一种立体互联网络结构的浓度梯度微流控芯片的制作方法

本发明涉及微流控芯片，尤其是涉及一种立体互联网络结构的浓度梯度微流控芯片。

背景技术：

微流控芯片(LOC)可实现微尺度流体的操控与分析，具有微量、快速、阵列化、高通量等特征，在疾病诊断、细胞筛选、材料合成、食品安全等应用广泛。浓度梯度微流控芯片作为一个新兴的技术平台越来越受到关注，其基本原理是：通过改变微流控芯片样本溶液的浓度比例及流道构型设计，经过多次重复的分配、混合后，最终在圣诞树形网络结构底部形成浓度梯度。目前使用比较广泛的微流控浓度梯度生成器是“圣诞树”结构及其变形结构，例如中国专利CN 101382490 A、CN 101629143 A、CN 205042494 U、CN 105080627 A、CN 103257213 A和美国专利US 7314070 B2。另外，这种结构的浓度梯度微流控芯片也存在着其它一些问题，如微流体通道网络结构复杂多变，现有加工技术成本大，过程繁琐；微流道曲折结构较多，通道长度较大，若一个位置发生堵塞，则导致整个芯片产生的浓度梯度分布不准确；当需要较多的浓度梯度时，芯片体积将随着圣诞树层数的增加而增大；圣诞树结构只能进行分析物的两两混合，对于多种分析物的相互混合，目前的平面结构是做不到的；平面结构不能模拟生物体内真实环境，对生命活动的研究得不到精确的结果。这些问题制约着浓度梯度微流控技术的发展，是微流控芯片药物筛选及生物化学反应等领域的关键和难点。

采用传统的微加工技术制作复杂结构的微通道网络，过程繁琐，制作时间长，成本消耗大，限制了微流控芯片产业化的进程。随着3D打印技术兴起，越来越多的研究者采用3D打印技术直接制作微流控芯片，实现复杂结构简单快速、低成本、高精度等的一步式制造。目前采用3D打印技术制作浓度梯度微流控芯片也有一些报道，如Bhargava等(Bhargava,K.C.,B.Thompson,and N.Malmstadt."Discrete elements for 3D microfluidics."Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111.42(2014):15013-8.)采用3D打印技术开发了一个标准化组件和连接器的样本库，形成了可扩展和缩小的输出的可调浓度生成装置；Shallan等(Shallan,Aliaa I.,et al."Cost-Effective Three-Dimensional Printing of Visibly Transparent Microchips within Minutes."Analytical Chemistry86.6(2014):3124-30.)使用3D打印技术制作的浓度梯度生产器，两个样本溶液进口，经过4次的重复分配、混合后生成5种浓度梯度。3D打印制作的浓度梯度微流控芯片还是基于传统圣诞树网络结构，例如只能制作2D结构的浓度生成环境，对于多个分析物同时混合比较困难，浓度生成在时间和空间上不能保持良好的稳定性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供具有通量高、易扩展、浓度准确稳定、灵活可控等特点的一种立体互联网络结构的浓度梯度微流控芯片。

本发明从上至下设有进样区、溶液浓度梯度形成区和浓度梯度出口区；

所述进样区设有4个进样口，每个进样口用于注入不同浓度比例、不同种类的分析物；

所述溶液浓度梯度形成区由若干个树状分支单元组成，从上至下叠加构成立体互联网络结构的微流控芯片，所述树状分支单元由1个垂直通道和4个分支通道组成；所述垂直通道主要作为溶液的混合流道；所述分支通道主要作为溶液的汇合通道和分配通道；

所述浓度梯度出口区由M个输出端组成，出口处为显微镜观察，拍照等区域；

所述进样区的进样口进样距离可为10mm以下。

所述树状分支单元的垂直部分和分支部分的截面形状可为但不局限于正方形或者圆形，截面尺寸为5mm以下。

所述垂直通道长度为5mm以下。

所述分支通道长度为5mm以下。

所述分支通道中4个独立分支的角度为50～100°。

所述进样区的入口和浓度梯度出口区的出口的截面形状可为但不局限于圆形或正方形，尺寸相等，截面尺寸5mm以下。

所述浓度梯度分布是由进样区的溶液种类、浓度比例和网络微通道构型设计决定。溶液经分支点分配后，在垂直通道中发生扩散混合，形成新的溶液浓度。上一层溶液在分支点分配后，可形成单分支溶液(原溶液)，两个分支溶液(两种溶液混合)和四个分支溶液(四种溶液混合)，下一层芯片继续上一层芯片的分配方法，达到浓度梯度出口区形成M种不同的浓度梯度分布。

本发明利用3D打印技术制作一种立体互联网络结构的微流控芯片，为浓度梯度微流控技术发展提供了良好的选择，显示出了微流控芯片用于高通量的药物筛选和化学合成的巨大优势。

本发明的结构可由3D打印机制作，通过计算机对芯片进行逐层分切，对材料层层黏结堆叠成型。所述浓度梯度微流控芯片由若干个相同结构的树状分支单元构成，这些树状分支单元组合成一个整体的浓度梯度微流控芯片，所述芯片从上到下分为进样区、溶液浓度梯度形成区和浓度梯度出口区。

溶液浓度梯度形成过程为：

通过注射泵将样本溶液通入到芯片的进样口中，每个进样口的速度和样本溶液的浓度比例可以设置。溶液在注射泵的压力和溶液本身的重力驱动下流入浓度梯度形成区，溶液会在浓度梯度形成区先进行分配到各个分支通道，然后流入垂直通道。基于层流扩散的原理，两个分支通道或者四个分支通道互联部分的溶液将会在垂直通道发生混合效应。连续经过四次的分配、混合之后，溶液达到浓度梯度出口区。经过一段时间，使用显微镜、拍照等设备进行分析处理后，可以获得不同曲线的浓度梯度分布。

本发明具有以下优点：

1)本发明可以一次性并行分析四种分析物，对于需要用到多种分析的情况非常有益。如果需要更多的药物分析，不需要另外增加进样口，只需要改进进样区的结构设计。与传统的圣诞树结构相比，减少了芯片结构，增加了分析物数量。

2)本发明的创造性是使用3D打印技术制作了立体互联网络结构的微流体通道，芯片上所有的流道都相互连通，有益于各种不同的药物分析物的混合，而且混合更加的均匀。在浓度梯度出口处即可以形成两种药物混合，也可以形成三种或者四种药物的混合，有利于药物分析物的实验对比。与传统的圣诞树结构相比，增加了混合效果。

3)本发明的创造性是设计了立体网络结构的浓度梯度微流控芯片适合高通量分析，每增加一层芯片，芯片出口数量即呈指数增长。如设计5层芯片，则芯片出口数量为36个，如此类推，可以产生更多的浓度梯度类型。

附图说明

图1为微流控芯片通道侧视图。在图1中，各标记为：1、进样区；2、浓度梯度生成区；3、浓度梯度出口区；4、第一层芯片；5、第二层芯片；6、第三层芯片；7、第四层芯片；8、分支通道；9、垂直通道；10、出口通道；11、a进样口；12、b进样口；13、c进样口；14、d进样口；15、单分支通道；16、两分支混合通道；17、四分支混合通道；18、分支点(汇合点)。

图2为微流控芯片通道三维结构图。在图2中，各标记为：10、出口通道；11、a进样口；12、b进样口；13、c进样口；14、d进样口；15、单分支通道；16、两分支混合通道；17、四分支混合通道；18、分支点(汇合点)。

图3为9个出口的树状分支单元及浓度梯度形成过程示意图，在图3中，各标记为：中心点圆圈处为进样口1；周围四个圆圈代表2、3、4、5为分支通道。

图4为9个出口的浓度梯度定量分析实验图。图中为仿真和实验结果，微通道出口阵列的虚线框为分析对象通道，即通道4、5、6。

图5为25个出口的浓度梯度定量分析实验图。图中为仿真和实验结果，微通道出口阵列的虚线框为分析对象通道，即通道11、12、13、14、15。

图6为36个出口的浓度梯度定量分析实验图。图中为仿真和实验结果，微通道出口阵列的虚线框为分析对象通道，即通道13、14、15、16、17、18。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

一种3D打印立体网络结构的微流控芯片用于浓度梯度形成应用方法，该芯片的浓度梯度分布主要受进样口溶液种类、浓度比例和网络微通道构型设计的影响。芯片自上而下分为进样区1、浓度梯度形成区2和浓度梯度出口区3(如图1所示)。如图2所示，在进样区1通入单一的分析物，如a进样口11、b进样口12、c进样口13、d进样口14其中的一个进样口通入分析物；两种类型的分析物，如a进样口11、b进样口12、c进样口13、d进样口14其中两个进样口通入分析物；三种类型的分析物，如a进样口11、b进样口12、c进样口13、d进样口14其中三个进样口通入分析物；或者a进样口11、b进样口12、c进样口13、d进样口14同时通入四种类型的分析物，剩余其他进样口通入去离子水溶液混合稀释。溶液流入第一层芯片4的进样距离直接分支点18，然后溶液经分支通道8分配溶液进入垂直通道9中充汇集扩散、混合之后流到第二层芯片5中，后续第三层芯片6和第四层芯片7重复前面的操作方式，溶液反复的经过分配、混合、扩散之后最终达到浓度梯度出口通道10中形成浓度梯度分布。

溶液经分支点18分配后，在垂直通道9中发生扩散混合，形成新的溶液浓度。第一层芯片4溶液经分支点18分配后，可形成单分支溶液15(原溶液)，两个分支溶液16(两种溶液混合)和四个分支溶液17(四种溶液混合)，下一层芯片继续上一层芯片的分配方法，达到浓度梯度出口10形成36种不同的浓度梯度分布。最后，进行拍照和计算机图像处理软件分析得出一些列浓度梯度曲线图。

经过一系列反复的分配和混合，4min后在浓度梯度出口10形成的浓度梯度分布图，如图4～6所示。进样溶液浓度为50mol/m³，溶液流速为3μL/min。图4为9个出口的溶液浓度梯度定量实验分析图，实验结果与仿真分析结果非常吻合，表明此结构产生的浓度梯度具有准确性。图5和图6可以发现实验结果和仿真结果的浓度梯度分布也非常一致，出现误差越来越大，但是总体控制在5％以内，显示了该芯片能够形成稳定的、精确可控的浓度梯度分布。

本发明构建的3D立体网络互联微通道浓度梯度微流控芯片，实现了多分析物并行分析处理，高通量，易扩展的能力。在浓度梯度形成方面，显示了能够形成稳定的、精确可控的浓度梯度分布，通过改变进样口溶液种类、浓度比例和网络微通道构型设计可以得到一系列的浓度梯度分布，如线性梯度、抛物线、周期性等。立体结构的微流控芯片提供了动态的溶液浓度，能够模拟生物体内真实环境，对生命活动的研究得到更加精确的结果。本发明所述微流控浓度梯度芯片及其应用方法，可用于细胞药物筛选、化学物合成、药物刺激、趋向性研究，同时也可用于一些细胞相关的研究。