专利名称：一种具有皮升级精度的自动化微液滴阵列筛选系统的使用方法
技术领域：
本发明涉及的领域为高通量筛选领域，特别涉及一种具有皮升级精度的自动化微液滴阵列筛选系统的使用方法。
背景技术：
高通量筛选系统起源于药物筛选的研究，它主要以96或者384孔板为阵列化反应器，通过自动化机器人进行液体分配和试样混合，采用高灵敏、高速的检测装置和数据处理软件对实验结果进行分析和处理，实现每天至少10，000样的筛选通量。由于其强大的筛选和分析功能，高通量筛选技术的应用范围已从药物筛选扩展到生物学、医学、化学等多个科学领域。然而，随着新的靶标和样本量的迅速增加，基于多孔板的商品化高通量液体处理与筛选系统逐渐面临巨大的挑战。用于筛选的化合物主要来源于人工合成或从天然产物中分离纯化得到，成本较高。目前，基于多孔板的高通量筛选系统的试样消耗体积在1-100微升。如果能在皮升至纳升级的水平上操纵液体，来对样品进行筛选，则有可能将其成本降低1000-100000倍。因此，无论是在工业界还是在学术界，大量的研究均集中在高通量筛选系统的微型化。比如，英国Douglas公司研制OryxNano系列液体处理装置的最小液体处理体积是 100 纳升(http://www. douglas. co. uk/oryxnano. htm)。英国 TTP LabTech 公司研制的Mosquito系列液体处理装置的最小液体操纵体积达到25纳升(www. ttplabtech. com/products/mosquito/)ο这些仪器的应用显著的降低了筛选和研发的成本。然而，目前仍然缺少可在几个纳升甚至皮升级体积上进行液体操纵和高通量筛选的技术和装置。皮升级高通量筛选的研究难点主要体现在1)现有仪器设备难以在皮升级进行可靠的液体操纵，比如准确液体量取、液体转移、试样混合等；2)随着液体体积的缩小，蒸发效应显著增加。比如在典型实验室条件下，一个皮升级的水相液滴会在I秒内完全挥发；3)微体系下的液体具有极大的比表面积，由于水/气界面和水/固界面上的分子自组装或者非特异性作用，容易引起生物活性分子的失活、损失以及交叉污染，从而导致筛选结果的假阳性或者假阴性。基于液滴的微流控技术是近年来高通量筛选微型化研究领域中的热点之一。它通过微米级通道中多相流体的控制，实现大批量油包水或水包油型液滴微反应器的生成、试样混合、反应、以及分析鉴定。液滴反应器的尺寸可在飞升级至纳升级灵活调节，从而可能实现超低消耗的高通量筛选。由于油相的包裹和保护作用，有效抑制了液滴反应器的溶剂蒸发和稀释作用，以及样品间的交叉污染。利用生物兼容性表面活性剂分子的自组装效应，可以给生化筛选反应提供一个温和均一的微环境，有利于提高分析筛选的准确性。同时，液滴反应器微小的体积有利于加速物质间的传质，提高反应效率。因此，基于液滴的微流控技术因其优异的特性有可能成为新一代的高通量筛选技术。目前，基于液滴的微流控筛选方法主要有三种，分别为液滴储存器方法、滑动芯片方法、以及液滴组装方法。液滴储存器是首先采用逐个抽取的方法将不同的待筛选样品溶液装载至毛细管中形成液滴，然后将该毛细管与微流控芯片通道连接，通过芯片上的T型接口将靶标溶液注入到液滴中触发反应，最后将形成的液滴反应器收集至另外一个毛细管中进行孵育反应和检测(Zheng B. , Ismagilov R. F. Angew. Chem. , Int. Ed. , 2005,44，2520)。滑动芯片方法则首先在下片的阵列化微孔中装入待筛选样品形成液滴，然后滑动上片使上片微通道中的靶标试剂溶液与下片的液滴混合，进行触发反应和筛选(Du W.B·, Li L. , Nichols K. P·, Ismagilov R. F. Lab Chip, 2009，9，2286)。然而，上述两种方法均需要手动的液滴装载、毛细管和芯片通道的连接，以及精密的芯片滑动操作，难以应用于大规模样品的筛选。液滴组装方法利用自动化的样品管和试剂管的快速切换，在液滴形成的过程中完成待筛选样品和试剂的混合，然后将液滴储存至毛细管和芯片上进行反应和检测(Du W. B·, Sun M. , Gu S. Q. , Zhu Y. , FangQ. Anal. Chem. , 2010，82，9941 ;方群，杜文斌，孙蒙，基于液滴顺序组装技术的微流控液滴生成系统及使用方法，中国发明专利，申请号=201010250945. O)。尽管液滴顺序组装技术解决了液滴筛选的自动化和大规模样品筛选的难题，但是由于含有样品和试剂的液滴的生成采用了逐个组装方法，其筛选速度难以提高。另外，由于微型化带来的尺寸效应，上述几种液滴筛选方法都难以在皮升级体积进行生化筛选测定。在微流控液滴系统中，平行化的试剂加入方法主要可分为两类。第一类采用一个T型分支通道将一相同试剂注入到主通道中的不同的液滴中(Zheng B.，Ismagilov R. F.Angew. Chem. , Int. Ed.，2005, 44，2520)。这类方法经常与上述的液滴储存器方法进行联用，用于基于液滴的微量筛选。然而，这类方法的主要问题是在T型通道交叉口存在较大的液滴样品残留，从而引起液滴间的交叉污染。另外一类方法采用液滴融合技术进行平行化的试剂加入。首先为微通道中生成互相配对的样品和试剂的液滴，然后利用流体动力辅助或者介电辅助的方法使配对好的液滴融合形成独立的微反应器(Teh S Y, Lin R. HungL. H. , LeeA. P. , Lab Chip, 2008，8:198)。然而此类方法结构较为复杂，加工难度大，并且难以用于具有大量不同样品的筛选系统中。并且，上述两类方法的实现都需要复杂的液体流速调节、液滴频率、液滴大小的控制、液滴位置的反馈等手动调节手段，难以实现可靠的自动化，在仪器产业化方面存在较大的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有皮升级分辨率的自动化微阵列液滴筛选系统及其使用方法。该系统可进行全自动的皮升级液体的量取、不同样品液滴阵列的形成、靶标试剂的平行化定量加入、以及微量体积下的反应测定。该系统既可用于高通量药物筛选，也可用于催化剂筛选、酶动力学分析、疾病诊断、以及单细胞和单分子分析中。本发明的具体技术方案如下
本发明是具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，系统包括毛细管、液体驱动系统、微孔阵列芯片、样品/试剂储存管和自动平移台，具体步骤为
1)将液体驱动系统和毛细管中充满低热膨胀系数的液体作为载流，并完全排空毛细管内的气泡；
2)将毛细管取样端浸入与水相样品不互溶的油相中抽取一段油相至毛细管中，用于隔离水相样品和载流；
3)将毛细管取样端浸入样品/试剂储存管中抽取一定体积的水相样品溶液进入毛细
管；
4)将毛细管取样端移入微孔阵列芯片的微孔上方的油相中，将毛细管中的样品溶液推出至微孔中形成样品的液滴；
本发明所述的步骤4)后还包括如下具体步骤
a)在微孔阵列芯片上形成化学组成或者浓度不同的多个待筛选样品的液滴； b)在毛细管中一次抽取大量的试剂，并将毛细管取样端分别插入至每个样品的液滴中，注入一定体积的试剂，形成液滴反应器，完成样品与试剂的混合、反应、检测和筛选。本发明所述的步骤4)后还包括如下具体步骤 m)在微孔阵列芯片上形成大量的试剂的液滴；
η)在每个试剂的液滴中分别注入待筛选的样品溶液，形成液滴反应器，完成试剂与样品的混合、反应、检测和筛选。本发明所述的液体驱动系统具有数纳升/分钟的液体驱动精度，其驱动液体的流速范围是I纳升/分钟至500纳升/分钟。本发明为了消除液体驱动系统在转换液体驱动方向时，即从抽取转换至推出或者从推出转换至抽取这一期间所存在的机械回差，保证皮升级的液体量取精度，在抽取水相样品或试剂溶液之前先抽取一定额外体积的油相进入毛细管；在将样品或试剂溶液推出毛细管时,也将额外抽取的油相一并推出毛细管。本发明所述的液体驱动系统和毛细管中充满低热膨胀系数的液体作为载流，来防止实验过程中温度波动对液体驱动精度的影响，载流的热膨胀系数范围为O. 00001/摄氏度至O. 0005/摄氏度。本发明所述的毛细管采用较薄的管壁，有利于实现皮升级的液体量取以及降低液体在毛细管取样端的残留；毛细管的管壁厚度范围是I微米至100微米。本发明所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，在使用之前，对液体载流和油相进行脱气处理，防止在液体驱动过程中产生气泡。本发明在使用时，微孔阵列芯片的微孔的上方，与样品/试剂储存管的上方均覆盖一层与水相不互溶的油相，以防止微量液滴、样品和试剂暴露在空气中挥发或受到污染，油相的厚度范围为O.1毫米至10毫米。本发明在使用时，为了消除筛选反应过程中油相对微量生化反应的干扰，在油相中添加生物兼容性的表面活性剂，利用表面活性剂分子在油水界面的自组装效应，来降低生物分子在界面的吸附和失活，表面活性剂的浓度为O. 01%至10%。本发明的优点主要在于(1)液体的定量量取和液滴生成具有皮升级的体积精度，有效降低了高通量筛选中的样品/试剂消耗，节省了实验成本；(2)采用将毛细管插入待筛选样品液滴中，分别连续注入试剂来完成样品和试剂的混合、反应检测和筛选，有效提高了筛选的通量，并降低了产生交叉污染的风险；(3)液体量取、推出、液滴生成、以及试剂注入等过程完全自动化，有效降低了人为失误和误差，易于实现系统的产业化和广泛普及。
图1是具有皮升级精度的液滴阵列筛选系统及使用方法示意 图2是采用毛细管插入液滴的方法，在待筛选样品液滴中依次注入试剂的过程示意
图3是利用液滴阵列筛选系统进行Caspase-1酶抑制剂筛选的俯视荧光图片；
图4是对筛选得到的抑制剂28进行半抑制浓度测定结果记录图。图中1-毛细管，2-液体驱动系统，3-微孔阵列芯片，4-液体载流，5-水相样品，6-油相，7-样品/试剂储存管，，8-微孔，9-样品的液滴，10-试剂，11-液滴反应器。
具体实施例方式下面对本发明的技术方案作详细阐述
本发明涉及一种具有皮升级分辨率的微阵列液滴筛选系统，由毛细管、液体驱动系统、微孔阵列芯片、液体驱动系统、样品/试剂储存管和自动平移台组成。液体驱动系统与毛细管相连用于微量液体的定量抽取和推出，样品/试剂储存管和微孔阵列芯片固定在可三维移动的自动平移台上，样品/试剂储存管用于储存实验所需的样品和试剂，微孔阵列芯片用于微量液滴的储存、反应、检测和筛选。根据本发明，所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统，其特征的使用方法是首先将液体驱动系统和毛细管内充满低热膨胀系数的液体作为载流，并完全排空毛细管内的气泡；然后将毛细管取样端浸入与水相样品不互溶的油相中抽取一段油相至毛细管中，用于隔离水相样品和载流；再将毛细管取样端浸入样品/试剂储存管中抽取一定体积的水相样品溶液进入毛细管；最后将毛细管取样端移入微孔阵列芯片的微孔上方的油相中，将毛细管中的样品溶液推出至微孔中形成样品液滴。根据本发明，为了提高筛选的通量，首先在微孔阵列芯片上形成化学组成或者浓度不同的多个待筛选样品液滴，然后在毛细管中一次抽取大量的试剂，并将毛细管取样端分别插入至每个样品液滴中，注入一定体积的试剂，形成液滴反应器，完成样品与试剂的混合、反应、检测和筛选。作为另外一种方案，也可首先在微孔阵列芯片上形成大量的相同化学组成和浓度的试剂液滴，然后在每个试剂的液滴中分别注入待筛选的不同化学组成和浓度的样品溶液，形成液滴反应器，完成试剂与样品的混合、反应、检测和筛选。根据本发明，其特征在于，液体驱动系统具有正向推出和反向抽取的液体驱动能力，流速为I皮升/分钟至100微升/分钟，量取液体的体积在I皮升至100微升。作为优选，为完成皮升级液体的量取，所述的液体驱动系统具有数纳升/分钟的液体驱动精度，其驱动液体的流速范围是I纳升/分钟至500纳升/分钟，量取液体的体积范围在I皮升至1000皮升；
根据本发明，为了消除液体驱动系统在转换液体驱动方向时(从抽取转换至推出状态时或者从推出转换至抽取状态时)存在的机械回差，保证皮升级的液体量取精度，在抽取水相样品或试剂溶液之前先抽取一定额外体积的油相进入毛细管；在将样品或试剂溶液推出毛细管时，也将额外抽取的油相一并推出毛细管。根据本发明，液体驱动系统和毛细管中充满低热膨胀系数的液体作为载流，来防止实验过程中温度波动对液体驱动精度的影响，作为优选，载流的热膨胀系数范围为O.00001/摄氏度至O. 0005/摄氏度。根据本发明，为实现皮升级的液体量取以及降低液体在毛细管取样端的残留，对毛细管的取样端进行拉尖处理来降低取样端尖端的直径和横截面积，作为优选，取样端尖端的直径范围是I微米至100微米；同时对毛细管的内壁和取样端外壁进行疏水化处理。根据本发明，采用管壁较薄的毛细管，有利于实现皮升级的液体量取以及降低液体在毛细管取样端的残留，减小量取不同液体时产生的交叉污染。作为优选，毛细管的管壁厚度范围是I微米至100微米。根据本发明，在使用之前，对液体载流和油相进行(真空或者超声)脱气处理，防止在液体驱动过程中产生气泡。气泡的存在会显著降低对微量皮升级液体的量取精度。根据本发明，在抽取样品(或试剂)溶液之前，毛细管中预先抽取一段与样品(或试齐U)溶液不互溶的油相来隔离样品(或试剂)和低热膨胀系数的液体载流；作为优选，油相的长度范围为50微米至20毫米。根据本发明，微孔阵列芯片上加工多个用于盛载微量液体的小坑。每个小坑的体积范围是I皮升至100微升。根据本发明，使用时，芯片上的微孔阵列与样品/试剂储存管的样品/试剂管上覆盖一层油相，以防止微量液滴和样品暴露在空气中挥发或受到污染，油膜的厚度为O.1毫米至10毫米。使用时，微孔阵列芯片上的微孔的上方，与试样样品/试剂储存管的上方，均覆盖一层与水相不互溶的油相，以防止微量液滴、样品和试剂暴露在空气中挥发或受到污染，作为优选，油相的厚度范围为O.1毫米至10毫米。根据本发明，作为一种优选方案，为了消除筛选反应过程中油相对生化反应的干扰，在油相中添加生物兼容性的表面活性剂，利用表面活性剂分子在油水界面的自组装效应，来降低生物分子在界面的吸附和失活，作为优选，表面活性剂的浓度范围为O. 01%至10%。根据本发明，采用多个毛细管或者多个液体驱动装置，同时进行多种液体样品/试剂的量取、推出和液滴生成操作。下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明
参照附图，以下将详细描述根据本发明的优选实施例。图1是具有皮升级精度的液滴阵列筛选系统及使用方法示意图。其使用方法如下使用毛细管I作为取样探针，将其尾部与液体驱动系统2相连。毛细管I和液体驱动系统2内均充满低热膨胀系数的液体作为载流4，并在毛细管I的取样端引入一段与水相不互溶的油相6来分隔水相样品5和载流4。移动毛细管I或者样品/试剂储存管7，使毛细管I取样端浸入油相6中抽取一定额外体积的油相6进入毛细管I取样端；再将毛细管I取样端浸入样品5中定量抽取一定体积的样品5进入毛细管。然后再次移动毛细管I或者微孔阵列芯片3，使毛细管I取样端置于芯片3上微孔8上方的油相6中。启动液体驱动系统2将毛细管I中的微量液体样品5和额外抽取的油相6推出至微孔8中，形成微量水相样品5的液滴9。在利用该系统生成液滴阵列前，毛细管I的取样端进行拉尖处理，并对毛细管I的内外壁、以及微孔阵列芯片3的表面进行疏水化表面处理。对液体载流4和油相6进行真空脱气或者超声脱气处理，防止在液体驱动过程中产生气泡。
图2是采用毛细管插入液滴的方法，在待筛选样品液滴中依次注入试剂的过程示意图。根据图1所述的方法，在微孔阵列芯片3上生成含有不同化学组成或浓度的样品液滴9的阵列。在取样毛细管I中抽取大量体积的试剂10，然后移动毛细管I或者微孔阵列芯片3，使毛细管I取样端插入样品液滴9中，启动液体驱动系统2，推出一定体积的试剂10进入样品液滴9中，完成样品/试剂的混合,形成液滴反应器11。实施例1
图3是根据图1和图2所述的液滴阵列筛选系统及使用方法，以32个小分子化学物作为待筛选样品，以Caspase-1酶作为筛选靶标进行酶抑制剂筛选得到的荧光图片。首先将100 μΜ的小分子化合物装入样 品/试剂储存管中。采用图1所述的液滴阵列生成方法在微孔阵列芯片上生成32个小分子化学物的液滴，每个液滴的体积为180皮升。然后按照图2所述的靶标试剂注入方法，分别向每个液滴中注入180皮升的Caspase-1酶溶液(6 mU/μυ以及180皮升的底物(Z-YVAD-Rl 10)溶液(20 μΜ)来触发反应。将微孔阵列芯片在35摄氏度条件下孵育I个小时，采用荧光成像的方法获取实验结果。分析实验结果，化合物对Caspase-1酶的抑制能力越强，酶活性就弱，在相同反应条件下，催化底物反应的速度就低，对应图3中荧光信号就越弱。因此，编号为28、30、和32化合物为筛选鉴定出的抑制剂。实施例2
图4是对图3所述的筛选实验得到的28号化合物进行Caspase-1酶半抑制浓度测定结果记录图。首先在样品/试剂储存管中分别装入浓度为O.1 nM、l nM、10 nMUOO ηΜ、1 μΜ、10 μΜ、以及100 μΜ的28号化合物溶液。根据图1和图2所述的液滴阵列筛选系统及使用方法，在微孔阵列芯片上生成含有不同浓度28号化合物溶液的液滴(180皮升)，再向每个液滴中注入180皮升的Caspase-1酶溶液(6 mU/μυ以及180皮升的底物(Z-YVAD-Rl 10)溶液(20 μΜ)来触发反应。按照实施例1的方法获得结果荧光图片，对荧光亮度值进行提取并进行归一化处理。对化合物28的浓度进行取对数处理，并将处理得到的结果与浓度对应的归一化荧光亮度值进行作图。利用数据处理软件对结果图进行Sigmoidal拟合，得到半抑制浓度为31. 6 ±3. 4 nM。
权利要求
1.一种具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，所述的系统包括毛细管(I)、液体驱动系统(2)、微孔阵列芯片(3)、样品/试剂储存管(7)和自动平移台，其特征在于，具体步骤为 1)将液体驱动系统(2)和毛细管(I)中充满低热膨胀系数的液体作为载流(4)，并完全排空毛细管(I)内的气泡； 2)将毛细管(I)取样端浸入与水相样品(5)不互溶的油相中(6)抽取一段油相(6)至毛细管(I)中，用于隔离水相样品(5)和载流(4)； 3)将毛细管取样端浸入样品/试剂储存管(7)中抽取一定体积的水相样品(5)溶液进入毛细管(I); 4)将毛细管(I)取样端移入微孔阵列芯片(3)的微孔(8)上方的油相(6)中，将毛细管Cl)中的样品(5)溶液推出至微孔(8)中形成样品(5)的液滴(9)。
2.根据权利要求1所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，所述的步骤4)后还包括如下具体步骤 a)在微孔阵列芯片(3)上形成化学组成或者浓度不同的多个待筛选样品的液滴(9)； b)在毛细管(I)中一次抽取大量的试剂(10)，并将毛细管(I)取样端分别插入至每个样品的液滴(9)中，注入一定体积的试剂(10)，形成液滴反应器(11)，完成样品(5)与试剂(10)的混合、反应、检测和筛选。
3.根据权利要求1所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，所述的步骤4)后还包括如下具体步骤 m)在微孔阵列芯片(3)上形成大量的试剂(10)的液滴； η )在每个试剂(10)的液滴中分别注入待筛选的样品(5)溶液，形成液滴反应器(11)，完成试剂(10)与样品(5)的混合、反应、检测和筛选。
4.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，所述的液体驱动系统(2)具有数纳升/分钟的液体驱动精度，其驱动液体的流速范围是I纳升/分钟至500纳升/分钟。
5.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，为了消除液体驱动系统(2)在转换液体驱动方向时，即从抽取转换至推出或者从推出转换至抽取这一期间所存在的机械回差，保证皮升级的液体量取精度，在抽取水相样品(5)或试剂(10)溶液之前先抽取一定额外体积的油相(6)进入毛细管(I);在将样品(5)或试剂(10)溶液推出毛细管(I)时，也将额外抽取的油相(6) —并推出毛细管(I)。
6.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，所述的液体驱动系统(2)和毛细管(I)中充满低热膨胀系数的液体作为载流(4)，来防止实验过程中温度波动对液体驱动精度的影响，所述的载流(4)的热膨胀系数范围为O. 00001/摄氏度至O. 0005/摄氏度。
7.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，所述的毛细管(I)采用管壁较薄，有利于实现皮升级的液体量取以及降低液体在毛细管(I)取样端的残留；所述的毛细管(I)的管壁厚度范围是I微米至100微米。
8.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，在使用之前，对液体载流(4)和油相(6)进行脱气处理，防止在液体驱动过程中产生气泡。
9.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，使用时，微孔阵列芯片(3)的微孔(8)的上方，与样品/试剂储存管(7)的上方均覆盖一层与水相不互溶的油相(6)，以防止微量液滴、样品和试剂暴露在空气中挥发或受到污染，所述的油相(6)的厚度范围为O.1毫米至10毫米。
10.根据权利要求1或2或3所述的具有皮升级精度的微液滴阵列筛选系统的使用方法，其特征在于，使用时，为了消除筛选反应过程中油相(6)对微量生化反应的干扰，在油相(6)中添加生物兼容性的表面活性剂，利用表面活性剂分子在油水界面的自组装效应，来降低生物分子在界面的吸附和失活，表面活性剂的浓度为O. 01%至10%。
全文摘要
本发明涉及的领域为高通量筛选领域，特别涉及一种具有皮升级精度的自动化微液滴阵列筛选系统的使用方法。本发明通过将液体驱动系统和毛细管中充满低热膨胀系数的液体作为载流，并完全排空毛细管内的气泡，然后将毛细管取样端浸入与水相样品不互溶的油相中抽取一段油相至毛细管中，用于隔离水相样品和载流，再将毛细管取样端浸入样品/试剂储存管中抽取一定体积的水相样品溶液进入毛细管，最后将毛细管取样端移入微孔阵列芯片的微孔上方的油相中，将毛细管中的样品溶液推出至微孔中形成样品的液滴。本发明液体的定量量取和液滴生成具有皮升级的体积精度，有效降低了高通量筛选中的样品/试剂消耗，节省了实验成本。
文档编号B01L3/00GK103008037SQ20121058905
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者方群, 祝莹, 张云霞 申请人:浙江大学