes缓冲溶液稀释10倍，加入各种浓度的no2^-标准溶液。1分钟后记录荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm。

根据图15a和15b，auncs@ew/hac的荧光强度同样随着no2^-浓度的增加而逐渐淬灭。no2^-的浓度在100-385nm，0.4-125μm以及0.125-1.66mm的范围内，auncs@ew/hac的相对荧光强度与no2^-浓度之间的呈线性关系(图15c)，检出限为102nm(r²＝0.97)。

实施例16

auncs@ew/hac对实际样品中no2^-的检测

在市场上购买双汇润口香肠王(玉米风味肠)，双汇王中王(优级火腿肠)，三只松鼠猪肉铺，贤哥老坛酸菜鱼仔，无穷烤鸡小腿(蜂蜜味)，将其分别剁碎。各取8g剁碎的肉末加入8ml的二蒸水，超声30min，将亚硝酸盐充分溶于水中。然后离心取上清液，再过滤3次。将得到的液体逐滴加入到auncs@ew/h⁺溶液中(用水溶液作对照)，1分钟后记录荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm。

通过计算得到了这五种肉制品中亚硝酸盐的含量(表1)。由于我国规定肉制品中亚硝酸钠添加剂的残留量不得超过30mg/kg(gb5009.33-2010)，以上五种肉类食品的测定结果均低于国家标准，因此正常食用对人体不会造成任何伤害，但贤哥老坛酸菜鱼仔的no2^-含量相对较高，无穷烤鸡小腿的no2^-含量最低，其余三者几乎相似。

表1食品中亚硝酸盐的含量

实施例17

将hepg2细胞以1.0×10⁵个细胞的密度接种到35mm培养皿中。培养20小时后，将auncs@ew/h⁺(1mg/ml)加入培养皿中与细胞共同孵育一段时间，并用荧光显微镜拍照。

如图16所示荧光场有明亮的红色荧光，并且6h后细胞形态良好，荧光不褪色。重叠场显示了auncs@ew/h⁺在细胞内的分布，可以看出auncs@ew/h⁺分布在细胞质中，没有进入细胞核。这进一步显示出auncs@ew/h⁺在生物标记方面的潜在应用。