专利名称：一种纳喷毛细管高压液相色谱柱及其制备方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，更具体地，本发明公开了一种纳喷毛细管高压液相色谱柱及其制备方法。
背景技术：
液相色谱和质谱串联使用已经成为分析化学和蛋白质组学研究领域的通用技术平台。石英材质的毛细管液相色谱微柱由于具有高分辨率、高灵敏度和高精度等特性，得到了广泛的应用，已经成为高通量蛋白质组学技术平台的必需组分和基础(Link，A.J. ；Eng, J. ；Schieltz, D. M. ；Carmack, E. ；Mize, G. J. ；Morris，D. R. ；Garvik，B. Μ. ；Yates, J. R.， 3rd,Direct analysis of protein complexes using massspectrometry. Nat Biotechnol 1999，17(7) ,676-82.)。低阻力、低反压和高流速的石英材质毛细管液相色谱空柱是制备高分辨率、高灵敏度和高精度液相色谱微柱的前提。早在1985年，Ibrahim等在毛细管的一端用玻璃状熔结物堵塞制成平端高压液相色谱柱(Ibrahim，Μ. ；Nisamaneepong，W. ；Caruso，J.，Microcolumn highpressure liquid chromatography with a glass-frit nebulizer interface for plasmaemission detection. J Chromatogr Sci 1985, 23 (4), 144-50) 0 Henzel 等将同样方法制备的高压液相色谱柱与质谱联用分析多肽混合物，从而将这一技术引入蛋白质组学领域(Henzel， W. J. ；Bourel1, J. H. ；Stults, J. Τ. , Analysis of protein digests bycapi1Iary high-performance liquid chromatography and on-line fast atombombardment mass spectrometry. Anal Biochem 1990，187 (2)，228-33.)。但这些平端的高压液相色谱柱由于多肽的离子化效率低，限制了蛋白质组学分析的灵敏度。Valaskovic等尝试了带尖端石英毛细管熔封技术，制备了带尖端的高压液相色谱柱。在该技术中，Valaskovic将可熔结的细小粒径材料微粒与易挥发溶剂制成悬浊液，并将拉制的带有锥形毛细管尖端的石英毛细管浸泡在这种液体中，通过毛细管的虹吸作用，这些细小粒径可熔结的材料被渗入毛细管。经蒸发干燥和熔结处理，这些可熔结的细小粒径材料被烧结并附在锥形毛细管尖端，由此形成带尖端的高压液相色谱柱(美国专利US5，997，746)。这种色谱柱可以使经分离和洗脱的多肽直接喷射进质谱。同时，由于使用了熔结的锥形毛细管尖端，减小了色谱分离后柱的死体积，减轻了宽的分离色谱峰现象，由此提升了分析的灵敏度。这种柱子同时也可减少柱子尖端被阻塞的几率，使系统更加容易操作。但由于毛细管柱尖端的内径较小，只有5-15 μ m， 因此在Valaskovic的技术中只有更小粒径(如；Γ5 μ m，甚或更小)的可熔结材料才能渗入毛细管尖端。这种材料一旦熔结，其产生的中空间隙小，在填充柱子时尖端产生的反压大， 柱子填充速度慢，单位时间内有效填充的柱长短，填充效率低。随着柱长的增加，填柱的反压呈指数式增加，因此在低压条件下能填装的柱子长度有限。在分离样品时，这种柱子的反压大，流速低，难于通过增加柱长来提高多肽样品的分离效率
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人发展了充填了的石英质毛细管同步熔结拉制纳喷毛细管高压液相色谱柱制备技术，即本发明的申请人将Valaskovic的四步纳喷毛细管高压液相色谱柱制备流程(单根纳喷毛细管高压液相色谱柱制备过程包括毛细管除包被、毛细管尖端拉制、填柱、烧结等四个步骤)改进为三个步骤可熔结大颗粒介质填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制从而可以使直径大于10 μ m以上的可熔结大颗粒介质被轻易装填入柱子。这些材料被熔结后，可以产生大的中空间隙，因此，在填充柱子时尖端产生的反压小，流速快、柱子填充速度快；在分离样品时，这种柱子的反压相对小，流速高，从而在通常的液相色谱上在相同的压力下，可以使用更长的色谱柱，因而也有效地提高了色谱柱的分辨效率。在柱子制备时，由于将毛细管除包被、毛细管尖端拉制、填柱、烧结等四步法制备一根毛细管柱为可熔结大颗粒材料填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制等三步法同时制备两根色谱柱，提高了工效。具体地，本发明公开了一种纳喷毛细管高压液相色谱柱，流速与毛细管柱内径符合方程Δ P = (9. 86xl(T8) [ (FL) /d4]其中，ΔΡ是压力的变化，单位为psi ；F代表流速(mL/min) ；L代表毛细管长度 (cm) ；d代表毛细管内径(cm)。以75 μ m内径毛细管装填IOcm长3 μ m粒径C18填料的纳喷毛细管柱，其流速大于0. 6 μ 1/min。本发明还公开了上述纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，包含可熔结大颗粒材料填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制三个步骤。更具体地，可熔结大颗粒材料填装步骤包括将玻璃微球装入石英管中，玻璃微球的粒径为10-15 μ m，石英管为聚酰亚胺包被的石英管，外径可为30(Γ400μπι，内径可为 50^200 μ m ；毛细管除包被步骤为将装填有玻璃微球的石英管中部在火上烧灼，除去聚酰亚胺包被层；毛细管色谱柱拉制步骤包括利用美国Sutter仪器公司P-2000型激光拉针仪，通过调节热度和速度参数经由激光加热将石英管拉制成两根带锥形尖端的毛细管柱。其中热度为36(Γ400摄氏度，相对速度设置为40。
附图1. Valaskovic的四步纳喷毛细管高压液相色谱柱制备流程和拉制烧结高流速纳喷毛细管高压液相色谱柱同步制备技术流程比较。Valaskovic的四步法纳喷毛细管高压液相色谱柱制备流程(图1-A)，单根纳喷毛细管高压液相色谱柱制备过程包括毛细管除包被、毛细管尖端拉制、填柱、烧结等四个步骤；三步法拉制烧结高流速纳喷毛细管高压液相色谱柱同步制备技术流程(图1-B)为可熔结大颗粒介质填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制等三步，可同时制备两根纳喷毛细管高压液相色谱柱。附图2.玻璃微球装填毛细管柱；将装有0. 5毫升100%甲醇、一磁性搅拌棒F和 50 μ g 10-15 μ m粒径的玻璃微球的2毫升安培瓶E放入一压力填充器(pressureinjection cell, Next Advance Inc. 24 Prospect Avenue, Averill Park, NY12018)D，置于磁力搅拌器G上，混悬；将一根外径360 μ m、内径200 μ m长25cm聚酰亚胺(polyimide)包被的石英管 B—头用 M-130 型末端螺母型(M-130end-fitting with SST filter, IDEX health & Science, 619 Oak Street，OakHarbor，WA)过滤器A固定，另一头插入装有玻璃微球的混浊液中，并被固定在压力填充器上；加压后带有玻璃微球的混悬液被压入石英管，液体从过滤器A流出，而玻璃微球被滞留在毛细管中；附图3.烧结和拉制毛细管柱；附图4.烧结和拉制制备的毛细管柱；附图5.反向冲洗清楚装填的未被烧结的玻璃微球。
具体实施例方式以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实施例1将装有0.5毫升100%甲醇、一磁性搅拌棒和50yg 10-15 μ m粒径的玻璃微 求(Michrom Bioresources, Auburn, CA)白勺 2 S^^JtM^A —(pressure injection cell, Next Advance Inc. 24Prospect Avenue, Averi IlPark, NY 12018),置于磁力搅拌器上，混悬。将一根外径360 μ m、内径200 μ m长25cm聚酰亚胺(polyimide)包被的石英管(Polymicro Technologies, Phoenix, Ar) 一头用 M-130 型末端螺母型(M-130 end-fitting with SST filter,IDEXhealth & Science,619 Oak Street,Oak Harbor,WA) 过滤器固定，另一头插入含有玻璃微球的混浊液中，并固定在压力容器上。加压，使玻璃微球装填进石英管至15cm长(图2)。将装填有玻璃微球的石英管中部Icm宽的部分在火上烧灼约30秒，除去聚酰亚胺包被层。除去包被层的石英管固定在激光拉针仪P-2000 (SutterInstruments，Novato, Calif.)上，将热度调节设置在360摄氏度，速度设置在40。通过激光加热，烧结管内易熔结大粒径玻璃微球，并拉制成两根带锥形尖端的毛细管柱。锥形尖端的直径在15 μ m左右 (图3，图4)。将拉制成的一端烧结的毛细管锥形尖端插入装有100%甲醇的2毫升安培瓶中， 并放入一压力填充器(pressure injection cell,Next Advance Inc. 24Prospect Avenue, Averill Park, NY 12018)。加200大气压的高压，将非烧结的玻璃微球反向冲洗出毛细管 (图5)得到内径为200 μ m低反压高流速纳喷毛细管高压液相色谱空柱。实施例2方法与实施例1相同，只是换用150 μ m内径、360 μ m外径的聚酰亚胺包被的石英管(Polymicro Technologies,Phoenix, Ar)；激光拉针仪的热度调节设置在380摄氏度，速度设置在40。以此制备内径为150 μ m低反压高流速纳喷毛细管高压液相色谱空柱。实施例3方法与实施例1相同，只是换用100 μ m内径、360 μ m外径的聚酰亚胺包被的石英管(Polymicro Technologies, Phoenix, Ar)；激光拉针仪的热度调节设置在390度，速度设置在40，重复两次。以此制备内径为100 μ m低反压高流速纳喷毛细管高压液相色谱空柱。实施例4方法与实施例1相同，只是换用75 μ m内径、360 μ m外径的聚酰亚胺包被的石英管(Polymicro Technologies, Phoenix, Ar ；激光拉针仪的热度调节设置在400摄氏度，速度设置在40，重复两次。以此制备内径为75 μ m低反压高流速纳喷毛细管高压液相色谱空柱。
实施例5方法与实施例1相同，只是换用50 μ m内径、360 μ m外径的聚酰亚胺包被的石英管 (Polymicro Technologies, Phoenix, Ar)；激光拉针仪的热度调节设置在400摄氏度，速度设置在40，重复三次。以此制备内径为50 μ m低反压高流速纳喷毛细管高压液相色谱空柱。实施例6将装有0. 5毫升100%甲醇、一磁性搅拌棒和50 μ g 3 μ m粒径的C18填料(孔径 200 A ； Michrom Bioresources, Auburn, CA)的 2 毫升安培瓶放人一压为填充器(pressure injection cell,Next Advance Inc. 24 Prospect Avenue, Averill Park, NY 12018),置于磁力搅拌器上，混悬。将一根由实施例4制备的外径360 μ m、内径75 μ m长25cm聚酰亚胺 (polyimide)包被的石英管(Polymicro Technologies,Phoenix,Ar)非柱尖一端插入含有 3 μ m粒径的C18填料的混浊液中，并固定在压力容器上。加压至150个大气压，边搅拌、边填充，使C18填料装填进纳喷毛细管色谱空柱至IOcm长(图2)。比较Valaskovic的四步纳喷毛细管高压液相色谱柱制备流程和由实施例4中拉制烧结高流速纳喷毛细管高压液相色谱柱同步制备技术所得的75 μ m内径纳喷毛细管高压液相色谱空柱的填充时间，技术参数如表1。Valaskovic方法所得的纳喷毛细管高压液相色谱柱根据美国专利(USP5，997，746)制备。柱子填充时间根据Fisher公司的实验计时器测定的3次结果的平均值确定。表 1
制备方法柱内径纳喷柱填料压力柱长柱子填充(μηι)尖端孔粒径(bar)(cm)时间(min)径(μιη)(μηι)Valaskovic的专利方法75631501030±0.5拉制烧结同步制备技术75631501019士0.6本发明的申请人对实施例1、实施例2、实施例3、实施例5得到的产品与实施例4 得到的纳喷毛细管高压液相色谱空柱进行了比较。在相同的压力填充器压力下，以相同的填装材料填充相同长度的柱子，其柱子的填充时间符合方程T1/T2 = Cl2Vd12其中，Tl代表1#管内径的纳喷毛细管高压液相色谱柱填装所需的时间(min) ；T2 代表姊管内径的低反压高流速纳喷毛细管高压液相色谱柱填装所需的时间(min)汍代表 1#毛细管内径(cm) ;d2代表姊毛细管内径(cm)。实施例7将装有0. 5毫升100%甲醇、一磁性搅拌棒和50 μ g 3 μ m粒径的C18填料(孔径 200 A ； Michrom Bioresources, Auburn, CA)的 2 毫升安培瓶放入一压力填充器(pressure injection cell,Next Advance Inc. 24 Prospect Avenue, Averill Park, NY 12018),置于磁力搅拌器上，混悬。将一根由实施例4制备的外径360 μ m、内径75 μ m长25cm聚酰亚胺 (polyimide)包被的石英管(Polymicro Technologies,Phoenix,Ar)非柱尖一端插入含有 3 μ m粒径的C18填料的混浊液中，并固定在压力容器上。加压至150个大气压，边搅拌、边填充至IOcm长(图2)。
将填装好的柱子连接到液相色谱，分别用50%缓冲液A(缓冲液A :0. 4%乙酸， 0. 005% HFBA，5%乙氰)和50 %缓冲液B (0. 4%乙酸，0. 005 % HFBA，95 %乙氰)混合液平衡一小时以及缓冲液A平衡一小时。以缓冲液A持续地冲洗平衡后的纳喷毛细管高压液相色谱柱，调节流速使压力稳定在150bar。以VWR公司的5 μ 1毛细管(VWR，West Chester,PA)测定柱流速2分钟。取 3次测定结果的平均值作为柱流速(表2)。Valaskovic方法所得的纳喷毛细管高压液相色谱柱根据美国专利 (USP5，997，746)制备。柱流速测定的方法同上。表权利要求
1.一种纳喷毛细管高压液相色谱柱，其流速与毛细管柱内径符合方程AP = (9·86Χ10_8) [(FL)/d4]其中，Δ P是压力的变化，单位为psi ；F代表流速，单位为mL/min ；L代表毛细管长度， 单位为cm ；d代表毛细管内径，单位为cm。
2.权利要求1所述的纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，包含可熔结大颗粒材料填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制三个步骤。
3.权利要求2所述的纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，其中可熔结大颗粒材料填装步骤包括将玻璃微球装入石英管中，玻璃微球的粒径为10-15 μ m。
4.权利要求3所述的纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，其中石英管为聚酰亚胺包被的石英管，外径可为30(Γ400 μ m,内径可为5(Γ200 μ m。
5.权利要求2、任一所述的纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，其中毛细管除包被步骤为将装填有玻璃微球的石英管中部在火上烧灼，除去聚酰亚胺包被层。
6.权利要求2飞任一所述的纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，其中毛细管色谱柱拉制步骤包括利用激光拉针仪调节热度和速度通过激光加热将石英管拉制成两根带锥形尖端的毛细管柱。
7.权利要求6所述的的纳喷毛细管高压液相色谱柱的制备方法，其中热度为36(Γ400 摄氏度，相对速度设置为40。
全文摘要
本发明属于分析化学领域，更具体地，本发明公开了一种纳喷毛细管高压液相色谱柱及其制备方法；该液相色谱空柱的制备包括在聚酰亚胺包被的石英毛细管填装可熔化凝固的大颗粒材料、毛细管外聚酰亚胺包被的去除和毛细管色谱柱拉制三个步骤。本发明公开的色谱柱可熔化凝固大颗粒材料的粒径为10-15μm，加热熔化后可形成大的中空间隙；本发明公开的色谱柱与常规的色谱柱相比具有尖端反压小，同样压力条件下流速快、柱子填充速度快的优点；在分离样品时，这种柱子的反压相对小，流速高，从而在普通液相色谱上在相同的压力下，可以使用更长的色谱柱，从而可有效地提高色谱柱的分辨率和鉴定目的蛋白的效率。
文档编号B01D15/22GK102243220SQ20101017137
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者徐平, 杨大福 申请人:徐平