专利名称：用于样本中生物颗粒的检测和/或鉴定的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于监测、检测和/或鉴定用于生物颗粒生长的样本的方法和系统。
背景技术：
在临床试验和工业环境中，检测和识别微生物的方法通常是通过分离的自动化系统控制。标准自动化血培养设备仅限于能够提供阳性或阴性结果而不能提供关于微生物的鉴定或识别的任何信息的检测系统。除了基于实验的分子测试(其比较昂贵并且通常仅限于特定微生物)，通常在一整夜的传代培养步骤以准备用于鉴定试验的生物之后，通过从阳性血培养瓶中得到样本，并且进行分离的鉴定试验，建立微生物的识别。W02007/019462 一般地涉及一种基于在单个时间点的荧光激发-发射矩阵(EEM) 的测量结果，鉴定和量化生物样本的方法。因为周围介质(有关的生物样本容纳在其中) 的淬火、荧光、以及反射特性会干扰测量结果，这种方法的灵敏度有限。如果微生物是均质并且透明的样本(例如水或盐)，系统是可操作的。不过，对于浑浊的、光密的或其他复合物样本(例如血液)，系统的效率就比较低，因为当只在单个时间点测量时，复合物背景的多变性使得微生物光谱变得更复杂。由于浑浊样本的背景信号的多变性大于微生物发射出的特定信号，不能利用单个EEM读取测量微生物的反射和荧光性的较小变化。因此，如这种参考教导的，通过单个测量途径对复合样本中生物个体的灵敏检测以及早期鉴定或识别通常是不实用的。这里还需要自动化系统提供另外的监测、检测和/或鉴定生物颗粒(尤其是微生物)的功能。由于在(或大约在)血液或无菌体液培养物显示出用于微生物生长的阳性时，可以选择更适合的治疗法，还希望具有用于早期检测和鉴定的可选方法，因为这会具有临床情况下向医生提供早期结果的优势。短时间内的其他信息还会有助于该系统的非临床使用。
发明内容
本发明提供了一种用于监测、检测和/或鉴定可能存在于样本中的生物颗粒的方法和系统，其对于临床和非临床情况都很有用。在一个实施例中，该方法包括使用光谱技术获得包括样本的生长成分的至少两个与时间相关的测量结果，以及关联这两个测量结果以检测和/或鉴定生物颗粒(如果其存在于所述样本中)。根据本发明，该测量结果考虑了所述生长成分的变化以及对所述生物颗粒集群或其成分的检测和/或鉴定。该方法尤其适用于监测、检测和/或鉴定复合样本种类中的微生物。在另一实施例中，本发明提供了一种用于检测和/或鉴定可能存在于样本中的生物颗粒的自动化系统，所述系统包括(1)生长室，包括样本和生长成分；( 测量装置，包括反射和/或荧光分光仪以便能够在两个或多个时间点得到来自所述生长室中的反射和/ 或荧光测量结果；C3) —种装置，如果所述生物颗粒存在于所述样本中，该装置用于关联所述测量结果以便检测和/或鉴定所述生物颗粒，其中所述生长室设置在作为测量装置的同样的系统中，并且该测量不侵入生长室中。在该系统中，该成分的非手动样本包括需要提供早期检测和/或鉴定的样本，因此提供了特别有助于临床和非临床应用的改进的效率和安全性。在又一实施例中，提供了一种用于检测和/或鉴定存在于样本中的生物颗粒的方法，所述方法包括的步骤有(a)将包括生长成分和样本的容器引入诊断系统中，其中在将所述容器引入所述诊断系统之前后弓I入之后，所述容器可以已包含所述生长成分和所述样本；(b)在预定的时间点或连续地照射所述容器；(C)在预定的时间点或连续地监测所述被照射的成分，以获得至少两个测量结果， 其中所述监测在波长的引导下进行，该波长等于或长于分别用于照射、反射和荧光性的波长；以及(d)如果所述生物颗粒包含在所述容器中，则关联所述测量结果以检测和/或鉴定所述生物颗粒。在再一实施例中，提供了一种用于检测和/或鉴定生物颗粒的系统，所述系统包括(1)包括样本、，生长成分、以及非侵入性地检测所述生物颗粒的传感器的密封容器；以及( 测量装置，例如光谱仪，该装置以非侵入性的方式，提供所述容器的反射比和/或荧光的至少两个与时间相关的测量结果，其中所述光谱仪提供样本随时间推移的变化和所述生长成分随时间推移的变化；以及⑶一种装置，如果所述样本中存在生物颗粒，该装置用于关联所述测量结果以检测和/或鉴定生物颗粒。如在复杂样本种类(例如血液和其他不透明物质)中发现的，该方法对高散射和强荧光环境中特别有效。在该系统中，如下面更详细讨论的，这种结合提供了单一系统中的多样性，因而能够提供更广泛的各种样本类型实验。
图IA和图IB描绘了在几个选定波长时，分别含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的接种血培养的荧光信号随时间的变化。图2A和2B描绘了在激发波长465nm和发射波长465nm(Ex465/Em465)时监测的， 分别含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的接种血培养的散射信号随时间的变化。图3描绘了具有激发波长310-320nm和发射波长345-530nm的大肠杆菌接种血培养中荧光信号随着时间推移的百分比变化。图4A和4B分别描绘了通过监测大肠杆菌接种血培养的荧光得到的激发-发射矩阵(EEM)测量数据，以及“早”期数据(图4A)和“晚”期数据(图4B)的演示。图5描绘了位于水浴接管正面22. 5°的环氧乙烷(EO)灭菌丙烯酸比色皿中大肠杆菌血培养的荧光随时间的变化。图6描绘了位于定制的自动圆盘传送带接管中的环氧乙烷灭菌丙烯酸比色皿中大肠杆菌的荧光随时间的变化。图7描绘出使用17个激发/发射波长对微生物特定群的荧光发射的变化进行一般判别分析的分类模式。
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图8A-8D描绘了具有特有荧光模式的不同微生物的示例，其中图8A描绘了阴性对照，图8B描绘了粪肠球菌接种血培养，图8C描绘了绿脓杆菌接种血培养，图8D描绘了肺炎链球菌接种血培养。图9A-9D描绘了在多个波长下具有特有漫反射模式的不同微生物的示例，其中图 9A描绘了阴性对照，图9B描绘了粪肠球菌接种血培养，图9C描绘了绿脓杆菌接种血培养， 图9D描绘了肺炎链球菌接种血培养。图10A-10F描绘了用于不同微生物物种的在选定波长下的荧光信号随着时间的百分比变化示例。图11A-11D描绘了使用模式中的不同节点数目对微生物特定群的荧光发射的短暂变化进行一般判别分析的不同分类模式。图12A-12D描绘了概念验证血培养系统中的生长在商用血培养瓶中的具有特有荧光模式的不同微生物示例。图13A-13D描绘了概念验证血培养系统中的生长在血培养瓶中具有特有荧光模式的不同种微生物示例。图14是概念验证血培养系统的方框图。
具体实施例方式本发明提供了一种装置，用于检测样本中生物颗粒的相应等级及其成分。进一步， 也可以基于可观测的差异(例如，成分、形状、尺寸、聚类、和/或新陈代谢)完成生物颗粒的鉴定。设置系统以监测用于生物颗粒生长的样本，检测样本中的生物颗粒，鉴定样本中的生物颗粒，或其组合。在连续分析设置中，通过监测每个样本的荧光和反射信号决定特定信号，随着时间推移和所处的状态，其中关注的生物颗粒的浓度一般从低于检测界限的等级增加至可检测等级并且可能延伸至超出检测界限的等级。利用该原理，由于该方法能够将高背景信号与样本和成长成分中的变化区别开，从而提供一种用于监测复杂样本类型的非侵入性方法，所以系统能够测量出较小的变化，该变化随后可能与生物颗粒的生长有关，并且当样本是复杂且不透明的种类(例如培养基中的血液样本)时，该变化可以起作用。在该方法中， 通过测量样本中的变化、生长成分的变化、和/或生物颗粒的实际质量而获取生长动力。可以试验的样本包括临床和非临床的、怀疑可能存在或生长有生物颗粒的样本。 由于该方法的多功能性和灵敏性，使用的样本数量可以有很大差别。可以通过本领域普通技术人员已知的任意技术完成样本的制备，但是本发明的优势之一是可以使用系统直接实验复杂的样本种类(限定为血液、体液、或其他不透明物质)，而只有少许或没有大范围预处理。可以实验的临床样本包括临床实验室中通常实验的任意样本种类，包括但不仅限于，血液、痰液、血浆、血液分离部分、关节液、尿液、精液、唾液、排泄物、脑脊液、胃内容物、 阴道分泌物、组织勻浆、骨髓抽取液、骨勻浆、痰液、吸出物、棉拭、拭子残渣、其他体液、以及类似物。可以检验的非临床样本也包括高易变物质，包括但不仅限于，食物、饮料、药物、化妆品、水、气体、土壤、职务、血液产品(包括血小板)、捐赠器官或组织样本，以及类似物。本方法还特别适用于实时实验以监测污染等级、工艺控制、质量控制、以及工业环境中的类似应用。如此处使用的，属于生物颗粒和多个生物颗粒可以交换使用并且用于包括样本中的可以检测和/或鉴定的一个或多个生物颗粒(群)及其成分，并且该颗粒包括任意能够自体复制的组织或细胞以及片段、代谢物、以及组织或细胞特有的其他物质。包括在该限定中的是微生物或非微生物，包括，例如病毒、寄生虫、原虫、隐孢子虫、以及类似，包括细胞培养(植物、哺乳动物、昆虫等等)。特别适用于检测和/或鉴定的是可以在实验室中对其复制和操作的微生物(其中术语微生物包括单细胞的、裸眼不可见的生物)，包括但不仅限于，革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌。作为革兰氏阴性菌，包括有以下菌属假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、肠杆菌、克雷伯杆菌、沙雷氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、嗜血杆菌、摩根氏菌、弧菌、耶尔森氏菌、不动杆菌、寡养单胞菌、短波单胞菌、青枯菌、无色杆菌、梭杆菌、普雷沃氏菌、布兰汉氏菌、奈瑟氏菌、伯克霍尔德氏菌、柠檬酸杆菌、哈夫尼亚菌、爱德华氏菌、气单胞菌、莫拉氏菌、布鲁氏菌、巴氏杆菌、普罗威登斯菌和军团菌。作为革兰氏阳性菌，包括有以下菌属肠球菌、链球菌、葡萄球菌、杆菌、类芽孢杆菌、乳酸菌、李斯特菌、消化链球菌、丙酸杆菌、梭状芽孢杆菌、类杆菌、加德纳菌、考克斯菌、乳球菌、明串珠菌、微球菌、分支杆菌和棒状杆菌。作为酵母菌和霉菌，包括有以下菌属念珠菌、隐球菌、 诺卡氏菌、青霉素菌、支链孢属、红酵母、曲霉菌、镰刀菌、酵母菌和毛孢子菌。根据本发明，系统能够执行的检测和/或鉴定等级的设定可以灵活多变。由于取决于至少两个随时间变化的测量结果(其与样本中生物颗粒的存在有关)，检测包括观察样本中的至少一个变化。检测的立即发生取决于多项因素，包括生物颗粒的生长率、生长成分的增殖力、检测算法的选择性、和/或测量的时间间隔，等等。虽然实际检测时间可以随这些因素而变化，不过优选实施例提供了从该方法开始起大约48小时之内进行微生物检测，更优选在从该方法开始起约M小时之内，仍然更优选在从该方法开始起约1至16小时的范围内，以及最优选在从该方法开始起约1至10小时的范围之内。鉴定包括生物颗粒的主要分类和分类以及单个物种的实际鉴定。在部分实施例中，关注的生物颗粒的分类可能不要求给定生物颗粒的特征的先验知识，而只要求与经验性测量结果一致相关，因此使得该方法比基于特定绑定事件或代谢反应的方法更普遍且更易于应用。更具体地，在基于微生物的应用中，鉴定包括基于有用信息(例如测量结果)将微生物分为一个或多个分类模式，在本方法提供的时段内可能得不到这些有用信息。如此处使用的，优选分类模式包括将微生物分成以下一个或多个组或类(1)革兰氏组；( 临床革兰氏组；⑶治疗组；⑷功能组；(5)天然固有荧光组。(1)革兰氏组在革兰氏组类别中，基于生物颗粒或微生物的染色反应和总尺寸将它们归入的三个主要分类类别的其中之一，所述组可以选自以下组中的一个或多个组 (a)革兰氏染色黑蓝色的革兰氏阳性微生物；(b)革兰氏染色红色的革兰氏阴性微生物； (c)革兰氏染色黑蓝色的酵母细胞，不过是可以与细菌的形态特征区别开的非常大的圆形细胞。(2)临床革兰氏组该革兰氏组可以进一步分为表现有区别形态特征的几个子组别。这些子组别包括有经验的化验师报告的所有相关临床信息，并且因此提供比阳性或阴性革兰氏反应更高等级的鉴定。这种特殊的分类非常有用，因为通过提供利用自动化系统的相当于临床的相关信息，不用再考虑依靠革兰氏染色的质量或读取涂片的技术员的技术水平。更具体地，基于这种分类模式的子组别可以选自以下一个或多个组(a)球菌，其为较小的圆形细胞；(b)双球菌，其为两个较小圆形细胞连接在一起；(C)杆菌，其为方形；以及(d)芽孢杆菌，其为杆形。通过本发明可以确定的其他形态信息示例包括(i)革兰氏阳性球菌；(ii)链式排列的革兰氏阳性球菌；(iii)群聚的革兰氏阳性球菌(例如，“葡萄串状”群聚)；(iv)革兰式阳性双球菌；(ν)革兰式阳性杆菌；(Vi)具有内孢子的革兰式阳性杆菌；(vii)革兰氏阴性杆菌；(viii)革兰氏阴性球杆菌；(ix)革兰氏阴性双球菌；(X)酵母·’以及(Xi)丝状真菌。(3)治疗组治疗组包括多个微生物物种，当与特定标本类型隔开时，可以将同一类抗生素或抗生素混合物处理这些物种(参见“抗微生物治疗桑福德指南2008”)。在很多情况下，因为可以使用同样选择的抗生素处理不止一个物种，临床医生可能不会要求确认物种等级以便能够使最初经验性治疗转变为更有针对性的治疗。这种分类等级将“同样处理的”微生物正确地归入单一治疗分类。这种鉴定等级的示例包括将高耐肠杆菌(EB)物种与敏感EB物种(从大肠杆菌的肠杆菌属中)区别开，或将耐氟康唑念珠菌物种(光滑念珠菌和念珠菌)与敏感念珠菌物种(白色念珠菌和近平滑念珠菌)区别开，等等。(4)功能组根据本发明，也可以根据代谢、病毒性和表现型特征的结合将微生物鉴定为几个组。非发酵生物能够明确地与发酵生物区别开。进一步，将产生典型溶血性微生物物种与非溶血性物种分隔为不同组。在一些情况下，这些组比属的层次(例如大肠菌属、革兰氏阴性非发酵棒)代表更广泛的分类，在一些情况下，这些组处于属的层次(例如肠球菌、念珠菌)，在一些情况下，这些组更接近物种等级鉴定(例如，凝固酶阴性葡萄球菌、α-溶血性链球菌、β-溶血性链球菌、凝固酶阳性葡萄球菌，例如金黄色葡萄球菌)。(5)天然固有荧光(“IF”)组还可以基于微生物的先天或固有荧光特性将其鉴定为不同组。这些组中有一部分是与治疗和功能组种类共有。这些组可以包括单个物种， 例如的酿脓链球菌、或绿脓杆菌，这些单个物种被鉴定出IF特征或包含具有相对保守的IF 特征的较小生物组，例如大肠杆菌-产酸克雷伯氏菌或产气肠杆菌-弗氏柠檬酸杆菌组。根据本发明，将样本与生长成分结合，该成分被限定为保持了能够自我复制的生物颗粒活力和/或生长的成分以在系统中监测，特别在具有连续监测能力的系统监测。依靠使用系统，生长成分包括充足的营养以促进生物颗粒的快速生长，从而便于更早的检测和鉴定。例如，生长成分包括介质(包括琼脂)、液体培养基(对多种用途都很理想)，或悬浮液，以及类似物。优选地，对于微生物实验，该成分包括介质(例如胰酶大豆液体培养液、 脑心浸液液体培养液、哥伦比亚液体培养液和布鲁氏杆菌液体培养液)，以及本领域普通技术人员已知的其他通用复合培养基，并且可以包括另外的血液代用品和特定生长基因。另外，可以根据关注的生物体的需要将用于各种微生物培养的立即可用的特殊合成的好氧和厌氧培养基与该系统结合。标准血培养基优选用于更普遍的实验，其中可以在本领域熟知的技术范围内调整介质的繁殖力和选择性。还可以采用微生物可以在其中以非均勻的或微粒的方式(例如分支杆菌、霉菌)生长的成分。如本领域普通技术人员熟知的，成分中还可以包括吸附材料(例如树脂、活性炭、漂白土以及类似物)以缓和面对着抗生素的样本的影响。不过系统可适用于不同增生长成分和样本种类，优选改变系统以适应这种多变
8性。例如，当样本包括血液时，把用于建模的算法或其他方法考虑在背景情况中，以便可观测生物颗粒的生长。在优选实施例中，系统包括一个或多个生长室，其包括一个温控间隔，该间隔中一般包括一个或多个含有样本和生长成分的容器。可选地，生长室可以具有摇动机构以提供用于生物颗粒(最优选微生物)的生长的最优培养条件。本领域普通技术人员已知适宜的生长条件。依据设计优选和关注的生物体，控制容器中样本和成分的数量。例如，系统包括控制部件(例如光学感应器)以便自动地调节添加至容器中的样本数量。在引入系统之前， 容器中可以已经包括样本和/或成分，并且样本可包括那些在引入系统之前已经生长而没有连续检测的样本。系统的容器的物理特征需要考虑整个系统的设计，样本种类、生长成分，以及类似，还包括光学校准特征以便于光学读取。该容器可以由任意材料构成，这些材料不会干扰生物颗粒的生长并且不会干扰采取的测量法。更具体地，容器可以由这样的材料构成，即该材料在电磁波谱的紫外线、可见和/或红外线区域具有较好的传递特性，并且该传递特性至少存在于进行测量的区域。例如，材料包括任意UV-VIS-IR透明材料(例如玻璃或塑料)，并且理想的是具有低透气性。材料可以是单层或多层的，其中优选至少一层具有低透气性。容器可以密封或不密封，并且包括需要的其他部件，例如温度传感器、二氧化碳传感器、氧气传感器、比色传感器、及其组合以及类似物。例如，容器可以具有传感器(优选留置传感器)以监测容器的温度，该传感器本质上可以是电子的或光学的，并且能够提供瓶子的读取温度而不需要与容器间有物理接触。容器可以是开口的、有出口的、或密封的系统。 还可以将容器设计成，在监测期间的任意时刻，只要发生微生物充分生长的情况，都便于取样，以便分离并提纯生物颗粒以用于ID、AST、分子或其他诊断实验系统中。容器还可以具有光学表面或涂层用于收集荧光和散射光。另外，如本领域普通技术人员已知的，容器可以以不同形式包括校准基准和/或光学基准。例如，可以通过存在于内层或涂层中的光学地嵌有光学基准的部件完成校准。在一个实施例中，已经发现包括至少两种检测生物颗粒生长的装置的单个系统比较有利，因为一个系统中检测生长的第一和第二装置的结合能够提供更快更明确且敏感的微生物检测系统，并且具有更广泛的使用范围以检测不同成分的样本。根据本发明，系统中检测生长的一种装置包括反射比和/或荧光光谱随时间变化的测量结果，如前所述，该装置优选正面对着的结构。系统中检测生长的第二装置包括密封容器，容器中包括样本、生长成分和能够检测非侵入性生长的传感器。优选地，如本领域所知的，所述传感器是比色传感器，更优选乳化液传感器(LEQ。不过，时间相关的反射比和/或光谱法提供了对高代谢活性微生物进行早期检测而不需要内部传感器的可能性。进一步，当提供了对包含在样本中任意生物颗粒的非侵入性检测和/或鉴定时，多个检测指标(波长对)可以改进系统的特异性。可选地，可以包括具有传感器的密封容器的第二种装置，以提供测量生物颗粒提供的二氧化碳和其他化合物的耐用、标准化的内部传感器。第二种装置还包括延迟进入阳性的样本的检测方法，其中产生的信号未必取决于检测样本的成分而是可以来自生物体本身。根据本发明，通过以与时间相关的方式监测样本(例如通过采用至少两个与时间相关的测量结果)，本发明能够通过测量周围高荧光环境中的多个变化检测生物颗粒的生长，并且通过连继监测变化对生物颗粒分类，直到记录并分析了特征图。更具体地，因为微生物包括或由依靠特定细胞成分和代谢而天然地发出荧光的分子组成，所以该方法在微生物检测和/或鉴定领域很有用。由此产生的模式随着生物种类的不同而不同，从而根据生物种类提供酶解图谱。优选地，设计系统，以便当检测样本中的生物颗粒时，自动通知使用者。进一步地， 可以根据需要鉴定生物颗粒。一旦进行检测，或一旦由于存在生物颗粒而鉴定样本，已经发现可测量差异能够在生长阶段早期(有时几乎是瞬间的)形成用于生物颗粒鉴定的方法的基础。依靠多种因素(包括样本种类、样本浓度、样本中生物的浓度、生长成分的种类、生物体的生长率、测量时间间隔、等等)，在最初的检测之后，很快就会出现特征图。可以在系统中提供自动信号， 一旦鉴定生物颗粒并归入一个或多个特征组(如此处所述)或通过物种鉴定，等等，该信号会在鉴定生物颗粒时通知使用者。在优选实施例中，该方法自动地检测并鉴定存在于复合的、高荧光性和/或光学密度的样本中的微生物，并且如果是细菌和酵母，该鉴定至少具体到一个标准革兰氏染色体提供的信息等级。一旦样本被引入到系统中，可以在生物颗粒生长期间的任意点提取分类信息。优选在最初检测的约48小时之内进行鉴定，更优选在最初检测的约M小时之内， 仍是更优选的在最初检测的约16小时之内，最优选在最初检测后的约0至8小时之内。例如，鉴定可以发生在“早期阶段”(从最初检测或确定的生长信号后的约0至2小时开始发生变化)和/或发生在“晚期阶段”(从最初检测或明确的生长信号后的约2至8小时开始发生变化)。早期阶段倾向于显示光谱以生长成分中的变化为主的图案。晚期阶段倾向于显示光谱以生物颗粒集群而不是以生长成分中的变化为主的图案。可以进行样本监测的时间长短可以根据使用者的需要有很大差异。例如，如本领域普通技术人员知道的，取决于关注的生物颗粒，等等，检测可以进行至与检测起始相隔一段时间，可以相隔几天甚至几个月。当监测生物颗粒的生长(优选微生物的生长)时，可以像使用者发现的有助于特定检测需要的频率那样激发样本，并且可以通过软件使样本自动化。例如，在血液或体液实验中的典型微生物监测中，可以连续地或周期性地激发样本。更具体地，可以将激发样本的频率调节为从连续激发到大约每隔几小时或每隔几天激发间的任意点，更优选地激发样本的范围为大约每分钟至每三小时，最优选地范围为大约每五分钟至大约每小时。如此处所使用的，可以交替使用激发和照射。可以在生长室内实时监测自我复制生物颗粒的生长，其中通过选择自动化系统可以控制读取而不要求移除样本。当连续监测特别有用时，可以通过周期扫描、随即存取、以及类似可选地设置该方法以监测、检测和/或鉴定样本中存在的生物颗粒。样本照射源或激发源可以选自本领域普通技术人员已知的任意数量的合适光源。 更优选地，并且本领域普通技术人员已知的是，利用能够在电磁光谱的紫外线、可见和近红外线区域传递的光源。例如，光源可以是连续光谱灯，例如用于产生紫外光的氘或氙弧灯和用于产生可见/近红外激发的卤钨灯。这些光源提供了较宽的散发范围，并且利用光学干涉滤光片、棱镜或光栅可以减小用于特定激发波长的光谱带宽。可选地，可以采用空间多路的多个窄带光源(例如发光二极管或激光器)，以提供具有多个波长的激发源。例如，通常地，发光二极管能够从MOnm至超过900nm并且该光源的光谱宽度为20-40nm(最大值处的半宽度)。激光器可提供从紫外线至近红外线的离散波长；本领域普通技术人员已知多种多路使用方法。任意光源的光谱选择性都可以通过使用光谱鉴别装置(例如扫描单色仪)改进。 本领域普通技术人员还可以使用其他鉴别方法，例如声光可调滤波器、液晶可调滤波器、光学干涉滤光片阵列、棱镜摄谱仪等等。在选择光谱鉴别仪时应仔细考虑调节范围以及选择度等级。以说明的方式，例如，鉴别仪应该使用的波长范围为300-800nm并且选择度为 lOnm。这些参数通常决定了对于实现调节范围和选择度必需的最适宜技术。典型地，光源会引起激发样本和随后在预定时间点或连续地测量样本荧光的散发。类似地，可以测量来自激发光源的与样本相互作用的反射光(散射光)并且显示出来以提供有关数据用于检测和鉴定。可以通过任意合适的光谱鉴别仪测量来自样本的散发，最优选采用光谱分析仪。 光谱分析仪可以是检测特定散发波长的扫描单色仪，由此利用光电倍增管检测来自单色仪的输出，或者将光谱分析仪配置成成像光谱仪，由此利用成像探测器阵列(例如电荷耦合器件(CCD)探测器阵列)检测输出。本领域普通技术人员还可以使用其他鉴别方法，例如声光可调滤波器、液晶可调滤波器、光学干涉滤光片阵列、棱镜摄谱仪等等。在优选实施例中，鉴别仪使得能够通过光电探测装置(例如光电倍增管、雪崩光电二极管、电荷耦合器件 (CCD)探测器阵列、或电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)探测器阵列)观察荧光和/或扫描信号。使用与时间相关的光谱技术以获取至少两种测量结果，优选提供该测量结果作为激发-发射矩阵(EEM)测量结果。如此处所用，由于同时具有激发和发射波长的官能，将 EEM定义为荧光物质的荧光光谱发射强度，并且EEM包括全谱或其子集，其中子集含有单个或多个激发/发射对。图4A和4B示出了在整个EEM光谱范围上与时间相关变化的等高线图。另外，使用具有固定激发波长的EEM的横截面表示用于特定激发波长的发射光谱，并且使用具有固定发射波长的EEM的横截面表示用于样本的激发光谱。在一个实施例中，适时地并且使用特定激发-发射波长对在离散点测量多重EEM。根据一个实施例，已经发现正面对着的荧光光谱提供了测量高散射和高度淬火样本的荧光和反射特性的优势。正面对法尤其有助于光谱法，因为已经发现这种设置很少受到血液和微生物培养基的干涉成分的影响。根据这个实施例，可以以这样的角度照射容器的光学表面，以便提供如本领域普通技术人员已知的可接受的结果，(例如，1983年的生化分析 94 :15-21 中艾辛格· J.和 J. 弗洛雷斯的 “front-face fluorometry of liquid samples”)。更具体地，可以任意角度进行照射，其中镜面反射并没有直接进入探测器中。优选地，设计系统以便光谱除了以固定角度的最小值测量发射的荧光之外，还以固定角度的最小值测量漫反射光。以示例的方式，可以将容器的光学表面设置成表面结构，以及以0° 至90°且与容器表面垂直的角度照射该表面。根据本发明，采用对比测量(control measurement)结果(例如荧光和/或反射测量结果)用于已知特定样本中的生物颗粒(优选微生物)，因此可以使用本领域普通技术人员已知的各种数学方法对比测量的试验数据和对关注的生物颗粒的鉴定。例如，使用本领域普通技术人员已知的软件系统比较来自样本的数据和原始资料或对比测量结果。更具体地，可以使用数个多元分析法分析荧光和散射数据，例如，一般判别分析(GDA)、偏最小二乘判别分析(PLSDA)、偏最小二乘法回归、主成分分析(PCA)、平行因子分析(PARAFAC)、神经网络分析(NNA)以及支持向量机(SVM)。如前所述，在设计的用于监测、检测和/或鉴定生物的系统中，使用这些方法将关注的未知生物颗粒(优选微生物的选择组)基于现有的命名归类入相关组，或基于生物的新陈代谢、病原性以及病毒性归类入天然发生组。在优选实施例中，考虑到微生物本身的生长和由于培养基中微生物代谢而产生的动力学变化，系统利用培养基和样本中固有荧光性和/或反射比的变化检测微生物。微生物(尤其是细菌)的固有荧光性或自体荧光性，影响了细菌含有能够通过多波长光源激发的天然荧光团例如芳香族氨基酸(例如色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸)的事实。系统中使用的保持样本的容器进一步包括组合的(X)2或其他传感器，可以因任何原因而包括该传感器，该原因包括但不限于，与之前系统的兼容、制造期间的污染测量、运输或储存、以及为延迟进入繁殖期/读取系统的瓶子提供便利。更进一步，容器可以包括射频鉴别装置、条形码、或类似物以储存在收集样本时(包括时间)来自对瓶子的原始读取、 试验信息(可以用于后鉴定)、制造信息(种类、日期、终止、原始读取等)、在收集样本时偶尔获取的病人和样本信息、以及类似。通过以下实施例进一步详细说明本发明，以描述的方式提供这些实施例且其并非用于以任何方式限制本发明。以下使用了本领域熟知的标准技术或特别描述的技术。实施例利用温控正面试管支架调整Flu0r0l0g3荧光光谱仪系统(郝瑞巴乔宾 伊万)， 以便能够培育容纳在无菌试管中的接种血培养并对其连续监测。利用光电倍增管记录荧光性。以几个不同波长获取荧光信号强度并保存。将读取结果与经验性地确定的强度比较以用于不同种类微生物。此外，控制对光谱的进一步分析，以便微生物鉴别达到给定的可信等级。实施例1描述了高压蒸汽石英比色管中的接种血培养。示例2中使用了环氧乙烷灭菌丙烯酸比色管。在示例3中使用了定制的转盘式接管，其使得能够在35-37°C时培育培养物并且能够使多个培养物同时进行。这些实验证明本发明拥有潜在能力，即对血液培养物中微生物的检测早于当前最先进的(X)2传感器，并且具有鉴别分离菌以至少达到临床可用的分类等级的能力。构建来自大约80种微生物菌群的血培养物的EEM数据库和散射数据。使用几种多元分析法对未知菌群分类。示例4中呈现了一般判别分析(GDA)法的结果。示例5描绘了用于血液培养物EEM收集的正对角的最优选择以及散射光谱。示例6描绘了在接种血培养物中生长的微生物的非侵入鉴定。示例7描绘了利用原理论证(POP)血培养系统得到的结果，该系统使用了现有的商业血培养瓶并且利用多个荧光和反射波长进行连续监测。示例1 水浴接管中石英比色皿中的血培养(培养基和血液样本)接种血培养设置在含有用于摇动的摇动棒的高压蒸汽处理过的1.0cm螺盖石英比色皿(斯塔尔纳有限公司)中。试管中添加了 2. 4mL标准血培养介质，0. 6mL新鲜人体血以及0. 05mL的IO3AiL的试验微生物悬液(大约10CFU/比色皿)。无菌的间隔螺盖设置在比色皿上，并插入前述的正对着的接管中。通过连接接管和被加热至36°C的再循环水浴， 培养物维持在大约36°C。通过软件控制的FlUorolog3荧光光谱仪每隔45分钟读取试管。 在每个时间点收集完整的EEM光谱，其中用于每次扫描的共3139个数据点的激发波长范围为260-580nm(每5nm)且发射波长范围为260_680nm (每5nm)。完成每次扫描大约花费23
分钟。保持培养物并且连续获取测量结果长达M小时。图IA和图IB示出了用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养物的几个激发-发射波长对的荧光信号的变化示例。清楚的是，两种生物之间的下列检测起始点、在这些波长下发生的短暂变化显著不同。图2A和2B示出了用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的在465-465nm 的漫反射信号的变化示例。可以观察到曲线形状随时间推移的明显变化。对来自大肠杆菌培养物的全部3139个数据点的荧光性变化的进一步详细检查显示出至少两个可视的识别阶段的存在；来自培养物的7-lOhrs (大约在最初检测之后的 0-2小时)的主要包括培养基的荧光性的快速起始变化的变化，以及来自IO-MhH大约在最初检测之后的2-7小时)的反映了微生物固有荧光团的增加的变化。图3中以从大约 310-320nm的激发波长和从大约345-530nm的发射波长的线性图示出了这个现象，并且以整个EEM光谱之上的与时间相关变化的等高线图在图4A和4B中示出。图3、4A、和4B说明了 “早期”和“晚期”阶段的变化，该变化可用于生物颗粒的检测和/或鉴定。该数据例证了生长着的微生物培养物的短暂荧光性和散射测量结果的功率。示例2 水浴接管中丙烯酸比色皿中的血液培养物按照示例1中所述设置大肠杆菌血培养物，其中结构为UV透明丙烯酸(萨尔施泰特67.755)的比色皿除外，并且该培养物经过环氧乙烷灭菌处理。图5示出了具有多个波长对的血液-介质混合物的自体荧光或固有荧光随时间推移的变化。示例3 多站式圆盘接管中丙烯酸比色皿中的血培养物按照示例2中所述设置大肠杆菌血培养物，其中装入用于Flu0r0l0g3系统的定制、温控圆盘式接管中的比色皿除外。图6示出了具有多个波长对的血液-介质混合物的自体荧光或固有荧光随时间推移的变化。示例2和3中描述的实验分别演示了在较容易获得的塑料容器中和易于以大规模自动化的方式测量荧光随着时间的变化。这些实验(数据未示出)中收集的漫反射测量也与此相似。示例4 模拟血培养研究的GDA分析(组级)在该研究中，在几分钟内将阳性培养基样本从BacT/ALERT 微生物检测系统(梅里埃有限公司)的接种BacT/ALERT (梅里埃有限公司)血培养瓶中移除，称为培养物的阳性结果。在类似的时间，从灭菌血培养瓶中移除的培养基作为阴性对照。培养基样本放置在丙烯酸比色皿中并且利用具有全EEM扫描的Fluorolog3中读取进行。将荧光性和散射数据标准化以进行存活期匹配的阴性对照，然后通过一般判别分析(GDA)分析。将获得的用于来自每个被试验样本的多个数据点的测量结果与来自77种已知微生物菌种(代表了 12个物种)血培养物的EEM数据库和反射数据对比，并且基于对比结果将试验菌种分类。图7呈现了基于收集的数个数据点被正确地鉴定归入“组”分类级别中的菌种百分比。图7说明了基于现有术语或生物的先天代谢、病原性以及病毒性特征，特定微生物的荧光性和散射变化的分析将超过97%的试验微生物正确地归入临床相关组别。示例5 正面相对角度的优化如示例3中所述设置丙烯酸比色皿中的大肠杆菌血培养物。按照以下角度调整按顺序的培养物的正面相对角度以便实验20、22. 5J6、30、34和38°。还在各个角度测量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的纯悬液。当评定作为大肠杆菌培养物(表1)中变化的最大度数或作为两种微生物悬液(数据未示出)的最高绝对信号以及细胞荧光团的信噪比，示出的最优正面相对角为26°。表1中给定的值表示用于所有瑞利点O60-750nm)的平均信号以及EEM之内的所有荧光点。当微生物生长曲线的阳性区域中的平均瑞利信号减少66%， 可以发现特定波长(例如465-465nm)的大幅度增加，如图2A和2B的示例。
表1大肠杆 生长曲线的从阴,生区域至阳性区域的信号变化百分比正面相对角度20°22.5°26。30。34°38。散射平均值-50%-59%-66%-49%-43%-62%EEM平均值1%1%10%2%0%-2%示例6 生长在血培养物中的微生物的非侵入性鉴定将共119中接种血培养物(代表了十四个临床相关物种(参见下表2、的5-15个菌种)接种到灭菌丙烯酸比色皿中并且装到用于FlUorolog3系统的多站式圆盘接管中。
表2 被实验的临床相关物种白色念珠菌大肠杆菌鲍曼不动杆菌粪肠球菌近平滑念珠菌产气肠杆菌绿脓杆菌肺炎链球菌热带念珠菌肺炎克雷伯菌金黄色葡萄球菌缓症链球菌奇异变形杆菌表皮葡萄球菌使用选择的82个荧光波长对和50个漫反射波长连续扫描(每隔30至35分钟) 每个培养物长达5天。图8B-8D示出了用于不同微生物的整个23小时内的特征荧光图。示出了来自 82 个波长对中的 4 个波长对数据(Ex360/Em380nm、Ex460/Em480nm、Ex650/Em670nm 以及 Ex700/Em730nm)。图8A示出了用于阴性对照的收集数据，图8B示出了用于粪肠球菌接种血培养的收集数据，图8C示出了用于绿脓杆菌接种血培养物的收集数据，以及图8D示出了用于肺炎链球菌接种血培养物的收集数据。这三个物种之间的荧光性曲线形状具有明显区别。图9B-9D示出了图8中所示的同样三种微生物的在整个23小时的培养期间且在波长280-720nm时的特有漫反射图。图9A示出了用于阴性对照的收集数据，图9B示出了用于粪肠球菌的收集数据，图9C示出了用于绿脓杆菌的收集数据，以及图9D示出了用于肺炎链球菌的收集数据。正如通过来自阴性对照(图9A)的正常反射信号的移离表明的，再一次出现了反射的独特模式。反射中这种短暂移动的范围和速度是特定微生物的特征。图10A-10F示出了在用于11个微生物物种的6个选定波长上，随时间推移的荧光信号变化的百分比。图IOA示出了用于不同物种的具有激发波长300nm和发射波长490nm 的收集数据，图IOB示出了用于不同物种的具有激发波长360nm和发射波长380nm的收集数据，图IOC示出了用于不同物种的具有激发波长460nm和发射波长480nm的收集数据，图 IOD示出了用于不同物种的具有激发波长480nm和发射波长510nm的收集数据，图IOE示出了用于不同物种的具有激发波长520nm和发射波长740nm的收集数据，图IOF示出了用于不同物种的具有激发波长eiOnm和发射波长640nm的收集数据。随时间推移的用于特有荧光和/或漫反射图的测量结果和收集数据，和/或在多个波长下荧光信号随时间的变化可以与来自已知微生物菌种的EEM数据库和散射数据对比，并可被用于检测和鉴定可能存在于样本中的生物颗粒。图11A-11D示出了被正确地鉴定至不同分类模式的菌种百分比，其中使用了微生物特定组的荧光性和/或漫反射数据的短暂变化的一般判别分析，该数据使用了模式中不同数量的数据点。将用于来自每个被试验样本多个数据点的测量结果与来自大约120种已知微生物菌种的血培养物的EEM数据库和反射数据比较，并且基于比较结果对每个试验菌种分类。图IlA示出了按照临床革兰氏组的分类，并且示出了在基于11个数据点检测之后的0-4小时，将大约93%的实验物种被正确地鉴定至临床革兰氏级别。图IlB示出了按照治疗组级别的分类，并且示出了在基于同样的11个数据点检测之后的0-4小时，正确地鉴定大约97%的实验物种。图IlC示出了按照治疗组级别的分类，并且示出了在基于同样的 11个数据点检测之后的0-7小时，正确地鉴定大约96%的实验物种。图IlD示出了按照治疗组的分类，并且示出了在基于21个数据点的不同输入后的0-7小时，正确地鉴定大约 98%的实验物种。图11A-11D说明基于现有术语或生物的先天代谢、病原性和病毒性特征，可以使用特定微生物的荧光变化分析将微生物归类入临床相关组或种类。示例7 使用商业血培养瓶的概念验证血培养系统发展概念验证血培养系统以验证商业制造的BacT/ALERT (梅里埃有限公司)的具有和没有留置的乳化液传感器(LEQ的培养瓶的新技术性能。该系统能够使用与商业的 BacT/ALERT 微生物检测系统(梅里埃有限公司)一样的温度和激发条件测试瓶子。使用两个光源产生激发光，一个是470nm的激光器并且另一个是650nm的激光器。 使用相干光源以便能够用较窄的斯托克斯位移进行评价。因为光耦合效率高于激光器，所以在光纤应用中使用相干光源也比较有利。窄带光过滤器会限制荧光(或增强的自然发射)进入纤维，这确保只有荧光信号来自样本中关注的荧光团。使用光纤耦合光学系统(本领域熟知)将来自每个光源的过滤光与分支光纤耦合。分支光纤将两个光纤的光合并成一支光并射到样本瓶上。一种典型反射探头结构(使用6支收集纤维围绕一支激发纤维)。 收集光纤收集反射的激发光和荧光并将其耦合回分支光线(其将光分成两道)。然后提取光纤中的光并使用准直光学组件校准。使用带通滤波器分离来自每个通道的荧光，以便一个光电探测系统检测来自470nm光源的荧光，并且另一个系统检测来自650nm光源的荧光。 每个滤波器会阻挡激发光的频率。图14示出了系统的阻挡示意图。在塑料BacT/ALERT SA(梅里埃有限公司)培养瓶中填充IOmL标准人体血液或去纤维蛋白的马血并与IO2-IO3CFU的不同微生物接种。将瓶子装入设备中长达120小时并且每隔10分钟读取一次。将光纤探头以O至90°的角度与摇动的培养瓶相邻放置。此外，
15制造的BacT/ALERT SA瓶没有留置的乳化液传感器(LEQ，并且光纤探头与试管底部垂直放置以收集数据。图12A-12D分别示出了用于肺炎链球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌和人隐孢子虫的几种侧壁读取培养物的结果。由于用于所有试验波长(EX650/Em670nm并且Ex470. Em670nm)的微生物的生长，荧光强度发生明显变化。而且，试验物种的荧光信号的范围、速度和方向也不同。图13A-13D分别示出了用于在BacT/ALERT SA瓶中的肺炎链球菌、奇异变形杆菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的几种底壁读取培养物的结果，其中制造的BacT/ALERT SA瓶没有留置的乳化液传感器(LEQ。在最初检测的几小时之内，可以观察到这些微生物物种的荧光强度、速度和方向的特征变化。图12A-12D和13A-13D验证了基于现有术语或生物的先天代谢、病原性和病毒性特征，可以将特定微生物的荧光变化分析用于将微生物归类为临床相关组或类别。
权利要求
1.一种用于检测和/或鉴定可能存在于样本中的生物颗粒的方法，所述方法包括使用光谱技术得到至少两个与时间相关的包括样本的生长成分的测量结果，并且将所述测量结果关联以检测和/或鉴定存在于所述样本中的任意生物颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包括血液、体液、或不透明物质，并且其中所述生物颗粒是微生物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述样本是临床样本，并且所述生长成分是液体培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本是非临床样本。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒是微生物并且所述微生物鉴定为归入一个或多个分类模式中，所述分类模式选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、 以及天然固有荧光组形成的组。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分类模式将所述微生物鉴定成归入革兰氏组，所述革兰氏组选自由革兰氏染色剂染为深蓝色的革兰氏阳性微生物、革兰氏染色剂染为红色的革兰氏阴性微生物或革兰氏染色剂染为深蓝色的酵母细胞形成的组。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述分类模式将所述微生物鉴定为归入临床革兰氏组，所述临床革兰氏组选自一个或多个由球菌、双球菌、杆菌或芽孢杆菌形成的组。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述分类模式将所述微生物鉴定为归入治疗组， 其中将高耐受肠杆菌科(EB)物种与敏感EB物种区别开，或将耐氟康唑念珠菌物种与敏感念珠菌物种区别开。
9.根据权利要求1所述的方法，其中一经检测所述生物颗粒，就提供自动通知。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述方法开始后的48小时内进行所述检测。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱技术包括表面荧光和漫反射，并且所述成分包括液体培养基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述光谱技术包括以大约每五分钟至大约每一小时的时间间隔激发所述样本。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在检测之后的8小时内进行所述鉴定。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述关联包括将所述至少两个与时间相关的测量结果和已知生物颗粒的对比测量结果进行比较。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述关联是鉴定所述生物颗粒。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述关联是检测所述生物颗粒。
17.一种用于检测和/或鉴定可能存在于样本中的生物颗粒的自动化系统，所述系统包括(1)生长室，包括生长成分和所述样本；( 测量装置，包括与时间相关的反射分光仪和/或荧光分光仪，以获得所述样本在两个或更多时间点的反射和/或荧光测量结果；以及 (3)用于关联所述测量结果以检测和/或鉴定所述生物颗粒的装置，其中所述生长室设置在所述分光仪中，并且所述测量非侵入至所述生长室中。
18.根据权利要求17所述的自动化系统，其中所述关联包括将所述两个或更多时间点的所述与时间相关的反射和/或荧光测量结果与已知生物颗粒的对比测量结果进行比较。
19.根据权利要求18所述的自动化系统，其中所述比较使用软件进行。
20.根据权利要求17所述的自动化系统，其中所述分光仪被设置成监测微生物的生长参数以及由于微生物的代谢活动而产生的复合培养基内的变化。
21.根据权利要求17所述的自动化系统，其中所述生长室是密封容器。
22.根据权利要求17所述的自动化系统，其中所述生长室进一步包括传感器，非侵入性地检测生物颗粒的生长。
23.根据权利要求16所述的自动化系统，进一步包括自动通知装置，一经检测所述生物颗粒，所述自动通知装置就提供信号。
24.根据权利要求19所述的自动化系统，其中所述系统进一步包括第二自动通知装置，一经鉴定所述生物颗粒，所述第二自动通知装置就提供信号。
25.一种用于检测和/或鉴定可能存在于样本中的生物颗粒的方法，所述方法包括下列步骤(a)将包括所述样本和生长成分的容器引入诊断系统中，其中在所述容器被引入所述诊断系统之前或之后，所述样本和生长成分就可以被容纳在所述容器中；(b)在一个或更多预定时间点照射所述容器或连续地照射所述容器；(c)分别在所述一个或更多预定时间点或连续地监测所述被照射的成分，以得到至少两个测量结果，分别用于反射和荧光，其中以等于或大于用于照射波长的波长控制所述监测；以及(d)关联所述测量结果以检测和/或鉴定所述生物颗粒。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述关联包括将所述至少两个测量结果与已知生物颗粒的对比测量结果比较。
27.根据权利要求25所述的方法，其中关联所述测量结果用于鉴定所述生物颗粒归入微生物分类模式，所述微生物选自由以下一个或多个形成的组(a)球菌；(b)双球菌；(c) 杆菌；或(d)芽孢杆菌。
28.根据权利要求25所述的方法，其中关联所述测量结果用于鉴定所述生物颗粒归入微生物分类模式，所述微生物选自由以下一个或多个组成的形态组(i)革兰式阳性球菌； ( )链式排列的革兰式阳性球菌；(iii)群聚的革兰氏阳性球菌；(iv)革兰氏阳性双球菌；(ν)革兰氏阳性杆菌；(vi)具有内生孢子的革兰式阳性杆菌；(vii)革兰氏阴性杆菌； (viii)革兰氏阴性球杆菌；(ix)革兰氏阴性双球菌；(χ)酵母；以及(xi)丝状真菌。
29.根据权利要求25所述的方法，其中关联所述测量结果用于鉴定所述生物颗粒归入微生物分类模式，所述微生物选自由下列形成的组的一个或多个形成的治疗组(a)来自敏感EB物种的高耐受肠杆菌科(EB)物种；以及(b)来自敏感念珠菌物种的耐氟康唑念珠菌物种。
30.根据权利要求25所述的方法，其中关联所述测量结果用于鉴定所述生物颗粒归入微生物的分类模式，所述微生物选自由一个或多个非发酵生物和发酵生物组成的组的功能组。
全文摘要
本发明提供一种用于监测、检测和/或鉴定可能存在于样本中的生物颗粒的方法和系统，通过利用与时间相关的光谱技术非侵入性地实现该方法，以得到包括样本的生长成分的至少两个测量结果，并且关联所述测量结果用于可能存在于样本中的生物颗粒的检测和/或鉴定。
文档编号B01L3/14GK102176971SQ200980137665
公开日2011年9月7日 申请日期2009年7月23日 优先权日2008年7月24日
发明者布拉德福德·G·克莱, 琼斯·M·海曼, 瑟曼·C·索普, 约翰·D·沃尔什 申请人:生物梅里埃公司