外径~35mm)的内表面上。可使涂层干燥任何合适 的时间（例如在室温下约1小时）再将其放置到容纳上文描述的腈垫圈的35mm孔中。这一 装配件在0. 5mm阶梯（例如暴露的腈垫圈）上方提供了超疏水的壁表面（例如138、1138)。
[0198] 或者，当将具有PTFE嵌入物的35mm孔放置到旋转平台上（该旋转平台与垂线偏 离约1°至约5°从而使得孔底的平面与旋转轴垂直）时，可产生疏水覆盖表面。可将涂覆 溶液--例如10%硅氧烷溶液（1 &〇1?^061168"6920和交联剂￥90)涂覆（例如约250 1^ 每孔）到内侧壁上并同时以合适的速度（例如约Irpm至约25rpm，任选地约8rpm)旋转孔。 优选地，防止硅氧烷溶液溢流过嵌入物及接触孔底。
[0199] 可将所述孔旋转任何合适的时间段以使涂覆溶液中足量的溶剂蒸发。例如，旋转 可持续约5分钟以上以蒸发大部分或所有的溶剂。然后可使用任何合适的固化方法固化涂 层，所述固化方法包括本文中描述的那些。
[0200] 在其中物理表面特征与容器是整体形成的实例（例如在图3和4中所示的）中，可 将涂覆材料直接涂覆到容器的内表面。根据一种方法，可形成其中每个孔均有阶梯式内表 面的孔板（参见图3或4)。任选地，所述孔可包括约I. 25_高的垂直面（第一表面137) 和紧接着每个孔底的内周的约〇. 75mm宽的水平阶梯面142。
[0201] 可将所述板在阶梯面142上方用任何合适的涂覆材料涂覆，所述涂覆材料包括， 例如，基于疏水性硅氧烷的涂料（Dehesive?,Wacker,Germany)和基于超疏水性纳米颗粒 的涂料（FluoroPel,Cytonix,USA)。可将基于硅氧烷的涂料作为含有硅氧烷单体、交联剂和 催化剂的无溶剂溶液制备。基于纳米颗粒的涂料可以全氟聚醚溶剂中的合适的浓度由制造 商提供并且以供货的形式使用。
[0202] 可以任何合适的方法涂覆涂料。任选地，可将涂料根据下文描述的两种方法中的 一种涂覆，或者以任何其它合适的方法涂覆。本文中描述的两种方法均意欲帮助减少涂覆 材料接触孔底的机会。在两种方法中，可将涂料涂覆到其板底偏离垂线约5°的板上以及 该板在板底的平面中旋转的板上。优选地，涂料不到达孔的底部上，这是因为疏水性孔底可 能会造成孔中的液体从壁处缩回，从而形成强烈凹陷的弯月面并减小所覆盖的总的孔底面 积。这继而可能会对孔的成像有光干扰。
[0203] 根据一种涂料涂覆方法，可将涂覆材料（例如基于硅氧烷的涂料）在己烷中稀释 到适合于使粘度降低以有助于展着于孔壁表面上的一定浓度。将涂覆材料涂覆到每个孔的 壁上，同时以约8rpm(或约Irpm至25rpm或以上的任何合适的速率）的速率旋转。可将 合适体积（例如约200yL)的涂覆材料经过合适的时间段--包括例如孔旋转约1/4至约 3/4转的时间段一一涂覆到每个孔。优选在旋转的时候将涂覆材料加入到水平孔壁上的最 低点（例如阶梯面142)。可选择涂料的粘度和旋转的速度以使得在旋转时涂覆材料的量 会流下来并且均匀分散于表面142上。该方法可以使溶剂蒸发并且可以有助于围绕在阶梯 142、1142上方的第一表面138、1138的周界提供均匀的涂层，同时有助于限制涂覆材料移 动到阶梯面142下方的第二表面140U140上。可以使板旋转合适的时间段，例如约5-30 分钟，以通过蒸发帮助除去残余的溶剂。然后可将板转移到烘箱中以在合适的条件下固化， 所述合适的条件例如为在约70°C下固化至少2小时，从而在阶梯表面142的上方提供固体 的疏水或超疏水膜而在阶梯表面142的下方有少量或没有涂覆材料。
[0204] 根据另一种涂料涂覆，将合适涂覆材料的无溶剂配制物（例如硅氧烷/交联剂/ 催化剂溶液）经通过任何合适的装置分配而直接涂覆到容器壁上，所述装置包括例如连接 到具有挠性管的蠕动栗上的移液枪头。与上文中的方法一样，可将板放置于使得板底的平 面（例如平面108、1108)大致垂直（例如在垂线的约0-5度范围内）的方向，然后将其围 绕与板底垂直的轴旋转。可调整移液枪头以在孔壁上的最低点并偏离水平阶梯面（142)约 2_处分配涂料。可在孔围绕着其旋转轴旋转的期间分配涂覆溶液。
[0205] 在涂覆所述涂覆溶液时，可将板同时从枪头处移开从而将具有合适螺距（优选约 1.5至2mm的螺距）的涂覆溶液的连续螺旋珠涂覆到容器壁上。在这一过程中，所述孔可以 旋转合适的次数，例如约1至约10次，优选约4次，从而在涂覆溶液的分配停止之前使12 到60yL(优选20到25iiL)的涂覆材料沉积到容器壁上。然后可将板放置于大致水平的 方向并且可以使涂覆材料沉降所需的时间，例如最高到约2小时以上。在沉降期间，涂覆溶 液的螺旋珠可分配成孔壁上的连续膜。涂覆膜的厚度可以变化并且所述涂覆膜在孔底的方 向上可以较厚，其中一些涂覆材料在阶梯面（142)上聚集。沉降后，可将涂层如本文中所描 述的进行固化。
[0206] 实施例1:在亮视野图像中测定弯月面
[0207]通过使用STEMvision?(Stemcell Technologies Inc, Canada)遵循推荐的图像捕 捉过程捕捉约ImL液体在6孔板中的亮视野图像。这一过程包括标准化照明强度和焦点位 置的步骤。通过使用数字图像处理方法测量弯月面下的暗面积。然后作为弯月面下的暗面 积除以孔底总面积（不包括阶梯面）计算弯月面％。
[0208] 实施例2--涂覆圆柱形嵌入物
[0209] 用聚苯乙烯定做制造用于标准6孔板的嵌入物。嵌入物为大体上圆柱形，其高为 约lcm，壁厚度为约0.5mm且外径与标准6孔板中孔的内径相匹配。一些嵌入物另外由围绕 在圆柱的一端等距离相隔的3-5个杆（post)制造。这些杆约Imm高，用以使嵌入物的整个 边缘保持接触孔底。
[0210] 将硅氧烷的聚合物的涂料（Syl-off?Q2-7785 (单体）、Syl-off?Q2-7560 (交联 剂），DowCorning)涂覆到嵌入物上。制备含有Syl-off单体（33% -99%w/w)和交联剂 (1% -67%w/w)的涂覆溶液并将其在己烷中稀释到适合均匀涂覆嵌入物表面的粘度。使用 两种方法将所述涂料涂覆到嵌入物上。在第一种方法中，将嵌入物浸入涂覆溶液的容器中 以完全覆盖嵌入物，然后将所述嵌入物放置于一个表面上以使多余的涂料流走约5至30分 钟。然后将所述嵌入物放入6孔板的孔中并在70°C下固化至少2小时。在第二种方法中， 将嵌入物首尾相连堆叠于直径稍大于嵌入物的管中，然后将其围绕着管的轴旋转数分钟并 同时将每个嵌入物约330yL的溶液加入到管中。随着管的旋转，所述溶液涂覆每个嵌入物 的壁。管的长度足够容纳约15个嵌入物。将所述溶液在旋转期间通过盖住管的末端而保 存在管内。所述管以Srpm旋转20分钟以使己烷蒸发。然后将嵌入物放置到6孔板的孔 中，一次放一个。接着将整个板在70°C下固化至少2小时。使用己烷以降低硅氧烷的粘度 以使得其在旋转时会从嵌入物壁流下来。具有较低粘度的硅氧烷可以不需要溶剂。
[0211] 具有经涂覆的嵌入物的孔使得在造血祖细胞的半固体培养基细胞培养 测定中的弯月面显著地降低。在每个孔中加入约ImL的Methocult?(Stemcell Technologies,Canada)并将板置于湿化培养箱中7天。然后将板如在实施例1中所述成像 并分析。图7示出了按照本实施例的第二种涂料涂覆方法制得的n= 72孔的孔的弯月面 覆盖％。为了进行比较，在标准的未经处理的6孔聚苯乙烯板中的弯月面％为29%。
[0212] 实施例3--涂覆阶梯状嵌入物
[0213] 在该实施例中，阶梯状特征由围绕35mm孔的内周界的水平阶梯面142组成，该阶 梯状特征通过将嵌入物放入孔的内部形成。所述嵌入物或者由腈垫圈制成，所述腈垫圈使 得阶梯面142宽度为Imm且阶梯面142与孔底106间的距离为Imm;或者由PTFE薄片条制 成，所述PTFE薄片条使得阶梯面142宽度为约Imm且阶梯面142与孔底106间的距离为 0.5mm。可将所述嵌入物紧靠Greiner6071026孔板的孔底放置。用疏水或超疏水材料涂 覆在阶梯特征上方的内壁表面。
[0214] 超疏水覆盖表面：将WX2100(CytonixLLC，MD)喷射到高度为IOmm且厚度为0.5mm 的聚苯乙烯环（外径~35mm)的内表面上。使涂层在室温下干燥约1小时，再将其放置到 上文描述的容纳腈垫圈的35mm孔中。这一装配件在0.5mm阶梯（暴露的腈垫圈）上方构 成了超疏水的壁表面。
[0215] 疏水覆盖表面：将具有PTFE嵌入物的35mm孔放置到旋转平台上，该旋转平台与 垂线偏离约1°至约5°，从而使得孔底的平面与旋转轴垂直。将10%硅氧烷溶液（Wacker Dehesive920和交联剂V90)涂覆（约250yL每孔）到内侧壁上并同时以8RPM旋转。不 得使所述硅氧烷溶液溢流过嵌入物及接触孔底。旋转持续5分钟以蒸发所有溶剂。然后将 涂层在70°C下固化约2小时。
[0216] 为了评价弯月面降低，将足以使液体水平面与水平突出部分特征相持平的一定体 积（约ImL)的MethoCult?置于经处理的孔中。将所述孔旋转以展着基质并溢流过阶梯特 征以接触围绕整个孔周界的经处理的表面。将所述孔置于湿化培养箱中5天。在温育前和 温育后对板进行如实施例1中所描述的成像和分析。结果总结于下表中，该结果示例说明 了疏水涂层和超疏水涂层产生了可忽略不计的弯月面面积。
[0218] 实施例4一一将涂料涂覆到阶梯状板上
[0219]用聚苯乙烯定做制备图3中的其中每个孔里均有一体阶梯物的6孔板。所述阶梯 物具有约I. 25mm高的垂直面（第一表面137)和紧接着每个孔底的内周的约0. 75mm纵深 的水平阶梯面142。
[0220] 然后将所述板在阶梯面上方用或基于疏水性硅氧烷的涂 料（Dehesive?,Wacker,Germany)或基于超疏水性纳米颗粒的涂料 (FluoroPel,Cytonix,USA)涂覆。将基于硅氧烷的涂料作为硅氧烷单体（90-99%w/w)、交 联剂（〇. 5% -10%w/w)和催化剂（1% -4%w/w)的无溶剂溶液制备。基于纳米颗粒的涂 料以在全氟聚醚溶剂中的合适的浓度由制造商提供并且以供货的形式使用。
[0221] 以两种方法中的一种涂覆涂料，所述两种方法均意欲使涂料接触孔底的机会最 小。在两种方法中，将涂料涂覆到其板底偏离垂线约1°至5°的板上以及该板在板底的平 面中旋转的板上。优选地，涂料不到达孔的底部上，这是因为疏水性孔底可能会造成孔中的 液体从壁处缩回，从而形成强烈凹陷的弯月面并减小所覆盖的总的孔底面积。这继而对孔 的成像有光干扰。
[0222] 对于第一种涂料涂覆方法，将基于硅氧烷的涂料在己烷中稀释到适合于使粘度降 低以有助于展着于孔壁表面上的一定浓度。将涂料用手动移液枪涂覆到每个孔的壁上，同 时以8RPM的速率旋转。将约200yL体积的涂料经过孔旋转约1/4至3/4转的时间段涂覆 到每个孔。将涂料加入到水平孔壁上的最低点。设置涂料的粘度和旋转的速度以使得在旋 转时涂料的量会流下来并且均匀分散于壁上。该方法使溶剂蒸发以围绕在阶梯上方的壁周 界提供了均匀的涂层，同时避免涂料移动到阶梯面下方。使所述板旋转5-30分钟，以通过 蒸发除去残余的溶剂，从而围绕在阶梯上方的孔壁留下均匀的涂层。然后可将所述板转移 到70°C的烘箱中固化至少2小时，从而在阶梯表面的上方得到固体的疏水或超疏水膜而在 阶梯表面的下方没有涂料。
[0223] 第二种涂料涂覆方法用于评价基于硅氧烷的疏水涂层。在该方法中，将硅氧烷/ 交联剂/催化剂溶液的无溶剂配制物经通过连接到具有挠性管的蠕动栗上的移液枪头分 配而直接涂覆到孔壁上。与上文中的方法一样，将所述板放置于使得板底的平面大致垂直 的方向，然后将其围绕与板底垂直的轴旋转。调整移液枪头以在孔壁上的最低点并偏离水 平阶梯面（142)约2_处分配涂料。随着孔围绕着其轴旋转，开始分配涂覆溶液。将所述板 同时从枪头处移开从而涂覆涂料的螺距为1. 5至2_的连续螺旋珠。孔旋转4次以在涂覆 溶液的分配停止之前沉积12到60yL的涂覆材料。然后将所述板放置于水平方向的桌子 上并且使涂料沉降最高达2小时。这使得涂覆溶液的螺旋珠分散到孔壁上的连续膜，所述 连续膜的厚度在孔壁的底部方向上变厚，其中一些涂料在阶梯的上表面（142)上聚集。肉 眼定性估计涂层的厚度。通过将蓝色染料HolcosilLSRBlue加入到涂覆材料（Holland C〇l〇Urs，VA)中来协助定性估计。约20至25yL体积的涂料产生了最均匀的涂层并且没有 造成所述涂料溢流过阶梯面（142)。在沉降后，将涂层在烘箱中于70°C下固化至少2小时。
[0224] 用两种方法中的任一种涂覆了疏水材料和超疏水材料的阶梯状孔板（就疏水性 硅氧烷涂层的情况而言），在使用半固体细胞培养基时使弯月面显著地降低。在每个孔中加 入约ImL的Methocult?(Stemcell Technologies, Canada)并将所述板置于湿化培养箱中 7至12天。然后将所述板如在实施例1中所述地成像并分析。
[0225] 对于第一种涂料涂覆方法，Cytonix和Dehesive涂覆材料在温育箱中温育7天和 12天后的以孔面积的百分比形式表示的弯月面幅度均为0%，而缺少阶梯特征的经硅氧烷 涂覆的对照孔在温育后示出了 3 %的弯月面面积％。在另外的对照中，没有涂层的阶梯状孔 在温育后示出了 29%的弯月面面积％。因此，涂层与阶梯特征的结合比只有阶梯特征产生 更好的弯月面降低结果。涂层与阶梯特征的结合比只有涂层也产生更好的弯月面降低结果 (如图7中所示）。
[0226] 图8示出了按照本实施例第二种涂料涂覆方法制备的n= 206孔的以孔的覆盖％ 的形式表示的弯月面幅度。弯月面面积％的中值（median)为0.3%。同样，使用第二种涂 覆方法涂覆的涂料与阶梯特征的结合比只有阶梯特征和只有涂料产生更好的弯月面降低 结果。这些结果表明涂料和阶梯特征可以相互配合以得到完全的弯月面降低。
[0227] 上文所描述的内容意在示例说明本发明而非限制性的，本领域的技术人员应该理 解在不脱离本文所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下可以做出其它变型和变化。 权利要求的范围不应该限于优选的实施方案和实施例，而是应该给出与说明书作为一个整 体来看所一致的最宽的解释。
【主权项】
1. 弯月面降低构件，其在用于容纳液体的容器中使用，所述弯月面降低构件包括： a) 物理表面特征，其覆盖了所述容器的内表面的至少一部分以接合所述容器中液体的 自由表面，所述物理表面特征包括第一内表面和第二内表面，二者大致相互平行并彼此间 隔开；并且包括至少一个第三表面，该第三表面在第一表面和第二表面之间延伸，第三表面 与第一内表面和第二内表面相交，第一内表面、第二内表面和第三表面的构造物理性地改 变液体与所述物理表面特征之间的后退接触角；和 b) 涂覆材料，其被涂覆到所述物理表面特征的第一内表面、第二内表面和第三表面中 的至少一个表面上，所述涂覆材料的构造化学性地改变液体与涂覆了所述涂覆材料的所述 物理表面特征的第一内表面、第二内表面和第三表面中的至少一个表面之间的后退接触 角，借此，在液体与所述弯月面降低构件的第一内表面之间