过滤方法

专利名称：过滤方法
技术领域：
本发明涉及蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序中的蛋白制剂中间制品的过滤 方法以及该方法中使用的病毒清除过滤器。
背景技术：
由于担心在抗体药品、重组蛋白药品、血浆制剂、血浆分级制剂等蛋白制剂中混入 来源于原料、来源于工序的病毒，因而在制造这些蛋白制剂的过程中需要对病毒进行失活 或者清除。
作为可能会混入蛋白制剂中的病毒的失活方法，可以进行加热处理或使用化学药 品的处理等，但仅通过这些单独的处理病毒的失活并不充分，另外这些方法可能会使蛋白 制剂中的有用蛋白质本身变性。在此背景下，作为不伴随化学变性的物理性病毒消除方法， 使用过滤膜来分离清除病毒。
作为病毒清除用的过滤膜，已知有由纤维素之类的天然材料形成的膜、或者由聚 偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PEQ之类的合成高分子材料形成的病毒清除膜(非专利文献 1 4)。
利用装填了这些病毒清除膜的病毒清除装置进行的蛋白制剂中间制品的过滤，希 望能够在短时间内过滤更多量的蛋白质，并且能够以充分高的病毒清除性能清除病毒。但 实际上，例如纤维素膜在即使20mg/ml以上的蛋白质浓度下也能够进行过滤而不易发生膜 堵塞，但耐压性低，实际使用压力只能提高到IOOkPa左右，或者，合成高分子膜虽然耐压性 高、实际使用压力即使提高到300kPa左右也没问题，但若蛋白质浓度提高至20mg/ml左右 则存在引起膜的堵塞、造成无法过滤的问题。因此，一般只能进行10mg/ml以下的低浓度下 的过滤(专利文献1)。
从这些理由来看，在使通过各种色谱法或超滤法等纯化工序浓缩了的、高蛋白质 浓度的蛋白制剂中间制品在高压下流过病毒清除装置的过滤条件下的过滤方法的研究并 没有进展，另外适用于该方法的病毒清除过滤器的开发也没有进展。
另外蛋白制剂中间制品是用于制造蛋白制剂的贵重材料，且在制造规模中确定病 毒清除工序的过滤方法、运转条件在时间上经济上都伴随着困难，因此本发明人强烈意识 到，预先在小规模中确定了病毒清除工序的过滤方法、蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度、病 毒清除过滤器的入口压力、和/或过滤时间的运转条件，并将其应用于放大后的蛋白制剂 的制造工序的重要性。
专利文献1 日本特开2004-277323号公报
非专禾Ij文献 1 :Manabe. S,Removal of virus through novelmembrane filtration method.，Dev. Biol. Stand.，(1996)88 :81-90.
__专禾Il文献2 Brandwein H等· ,Membrane filtration for virus removal. ,Dev Biol(Basel).，(2000) 102 :157-63.
非专利文献 3 :Aranha-Creado 等，Clearance of murine leukaemia virus from monoclonalantibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter., Biologicals. (1998) Jun ； 沩⑵ J67-72.
非专利文献4 :LMoce-Llivina等,Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes infiltering viral suspensions, Journal of Virological Methods, (2003)April, Vol. 109，Issue 1，Pages 99—101.发明内容
发明要解决的问题
鉴于上述问题，本发明的课题在于提供在使高蛋白质浓度的蛋白制剂中间制品在 高压力下流过病毒清除过滤器的条件下的、蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的过滤方 法，并提供该方法中使用的病毒清除过滤器。
用于解决问题的方案
本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过使用下述过滤方法， 能够确定放大(scale up)至工业规模时的蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度、病毒清除过滤 器的入口压力、和/或过滤时间这些运转条件，对病毒清除工序设备的设计也有用，从而完 成了本发明。所述过滤方法使用下述病毒清除过滤器，在蛋白制剂中间制品的入口压力为 150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白过滤速度为1. 0kg/m2/Hr以上的条件下，向该病毒清 除过滤器中流过通过纯化工序使蛋白质浓度提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白 制剂中间制品，且过滤时间为1小时以上且5小时以下，从而得到病毒清除率LRV彡3的蛋 白制剂中间制品的滤液。所述病毒清除过滤器具有至少分别有一个蛋白制剂中间制品的入 口和出口的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器内空间被病毒清除膜分隔为蛋白制剂 中间制品的入口侧空间和出口侧空间，蛋白制剂中间制品的入口、出口中至少入口为具有 600kPa以上耐压性的嵌合结构的喷嘴，病毒清除膜的有效膜面积为0. OOOlm2以上且0. 03m2 以下。
即本发明包括以下。
[1] 一种过滤方法，其是将蛋白制剂中间制品在规定的蛋白质浓度及压力下流过 病毒清除过滤器的过滤方法，其中，
(1)使用下述病毒清除过滤器具有至少分别有一个蛋白制剂中间制品的入口 和出口的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器内空间被病毒清除膜分隔为蛋白制剂 中间制品的入口侧空间和出口侧空间，蛋白制剂中间制品的入口、出口中至少入口为具有 600kPa以上耐压性的嵌合结构的喷嘴，病毒清除膜的有效膜面积为0. OOOlm2以上且0. 03m2 以下，
(2)在蛋白制剂中间制品的入口压力为以上且eOOltfa以下、平均蛋白过滤 速度为1. 0kg/m2/Hr以上的条件下，向该病毒清除过滤器中流过通过纯化工序使蛋白质浓 度提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白制剂中间制品，且过滤时间为1小时以上且 5小时以下，
(3)得到病毒清除率LRV彡3的蛋白制剂中间制品的滤液。
[2]根据[1]所述的过滤方法，向[1]所述的病毒清除过滤器中，
(4)在蛋白制剂中间制品的入口压力为以上且eOOltfa以下、平均蛋白过滤速度为1.0kg/m7Hr以上的条件下，流过通过纯化工序使蛋白质浓度提高到20mg/ml以上 且100mg/ml以下的蛋白制剂中间制品，且过滤时间为3小时以上且5小时以下，
(5)得到病毒清除率LRV彡3的蛋白制剂中间制品的滤液。
[3]根据[1]或[2]所述的过滤方法，病毒是选自细小病毒科、逆转录病毒科、黄病 毒科、呼肠孤病毒科、副粘病毒科、疱疹病毒科、小核糖核酸病毒科、乳多空病毒科中的任一 种病毒。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的过滤方法，蛋白制剂中间制品中的蛋白质为免 疫球蛋白。
[5]根据[4]所述的过滤方法，免疫球蛋白为免疫球蛋白G。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的过滤方法，病毒清除膜由经亲水化的合成高分 子形成。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的过滤方法，病毒清除膜为中空纤维型病毒清除膜。
[8] 一种方法，其采用[1]至[7]中任一项所述的过滤方法的蛋白质浓度和入口压 力条件作为放大时的运转条件。
[9]根据[8]所述的方法，其还采用[1]至[7]中任一项所述的过滤方法的过滤时 间作为放大时的运转条件。
[10] 一种病毒清除过滤器，其是用于[1]至[7]中任一项所述的过滤方法中的病 毒清除过滤器，其具有至少分别有一个蛋白制剂中间制品的入口和出口的容器和用于清除 病毒的病毒清除膜，容器内空间被病毒清除膜分隔为蛋白制剂中间制品的入口侧空间和出 口侧空间，蛋白制剂中间制品的入口、出口中至少入口为具有600kPa以上耐压性的嵌合结 构的喷嘴，病毒清除膜的有效膜面积为0. OOOlm2以上且0. 03m2以下。
[11]根据[10]所述的病毒清除过滤器，病毒清除膜为中空纤维型病毒清除膜。
[12]根据[10]或[11]所述的病毒清除过滤器，其中，病毒清除膜是具有开孔率大 的粗大结构层和开孔率小的致密结构层、且含有热塑性树脂的微多孔膜，该粗大结构层至 少存在于一侧的膜表面，其厚度为5. Ομπι以上，该致密结构层的厚度为膜厚度总体的50% 以上，并且该病毒清除膜是该粗大结构层和该致密结构层一体化而成的多层微多孔膜。
发明的效果
通过使用本发明的过滤方法，能够确定在使高蛋白质浓度的蛋白制剂中间制品在 高压力下流过病毒清除过滤器的条件下的、蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的运转条 件。即预先在小规模下确定了病毒清除工序的过滤方法、蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度、 病毒清除过滤器的入口压力、和/或过滤时间的运转条件，能够将其应用于放大后的蛋白 制剂的制造工序。放大只需与蛋白制剂中间制品的体积增加比率成比例地增加病毒清除过 滤器的膜面积即可。
另外作为附加的效果，还用于进一步改善蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序， 而且，还能够用于设计能够以更短时间制造更大量的蛋白制剂的病毒清除工序。
具体实施方式
确定蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的运转条件时，重要的项目为蛋白制剂6中间制品的平均蛋白过滤速度和病毒清除率。过滤速度通常与蛋白质浓度呈负相关，若蛋 白质浓度变高则过滤速度降低，因此所花费的过滤时间长，是不优选的。为了降低蛋白质浓 度而追加稀释工序，在设备方面也会造成成本增加，是不优选的。为了在蛋白质浓度为高浓 度的状态下进行过滤而不降低过滤速度，前提是病毒清除过滤器自身的耐压为600kPa以 上，只要使用以下的病毒清除过滤器即可，该病毒清除过滤器具有至少分别有一个入口和 出口的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器内空间被病毒清除膜分隔为蛋白制剂中间 制品的入口侧空间和出口侧空间，入口的结构为设有具有600kPa以上耐压性的嵌合结构 的喷嘴。
在此所说的设有具有600kPa以上耐压性的嵌合结构的喷嘴，例如有鲁尔锁定 (Luer lock)式喷嘴、或一触式(one touch)连接喷嘴(例如SMC公司制造的hch-size One-touch Mini.Inch-size One-Touch fittings、0ne_touch Mini (以上注册商标)等)、 接头(coupler)式喷嘴、卡套(ferrule)式喷嘴等，这些喷嘴均可以使用。除这些以外，只 要是能不漏液地送进滤液、且设有具有600kPa以上耐压性的嵌合结构的喷嘴，当然能够适 用于本发明。
另外，病毒清除膜的有效膜面积需要在0.0001m2以上且0.03m2以下。若大于 0. 03m2，则过滤中所需的蛋白制剂中间制品的量变为大量，因此产生评价成本增加的问题。 另一方面，若有效膜面积减小至低于0. 0001m2，则产生如下问题过滤量变少，用于评价病 毒清除性能的蛋白制剂中间制品的体积过小，难以对病毒进行定量。因此，0.0001m2以上 且0. 03m2以下是合适的。优选为0. 0003m2以上且0. 02m2以下，更优选为0. 0005m2以上且 0. Olm2以下，最优选为0. 0007m2以上且0. 002m2以下。
另外，病毒清除膜的有效膜面积是指病毒清除膜的表面积中蛋白制剂中间制品能 够通过的部分的面积。病毒清除膜为中空纤维的情况下，从中空纤维的内侧向外侧过滤时， 是指中空纤维内侧的表面积中蛋白制剂中间制品能够通过的部分的面积；从中空纤维的外 侧向内侧过滤时，是指中空纤维外侧的表面积中蛋白制剂能够通过的部分的面积。另外，病 毒清除膜为平板膜的情况下，是指流入蛋白制剂中间制品一侧的表面的表面积中蛋白制剂 中间制品能够通过的部分的面积。
病毒清除膜的有效膜面积的调整具有以下特征在中空纤维型过滤器中，通过增 减中空纤维的根数能够容易地实现放大(scale up)和缩小(scale down)，由于放大和缩小 时不存在大的干扰因素，因此容易得到可缩放性(scalability)。即，可认为在中空纤维型 过滤器的情况下，当膜面积改变时，则仅过滤体积发生改变，而能够维持过滤性能。由膜面 积改变而造成的影响即为由滤液增减而造成的影响。如前所述，若过少，则对病毒的定量产 生不利影响，若过多，则对操作的便利性和成本带来影响。平板膜的情况下，显著的放大虽 改变膜的形状(由圆盘型到筒型等)，但也认为只带来同样的影响。蛋白制剂制造工序中的 病毒清除工序的工序设计能够通过小规模实施，而无需实际生产规模，这依赖于这样的可 缩放性的可靠性。
作为病毒清除过滤器，可以利用具有前述结构的过滤器。膜的形状可以利用平 板膜结构或中空纤维结构的膜，优选为中空纤维结构的膜。作为膜的材质，可以利用具有 600kPa以上耐压性的物质。例如，优选以聚偏氟乙烯(PVDF)或聚醚砜(PES)、聚砜(PS)这 样的合成高分子作为材料的、具有亲水性的膜。重要的一点是具有600kPa以上耐压性这点ο
作为使以合成高分子作为材料的膜具有亲水性的方法，已知有使具有一个乙烯基 的亲水性乙烯基单体在微多孔膜的微孔表面以3%以上且50%以下的接枝(graft)率进 行接枝聚合的方法(国际公开第2004/035180号小册子)、介由交联剂使由多官能度丙烯 酸酯或甲基丙烯酸酯形成的高分子结合的方法(日本特开2000-1548号公报)、以及使含 有聚合引发剂和亲水性单体的溶液浸渍于膜中而在微孔中进行聚合的方法(国际公开第 91/16968号小册子)等多种方法。使之具有亲水性的目的在于，提高以疏水性的合成高分 子作为材料的膜的蛋白制剂中间制品的过滤性。因此，使之具有亲水性的方法不限于在此 列举的例子。
另外，在此所说的接枝率由下述式子所定义。
接枝率(％) = 100XK接枝后的膜质量-接枝前的膜质量)/接枝前的膜质量}
膜的结构优选为沿着蛋白制剂中间制品流动的方向，上游侧存在孔径大且空孔 率高的粗大结构层，下游侧存在孔径小而适于清除病毒的致密结构层，粗大结构层和致密 结构层的连接为孔径连续地变化的梯度结构。
另外，更加优选的膜的结构优选为多层微多孔膜，其是具有开孔率大的粗大结构 层和开孔率小的致密结构层、且含有热塑性树脂的微多孔膜，该粗大结构层至少存在于一 侧的膜表面，其厚度为5. 0 μ m以上，该致密结构层的厚度为膜厚度总体的50%以上，并且 该粗大结构层和该致密结构层处于一体化的状态。
另外，前述粗大结构层优选为部分开孔率由膜表面向致密结构层连续减少的倾斜 结构，并且仅存在于膜表面的一侧。该膜可以按照例如日本特开平11-319522号公报、或日 本特开平9-169867号公报、国际公开第2004/035180号小册子中公开的方法进行制造。
作为评价中使用的病毒，能够从可能混入到蛋白制剂中的相关病毒或特异性模型 病毒、非特异性模型病毒中任意地选择。在此所说的相关病毒、特异性模型病毒、非特异性 模型病毒的定义与日美欧药品注册国际协调会议(ICH)准则中所记载的定义相同。即，相 关病毒是指与已知在蛋白制剂的制造工序中使用的细胞基材、其他的试剂类或各种物质 中共存的或可能存在的病毒的种类相同或同种的病毒。特异性模型病毒是指与已知存在 的、或怀疑存在的病毒密切相关的病毒。即被定义为相同属或科的病毒，其与检测出的病毒 或怀疑存在的病毒具有相似的物理和化学性质。非特异性模型病毒被定义为用于病毒清除 工序特性解析试验中的病毒，所述试验是为了分析制造工序在病毒的清除或失活方面通常 具有何种程度的能力、即为了分析工序可靠地发挥病毒清除能力方面的特性(robustness) 而进行的。
例如，制剂为单克隆抗体等由来自于小鼠的基材而制造的情况下，作为相关病毒 或特异性模型病毒，可以使用小鼠白血病病毒等逆转录病毒、小鼠微小病毒(minute virus of mice, MVM)等细小病毒、牛腹泻病毒等黄病毒。作为非特异性模型病毒，可以将猪细小 病毒等细小病毒作为最小尺寸的病毒模型而使用。
另外，制剂为血浆分级制剂等由来自于人血浆的基材而制造的情况下，作为相关 病毒，可以使用人细小病毒B19(细小病毒科)或HIV病毒(逆转录病毒科)等；作为B19 特异性模型病毒可使用猪细小病毒(细小病毒科)；作为丙型肝炎病毒特异性模型病毒可 使用牛腹泻病毒(黄病毒科)等。同样地只要从单纯疱疹病毒、假性狂犬病病毒等疱疹病毒科、或副流感病毒等副粘病毒科、呼肠孤病毒3型等呼肠孤病毒科、脊髓灰质炎病毒等小 核糖核酸病毒科、SV40病毒等乳多空病毒科等中选择使用即可。关于使用病毒的选择，应 该根据ICH等公知要求事项来确定。
将一定量的这些用于评价的病毒添加到蛋白制剂中间制品中，测定利用病毒清除 过滤器过滤前后的病毒量，从而测定病毒清除性能评价。此时添加的病毒量可以由必要的 病毒清除率逆运算而求出。但是，共存于病毒溶液中的混杂物(杂质)可能引起过滤器网眼 堵塞，可能会对过滤试验产生弊病，因而希望根据该病毒溶液的纯度调整添加的病毒量。病 毒溶液被纯化的情况下，相对于蛋白制剂中间制品的体积可以添加10%体积以下的病毒溶 液，优选为至5%体积以下，更优选为体积以下，但未被纯化而含有很多混杂物的情况 下，希望添加体积以下、优选为0.5%体积以下、更优选为0. 体积以下的很少的量。 但是，希望添加能够检测到LRV ^ 3的必要最低限的量以上体积的病毒溶液。
另外，在此所言的病毒清除率LRV，是以对数值表示用病毒清除过滤器过滤后的溶 液的病毒量相对于过滤前的溶液的病毒量的降低率而得到的值。例如，可由下述式子计算。
LRV = Iog10A-Iog10B
其中，A =用病毒清除过滤器过滤前的溶液的病毒浓度
B =用病毒清除过滤器过滤后的溶液的病毒浓度
另外，根据病毒的制备方法，有时含有大量的混杂物，给过滤速度带来较大的损 害。这种情况下，只要纯化病毒、分离混杂物后再使用即可。病毒的纯化法、如使用超速离 心分离的方法等是公知的。
设定满足病毒清除过滤器的病毒清除率LRV为3以上的条件。比病毒清除过滤 器的孔径更大的尺寸的病毒的清除率通常为LRV ^ 3，另一方面比病毒清除过滤器的孔径 更小的尺寸的病毒的清除率通常为LRV < 3 (泉浩业等，有关血浆分级制剂的安全性的研 究II.单克隆抗体纯化干燥浓缩人血液凝固第VIII因子制剂(々α ζ工4卜Μ(注册商 标))及肌肉注射用人免疫球蛋白制剂(抗HBs人免疫球蛋白“日赤”(注册商标)、人免疫 球蛋白“日赤(注册商标)”)的制造工序中的病毒除去膜的效果，Japanese Journal of Transfusion Me dicine, (1999), Vol. 45. No. 3, Pages 357-361·)。此时，当然不是清除率 一定为LRV = 0，有时能得到3以下的一定程度的清除率，但认为这并不是病毒清除过滤器 的尺寸分离本来应有的清除率，而是由于病毒分子的部分聚集或吸附而产生的。因此，意在 清除尺寸为过滤器的孔径以上的病毒时，应该满足LRV彡3以上的清除率。
作为本发明的过滤方法中使用的蛋白制剂中间制品，能够适用抗体药物中间制 品、重组蛋白药物中间制品、血浆制剂中间制品、血浆分级制剂中间制品等，但特别优选免 疫球蛋白制剂中间制品。进一步优选为免疫球蛋白G制剂中间制品，最优选为免疫球蛋白 G的单克隆抗体制剂中间制品。
首先不对这些蛋白制剂中间制品进行病毒添加，用病毒清除过滤器装置进行过 滤，由此评价蛋白制剂中间制品的平均蛋白过滤速度。在蛋白质浓度为20mg/ml以上且 100mg/ml以下的高浓度、且蛋白制剂中间制品的入口压力为150kPa以上且600kPa以下的 高压条件下，进行1小时以上且5小时以下过滤，由此评价平均蛋白过滤速度(kg/m2/Hr)。 确认平均蛋白过滤速度为1.0kg/m7Hr以上的蛋白质浓度以及压力条件后，在该蛋白质浓 度和压力范围内，向蛋白制剂中间制品中添加规定量的病毒，用病毒清除过滤器进行过滤，由此评价病毒清除工序的病毒清除性能。
蛋白制剂的制造工序中1批的制造量有总重量扩大化的倾向。蛋白制剂的1批的 总量(总重量)方面，有例如随着抗体药物制剂生产率提高的不断进行，1批显示50kg以 上的高生产能力的例子。在这样的高生产能力的蛋白制剂中，从蛋白制剂中间制品的稳定 性、制造工序的效率的方面来看，希望病毒清除工序这一个工序在1天内完成。因此，病毒 清除过滤器的平均蛋白过滤速度应该在1. 0kg/m2/Hr以上。若为1. 0kg/m2/Hr以上，能够以 1根4m2过滤器在12. 5小时以内完成50kg的蛋白制剂中间制品的过滤，以2根4m2过滤器 在6. 25小时以内完成50kg的蛋白制剂中间制品的过滤。
确认平均蛋白过滤速度为1.0kg/m2/Hr以上的蛋白质浓度以及压力条件后，在 该蛋白质浓度和压力范围内，向蛋白制剂中间制品中添加规定量的病毒，用病毒清除过滤 器进行过滤，由此评价病毒清除工序的病毒清除性能。即，选择满足病毒清除率LRV ^ 3 的蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度条件及入口压力条件。在蛋白质浓度为20mg/ml以上 且100mg/ml以下的高浓度、且蛋白制剂中间制品的入口压力为150kPa以上且600kPa以 下的高压下过滤时，同样可以得到1.0kg/m2/Hr以上的平均蛋白过滤速度，并且确认具有 LRV ^ 3的病毒清除率，推测放大后的情况下的设备、操作条件等。另外，也可以省略不添加 病毒溶液而实施的平均蛋白过滤速度的测定，而用添加了病毒的体系同时进行测定。
另外，在蛋白质浓度为高浓度下进行过滤时有以下优点能够防止过滤装置和容 器和配管等由于放大而造成的成本增加。但另一方面，若浓度变得过高，则稳定性方面产 生问题。因此，蛋白质浓度在20mg/ml以上且100mg/ml以下实施，优选为25mg/ml以上且 100mg/ml以下，更优选为30mg/ml以上且100mg/ml以下，最优选为30mg/ml以上且50mg/ ml以下。
过滤时的入口压力为高压时，有在短时间内能够迅速地进行过滤的优点，但若 压力过高，则压力对装置造成的损害或泄漏的风险增加，因此在入口压力150kPa以上且 600kPa以下实施。优选为196kPa以上且500kPa以下，更优选为245kPa以上且400kPa以 下，进一步优选为^4kPa以上且400kPa以下，最优选为294 300kPa。优选按照同时满足 蛋白质浓度以及入口压力在上述范围内、平均蛋白过滤速度为1.0kg/m7Hr以上、并且LRV 为LRV > 3的方式，分散地取多点进行评价。
另外，使蛋白制剂中间制品流过病毒清除过滤器的过滤时间在1小时以上且5小 时以下，放大后时的蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的时间设定方面，在即使增大病 毒清除过滤器的膜面积也想在短时间内完成的情况下，可以将时间设定为短时间，在即使 稍微花费一些时间也要减小病毒清除膜的有效膜面积的情况下，可以将时间设定为长时 间。另外为了确定过滤开始后3小时后也满足LRV ^ 3的条件，优选使蛋白制剂中间制品 流过病毒清除过滤器，且过滤时间为3小时以上且5小时以下。
实施例
通过以下实施例，对本发明进行更加详细的说明。
[实施例1]
作为病毒清除过滤器，使用下述的病毒清除过滤器，该过滤器具有有效膜面积 0. OOlm2的多层微多孔中空纤维膜，过滤器入口设有具有60 以上耐压性的鲁尔锁定式 喷嘴，容器内空间被中空纤维膜分隔为入口侧空间和出口侧空间，所述多层微多孔中空纤维膜是根据国际公开第2004/035180号小册子实施例1中所示的方法、即对由具有600kPa 以上耐压性的聚偏氟乙烯形成的微多孔中空纤维膜以亲水性乙烯基单体(丙烯酸羟丙酯) 进行接枝率10%的接枝聚合而形成的亲水化微多孔中空纤维膜，开孔率大的粗大结构层存 在于中空纤维膜的内表面，其厚度为7.0 μ m，与其一体化的开孔率小的致密结构层的厚度 为膜厚度总体的80%。作为蛋白制剂中间制品的模型，使用浓度30mg/ml的人免疫球蛋白 G溶液(以0. IM食盐水作为溶剂)，向该溶液中，添加0.5体积％猪细小病毒(PPV)液，用 具有35nm的孔径的中空纤维过滤器(旭化成医疗株式会社制，PLAN0VA (注册商标)35N)进 行预过滤。预过滤后的免疫球蛋白浓度为30mg/ml，PPV的浓度为6. 1 (TCID50/ml)。
使用上述过滤装置，在294kPa的压力下对含有该PPV的30mg/ml的人免疫球蛋白 G溶液实施5小时死端(Dead-end)式过滤。此时，平均蛋白过滤速度在过滤开始3小时后、 4小时后、5小时后分别为1. 9,1. 9,1. 8kg/m2/Hr。可以在任一时间点，以1. 0 (kg/m2/Hr)以 上的高速过滤的滤液评价病毒清除率。过滤开始后至1小时为止的滤液、3小时为止的滤 液、5小时为止的滤液的病毒清除率均为LRV ^ 5. 6。
病毒清除工序的运转条件可确定为如下条件蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度 30mg/ml、病毒清除过滤器入口压力294kPa、过滤时间5小时以内。
[实施例2 4]
作为病毒清除过滤器，使用下述的病毒清除过滤器，该过滤器具有有效膜面积0.OOlm2的多层微多孔中空纤维膜，过滤器入口设有具有60 以上耐压性的鲁尔锁定式 喷嘴，容器内空间被中空纤维膜分隔为入口侧空间和出口侧空间，所述多层微多孔中空纤 维膜是根据国际公开第2004/035180号小册子实施例1中所示的方法、即对由具有600kPa 以上耐压性的聚偏氟乙烯形成的微多孔中空纤维膜以亲水性乙烯基单体(丙烯酸羟丙酯) 进行接枝率10%的接枝聚合而形成的亲水化微多孔中空纤维膜，开孔率大的粗大结构层存 在于中空纤维膜内表面，其厚度为7. Ομπι，与其一体化的开孔率小的致密结构层的厚度为 膜厚度总体的80%。作为蛋白制剂中间制品的模型，使用浓度30mg/ml的人免疫球蛋白G 溶液(以0. IM食盐水作为溶剂)，向该溶液中分别添加0. 5体积％的下述3种病毒液从而 制作3种溶液。将这些溶液用具有35nm孔径的中空纤维过滤器(旭化成医疗株式会社制， PLAN0VA (注册商标)35N)进行预过滤。
病毒溶液1)小鼠白血病病毒(A-MuLV)(实施例2，病毒浓度5. 0)
病毒溶液2)呼肠孤病毒3型(Reo-3)(实施例3，病毒浓度5. 6)
病毒溶液3)小鼠微小病毒(MVM)(实施例4，病毒浓度5. 7)
使用上述病毒清除过滤器，在病毒清除过滤器入口压力^4kPa的压力下对这3种 30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(含病毒溶液)实施5小时死端(Dead-end)式过滤。
其结果，(实施例2)添加A-MuLV的情况下，过滤开始后至1小时、2小时、3小时、4 小时、5小时为止的过滤速度分别为2. 2,2. 0,1. 9,1. 7,1. 6kg/m2/Hr。可以在任一时间点，以1.0 (kg/m2/Hr)以上的高速过滤的滤液评价病毒清除率。过滤开始后至1小时为止的滤液、3 小时为止的滤液、5小时为止的滤液的病毒清除率均为LRV ^ 4. 5。病毒清除工序的运转条 件可确定为蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度30mg/ml、病毒清除过滤器入口压力294kPa、 过滤时间5小时以内。
(实施例3)添加Reo-3的情况下，过滤开始后至1小时、2小时、3小时、4小时、5小时为止的过滤速度分别为2. 5,2. 3,2. 1,2. 0,1. 8kg/m2/Hr。可以在任一时间点，以1. 0(kg/ m2/Hr)以上的高速过滤的滤液评价病毒清除率。过滤开始后至1小时为止的滤液、3小时 为止的滤液、5小时为止的滤液的病毒清除率均为LRV > 5. 1。病毒清除工序的运转条件可 确定为蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度30mg/ml、病毒清除过滤器入口压力294kPa、过滤 时间5小时以内。
(实施例4)添加MVM的情况下，过滤开始后至1小时、2小时、3小时、4小时、5小 时为止的过滤速度分别为2. 4,2. 3,2. 1,2. 0,2. 0kg/m2/Hr。可以在任一时间点，以1.0 (kg/ m2/Hr)以上的高速过滤的滤液评价病毒清除率。过滤开始后至1小时为止的滤液、3小时 为止的滤液、5小时为止的滤液的病毒清除率均为LRV ^ 5. 2。病毒清除工序的运转条件可 确定为蛋白制剂中间制品的蛋白质浓度30mg/ml、病毒清除过滤器入口压力294kPa、过滤 时间5小时以内。
[比较例1]
作为病毒清除过滤器，使用下述过滤装置(旭化成医疗株式会社制，Plan0va(注 册商标)20N)，其使用以具有IOOkPa耐压性的纤维素作为材质、且不含热塑性树脂的中空 纤维膜，中空纤维膜的入口和出口设有不具有600kPa以上耐压性的宝塔型的喷嘴，容器 内空间被有效膜面积0.001m2的中空纤维膜分隔为入口侧空间和出口侧空间。作为蛋白 制剂中间制品的模型，使用浓度30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(以0. IM食盐水作为溶 剂)，向该溶液中添加0.5体积％猪细小病毒(PPV)液，用具有35nm孔径的中空纤维过滤器 (Planova(注册商标)35N)进行预过滤。预过滤后的免疫球蛋白浓度为30mg/ml，PPV的浓 度为5.9。
使用上述病毒清除过滤器，在给纤维素膜施加的上限压力为98kPa的压力下对该 30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(含有PPV)实施5小时死端(Dead-end)式过滤。
其结果，过滤开始后至1小时为止的滤液、5小时为止的滤液的病毒清除率均为 LRV彡5. 4。过滤速度在过滤开始1小时后、5小时后分别为0. 8,0. 7kg/m2/Hr,不满足1. Okg/ m2/Hr。结果无法确定蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的运转条件。
[比较例2]
作为病毒清除过滤器，使用下述过滤装置，其使用以具有600kPa以上耐压性的亲 水化聚偏氟乙烯作为材质、且根据日本特公平7-71624号公报的例I中记载的方法制造的 平板膜，该平板膜表面具有致密的皮层，且相对于膜的厚度其致密结构层的厚度为20%以 下，平板膜的入口具有鲁尔锁定式喷嘴，容器内空间被有效膜面积0. 0003m2的过滤器分隔 为入口侧空间和出口侧空间。作为蛋白制剂中间制品的模型，使用浓度30mg/ml的人免疫 球蛋白G溶液(以0. IM食盐水作为溶剂)，向该溶液中，添加0. 5体积％猪细小病毒(PP V) 液，用具有35nm孔径的中空纤维过滤器(Planova (注册商标)35N)进行预过滤。预过滤后 的免疫球蛋白浓度为30mg/ml，PPV的浓度为5. 2。
使用上述病毒清除过滤器，在294kPa的压力下对该30mg/ml的人免疫球蛋白G溶 液(含有PPV)实施5小时死端(Dead-end)式过滤。其结果，过滤开始后1小时为止的滤 液，由于过滤速度慢因而过滤体积过少，无法进行病毒浓度的测定。过滤开始后3小时为止 的滤液的病毒清除率为LRV ^ 4. 0。此时，过滤量在过滤开始3小时后为0. 09kg/m2，平均 每小时的过滤速度为0. 03kg/m2/Hr，不满足1. 0kg/m2/Hr。
结果无法确定蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的运转条件。
[比较例3]
作为病毒清除过滤器，使用下述的病毒清除过滤器，该过滤器具有有效膜面积 0. OOlm2的微多孔中空纤维膜，过滤器入口设有具有eOOltfa以上耐压性的鲁尔锁定式喷嘴， 容器内空间被中空纤维膜分隔为入口侧空间和出口侧空间，所述微多孔中空纤维膜是根据 国际公开第2004/035180号小册子实施例1中所示的方法、即对由具有600kPa以上耐压性 的聚偏氟乙烯形成的微多孔中空纤维膜以亲水性乙烯基单体(丙烯酸羟丙酯)进行接枝 率10%的接枝聚合而形成的、仅由粗大结构层组成的微多孔中空纤维膜。作为蛋白制剂中 间制品的模型，使用浓度30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(以0. IM食盐水作为溶剂)，向 该溶液中，添加0.5体积％猪细小病毒(PPV)液。PPV的浓度为6.0。使用上述病毒清除过 滤器，在^4kPa的压力下对该30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(含有PPV)实施5小时死 端(Dead-end)式过滤。平均蛋白过滤速度在过滤开始1小时后、3小时后、5小时后分别为 2. 3,2. 2,2. 0kg/m2/Hr。过滤开始后1小时为止的滤液、3小时前的滤液、5小时为止的滤液 的病毒清除率均为LRV = 0. 5，不满足LRV ^ 3。结果无法确定蛋白制剂制造工序中的病毒 清除工序的运转条件。
产业上的可利用件
本发明的过滤方法，能够以非常小的规模收集对抗体药物、重组蛋白药物、血浆制 剂、血浆分级制剂等蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的放大后的实际运转条件的设 定、设备设计等有用的信息，因此对蛋白制剂制造产业非常有用。
权利要求
1.一种过滤方法，其是将蛋白制剂中间制品在规定的蛋白质浓度及压力下流过病毒清 除过滤器的过滤方法，其中(1)使用下述病毒清除过滤器具有至少分别有一个蛋白制剂中间制品的入口和出口 的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器内空间被病毒清除膜分隔为蛋白制剂中间制品 的入口侧空间和出口侧空间，蛋白制剂中间制品的入口、出口中至少入口为具有600kPa以 上耐压性的嵌合结构的喷嘴，病毒清除膜的有效膜面积为0. OOOlm2以上且0. 03m2以下，(2)在蛋白制剂中间制品的入口压力为150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白过滤速 度为1. 0kg/m2/Hr以上的条件下，向该病毒清除过滤器中流过通过纯化工序使蛋白质浓度 提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白制剂中间制品，且过滤时间为1小时以上且5 小时以下，(3)得到病毒清除率LRV^ 3的蛋白制剂中间制品的滤液。
2.根据权利要求1所述的过滤方法，向权利要求1所述的病毒清除过滤器中，(4)在蛋白制剂中间制品的入口压力为150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白过滤速 度为1.0kg/m7Hr以上的条件下，流过通过纯化工序使蛋白质浓度提高到20mg/ml以上且 100mg/ml以下的蛋白制剂中间制品，且过滤时间为3小时以上且5小时以下，(5)得到病毒清除率LRV^ 3的蛋白制剂中间制品的滤液。
3.根据权利要求1或2所述的过滤方法，病毒是选自细小病毒科、逆转录病毒科、黄病 毒科、呼肠孤病毒科、副粘病毒科、疱疹病毒科、小核糖核酸病毒科、乳多空病毒科中的任一 种病毒。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的过滤方法，蛋白制剂中间制品中的蛋白质为免 疫球蛋白。
5.根据权利要求4所述的过滤方法，免疫球蛋白为免疫球蛋白G。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的过滤方法，病毒清除膜由经亲水化的合成高分 子形成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的过滤方法，病毒清除膜为中空纤维型病毒清除膜。
8.一种方法，其采用权利要求1至7中任一项所述的过滤方法的蛋白质浓度和入口压 力条件作为放大时的运转条件。
9.根据权利要求8所述的方法，其还采用权利要求1至7中任一项所述的过滤方法的 过滤时间作为放大时的运转条件。
10.一种病毒清除过滤器，其是用于权利要求1至7中任一项所述的过滤方法中的病毒 清除过滤器，其具有至少分别有一个蛋白制剂中间制品的入口和出口的容器和用于清除病 毒的病毒清除膜，容器内空间被病毒清除膜分隔为蛋白制剂中间制品的入口侧空间和出口 侧空间，蛋白制剂中间制品的入口、出口中至少入口为具有600kPa以上耐压性的嵌合结构 的喷嘴，病毒清除膜的有效膜面积为0. OOOlm2以上且0. 03m2以下。
11.根据权利要求10所述的病毒清除过滤器，病毒清除膜为中空纤维型病毒清除膜。
12.根据权利要求10或11所述的病毒清除过滤器，其中，病毒清除膜是具有开孔率大 的粗大结构层和开孔率小的致密结构层、且含有热塑性树脂的微多孔膜，该粗大结构层至 少存在于一侧的膜表面，其厚度为5. Ομπι以上，该致密结构层的厚度为膜厚度总体的50%以上，并且该病毒清除膜是该粗大结构层和该致密结构层一体化而成的多层微多孔膜。
全文摘要
本发明提供在使高蛋白质浓度的蛋白制剂中间制品在高压力下流过病毒清除过滤器的条件下的、蛋白制剂制造工序中的病毒清除工序的过滤方法。一种过滤方法，其使用至少入口为具有600kPa以上耐压性的嵌合结构的喷嘴且病毒清除膜的有效膜面积为0.0001m2以上且0.03m2以下的病毒清除过滤器，在蛋白制剂中间制品的入口压力为150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白过滤速度为1.0kg/m2/Hr以上的条件下，向该病毒清除过滤器中流过通过纯化工序使蛋白质浓度提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白制剂中间制品，且过滤时间为1小时以上且5小时以下，从而得到病毒清除率LRV≥3的蛋白制剂中间制品的滤液。
文档编号B01D69/08GK102036740SQ20098011866
公开日2011年4月27日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年5月22日
发明者柳田恒一郎 申请人:旭化成医疗株式会社