本发明涉及化学提取
技术领域：
，特别涉及一种甘草提取物的脱色方法。
背景技术：
：甘草(学名：GlycyrrhizauralensisFisch)，别名：国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子。多年生草本，根与根状茎粗状，直径1-3厘米，外皮褐色，里面淡黄色，具甜味。功能主治清热解毒、祛痰止咳、脘腹等。甘草提取物一般包含：甘草素、甘草酸、甘草甙、甘草类黄酮、后莫紫檀素、刺芒柄花素、槲皮素等，为黄色至棕黄色粉末。有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。甘草的类黄酮成分，是甘草提取物显黄色的主要原因，而且它还有其他作用。甘草根中的类黄酮成分具有止痉作用。甘草黄酮是主要的类黄酮成分，具有抗炎活性。这些黄酮具有抗氧化护肝作用。预临床试验结果显示，黄酮能杀死大部分引起胃溃疡和肠炎的幽门螺旋菌。其中光甘草定(美白黄金)属于类黄酮成分，其能深入皮肤内部并保持高活性，美白并高效抗氧化，有效抑制黑色素生成过程中多种酶的活性，特别是抑制酪胺酸酵素活性。同时还具有防止皮肤粗糙和抗炎、抗菌的功效，是目前疗效好、功能全面的美白成分。但部分类黄酮成分的颜色会在一定程度上影响化妆品成品的视觉感受，因此，将甘草提取物中的颜色较深的类黄酮成分去除，保留光甘草定及其它活性成分，既可以保留美白的功效成分，也可有效改善化妆品的视觉感受。但如何去除甘草提取物中黄色成分的问题至今未能得到解决。目前已经有许多发明对甘草进行提取，然而单次提取产物过于单一，甘草资源未被利用尽，浪费资源，例如专利号201610296645.3、201510102210.6、两个发明中，均为提取纯化光甘草定，这些发明中所提及的提取方法步骤较多，操作反复并且时间长，并且采用的有机溶剂种类太多，最终的回收率很低，而且这些方法只可以提取单一的光甘草定，无法实现多提取物的提取和甘草提取物脱色，造成甘草中的其他资源的浪费，无法充分发挥甘草的整体功效。专利号201410289036.6采用反相C18色谱进行甘草中的光甘草定的分离，最终的分离物中的光甘草定含量＞99％，但该方法成本较高，而且分离的产物单一，同样无法充分利用甘草中的其他有效成分。专利号201310178727.4采用了分子印迹技术分离甘草中的光甘草定，但缺点是，分离物质过于单一，除了光甘草定外，甘草中的其他组分并未得到充分回收，资源上会有点浪费。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种甘草提取物的脱色方法。该发明能实现多组分的提取和脱色，节约资源，并且同时保持了简便的方法。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种甘草提取物的脱色方法，包括如下步骤：制备分子印迹聚合物层析柱：以甘草中有颜色的甘草类黄酮成分作为模板，在引发剂存在的条件下，模板、功能单体和交联剂经聚合反应得到含有甘草类黄酮的分子印迹聚合物；将所得分子印迹聚合物粉碎，用洗脱剂将分子印迹聚合物中的甘草类黄酮模板洗脱，得到不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物；将不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物装柱，得到装有不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物的层析柱；提取、初步脱色：将甘草粉碎、烘干、醇提，得到甘草初提物；将甘草初提物通过脱色大孔树脂，收集滤过液，浓缩制成浸膏，浸膏用乙醇水溶液溶解，得到初步脱色后的甘草提取物；过柱：将初步脱色后的甘草提取物通过装有不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物的层析柱，收集滤过液；将滤过液浓缩、离心，收集滤过物，真空干燥后得到甘草提取物。在本发明中，甘草中颜色较深、含量较高的类黄酮成分主要包括甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷等。作为优选，甘草类黄酮为甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷中的一种或几种。在本发明提供的具体实施例中，甘草类黄酮为甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷的混合物。作为优选，甘草素、甘草苷、异甘草素与异甘草苷的质量比为(1～2)：(1～2)：(1～2)：(1～2)。在本发明提供的具体实施例中，甘草素、甘草苷、异甘草素与异甘草苷的质量比为1:1:1:1。本发明能实现多组分的提取和脱色，节约资源，并且同时保持了简便的方法。本发明也没有使用危险化学品，安全可靠，同时无需使用小件玻璃器皿，适用于大规模商业生产。作为优选，聚合反应的条件为：氮气保护，75℃～85℃反应11～13小时。在本发明提供的一具体实施例中，聚合反应的条件为：75℃反应13小时。作为优选，功能单体为苯乙烯。作为优选，引发剂为过硫酸钾。作为优选，交联剂为二乙烯基苯、聚乙二醇、N,N－亚甲基双丙烯酰胺、氧化锌、正硅酸乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙基三甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸羟丙酯中的一种或几种。作为优选，在制备分子印迹聚合物层析柱步骤中，粉碎为粉碎至40～100目；在提取、初步脱色步骤中，粉碎为粉碎至10～30目。在本发明提供的一具体实施例中，在提取、初步脱色步骤中，粉碎为粉碎至20目。作为优选，在制备分子印迹聚合物层析柱步骤中，洗脱剂为含有40vt％～60vt％乙酸的甲醇溶剂。在本发明提供的一具体实施例中，在制备分子印迹聚合物层析柱步骤中，洗脱剂为含有50vt％乙酸的甲醇溶剂。作为优选，醇提为：使用90vt％～99.5vt％的乙醇水溶液提取2～3次，合并提取物，提取的温度为40～60℃，提取时间为2～4小时；浓缩为在40～60℃条件下减压蒸馏。在本发明提供的一具体实施例中，醇提为：使用95vt％的乙醇水溶液提取3次，合并提取物。在本发明提供的一具体实施例中，醇提的提取温度为40℃，提取时间为2小时。在本发明提供的一具体实施例中，浓缩为在50℃条件下减压蒸馏。作为优选，过柱的样品流速为1～3BV/h。在本发明提供的一具体实施例中，过柱的样品流速为2BV/h。作为优选，收集滤过液之后还包括：上样结束后用洗脱剂洗脱柱子，收集洗脱液；将洗脱液浓缩、离心，收集滤过物，真空干燥后得到甘草类黄酮产物。作为优选，洗脱剂为60vt％～80vt％的乙醇水溶液，洗脱的流速为1～3BV/h。在本发明提供的一具体实施例中，洗脱剂为70vt％的乙醇水溶液，洗脱的流速为2BV/h。作为优选，在提取、初步脱色步骤中，烘干为烘干至含水量少于4％。作为优选，在提取、初步脱色步骤中，浸膏用乙醇水溶液溶解，该乙醇水溶液为50vt％～70vt％的乙醇水溶液。优选地，在提取、初步脱色步骤中，浸膏用乙醇水溶液溶解，该乙醇水溶液为60vt％的乙醇水溶液。作为优选，过柱步骤中的离心的转速为3500～4500rpm，真空干燥的真空度为0.09～0.10MPa。优选地，过柱步骤中的离心的转速为4000rpm，真空干燥的真空度为0.093MPa。本发明提供了一种甘草提取物的脱色方法。该脱色方法包括：制备装有不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物的层析柱；将甘草粉碎、烘干、醇提，得到甘草初提物；将甘草初提物通过脱色大孔树脂，收集滤过液，浓缩制成浸膏，浸膏用乙醇水溶液溶解，得到初步脱色后的甘草提取物；将初步脱色后的甘草提取物通过装有不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物的层析柱，收集滤过液；将滤过液浓缩、离心，收集滤过物，真空干燥后得到甘草提取物。本发明的技术效果为：1、本发明以甘草类黄酮组分为模板，可针对性的对甘草提取物中有颜色的甘草类黄酮物质进行脱除，保留其他无颜色或浅色功效成分，可应用于皮肤涂抹等日化产品的脱色处理，此法针对性较强，提取物的回收率较高，脱色效果明显。2、本方法工艺高效、环保，可重复性高，产品收集容易。3、本发明能同时实现多组分的提取和脱色，节约资源，降低成本，并且同时保持了简便的方法。4、本发明没有使用危险化学品，安全可靠，同时无需使用小件玻璃器皿，适用于大规模商业生产。附图说明图1为比色表。具体实施方式本发明公开了一种甘草提取物的脱色方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的甘草提取物的脱色方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1(1)制备分子印迹聚合物层析柱：将苯乙烯加入到2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌30min去除其中的杂质。取30mL上述苯乙烯和400mL水以及1g甘草类黄酮(包括0.25g甘草素、0.25g甘草苷、0.25g异甘草素、0.25g异甘草苷，下同)在75℃条件下加热搅拌，然后加入0.2g交联剂二乙烯基苯，最后将0.8g引发剂过硫酸钾加入其中，在高纯氮气保护下反应13h，得到含有光甘草定的分子印迹聚合物。然后将聚合物粉碎过筛，取40～100目的聚合物颗粒，以50％乙酸的甲醇溶剂洗脱分子聚合物中的甘草类黄酮模板，最终得到不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物。最后将不含甘草类黄酮的分子聚合物装柱备用。(2)提取有效部位：取400g甘草药材粉碎，干燥使其含水量少于4％，用5L的95％乙醇提取3次，提取温度为40℃，提取时间分别为2h，提取物通过脱色大孔树脂，收集脱色后的滤过液，然后旋干制成浸膏备用。(3)过柱：取步骤(2)中的提取物浸膏，用100mL60％乙醇溶液溶解，然后让其通过步骤(1)中装有不含甘草类黄酮分子印迹聚合物的层析柱，上样流速为2BV/h，收集滤过液；结束后使用流速为2BV/h的60％乙醇溶液洗脱柱子，依次收集含甘草类黄酮的洗脱液。(4)收集产物：将滤过液和洗脱液旋干，析出各组分，高转速离心，收集各组分，在0.093MPa的真空度下干燥，分别得脱色后的甘草提取物和甘草类黄酮(甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷)。实施例2(1)制备脱色分子印迹聚合物层析柱：将苯乙烯加入到2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌30min去除其中的杂质。取30mL上述苯乙烯和400mL水以及1g甘草类黄酮(包括0.25g甘草素、0.25g甘草苷、0.25g异甘草素、0.25g异甘草苷，下同)在75℃条件下加热搅拌，然后加入0.3g交联剂(0.1g聚乙二醇400、0.2g正硅酸乙酯)，最后将0.8g引发剂过硫酸钾加入其中，在高纯氮气保护下反应13h，得到含有光甘草定的分子印迹聚合物。然后将聚合物粉碎过筛，取40～100目的聚合物颗粒，以50％乙酸的甲醇溶剂洗脱分子聚合物中的甘草类黄酮模板，最终得到不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物。最后将不含甘草类黄酮的分子聚合物装柱备用。(2)提取有效部位：取400g甘草药材粉碎，干燥使其含水量少于4％，用5L的95％乙醇提取3次，提取温度为40℃，提取时间分别为2h，提取物通过脱色大孔树脂，收集脱色后的滤过液，然后旋干制成浸膏备用。(3)过柱：取步骤(2)中的提取物浸膏，用100mL60％乙醇溶液溶解，然后让其通过步骤(1)中装有不含甘草类黄酮分子印迹聚合物的层析柱，上样流速为2BV/h，收集滤过液；结束后使用流速为2BV/h的60％乙醇溶液洗脱柱子，依次收集含甘草类黄酮的洗脱液。(4)收集产物：将滤过液和洗脱液旋干，析出各组分，高转速离心，收集各组分，在0.093MPa的真空度下干燥，分别得脱色后的甘草提取物和甘草类黄酮(甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷)。对比例1(1)制备脱色分子印迹聚合物层析柱：将苯乙烯加入到2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌30min去除其中的杂质。取30mL上述苯乙烯和400mL水以及1g甘草类黄酮(包括0.25g甘草素、0.25g甘草苷、0.25g异甘草素、0.25g异甘草苷，下同)在75℃条件下加热搅拌，然后加入0.3g交联剂(0.15g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.15gN,N－亚甲基双丙烯酰胺)，最后将0.8g引发剂过硫酸钾加入其中，在高纯氮气保护下反应13h，得到含有光甘草定的分子印迹聚合物。然后将聚合物粉碎过筛，取40～100目的聚合物颗粒，以乙醚溶剂洗脱分子聚合物中的甘草类黄酮模板，最终得到不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物。最后将不含甘草类黄酮的分子聚合物装柱备用。(2)提取有效部位：取400g甘草药材粉碎，干燥使其含水量少于4％，用5L的95％乙醇提取3次，提取温度为40℃，提取时间分别为2h，提取物通过脱色大孔树脂，收集脱色后的滤过液，然后旋干制成浸膏备用。(3)过柱：取步骤(2)中的提取物浸膏，用100mL60％乙醇溶液溶解，然后让其通过步骤(1)中装有不含甘草类黄酮分子印迹聚合物的层析柱，上样流速为2BV/h，收集滤过液；结束后使用流速为2BV/h的60％乙醇溶液洗脱柱子，依次收集含甘草类黄酮的洗脱液。(4)收集产物：将滤过液和洗脱液旋干，析出各组分，高转速离心，收集各组分，在0.093MPa的真空度下干燥，分别得脱色后的甘草提取物和甘草类黄酮。对比例2(1)制备脱色分子印迹聚合物层析柱：将苯乙烯加入到2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌30min去除其中的杂质。取30mL上述苯乙烯和400mL水以及1g甘草类黄酮(包括0.25g甘草素、0.25g甘草苷、0.25g异甘草素、0.25g异甘草苷，下同)在75℃条件下加热搅拌，然后加入0.3g交联剂(0.1g聚乙二醇400、0.2g三甲氧基丙基三甲基丙烯酸酯)，最后将0.8g引发剂过硫酸钾加入其中，在高纯氮气保护下反应13h，得到含有光甘草定的分子印迹聚合物。然后将聚合物粉碎过筛，取40～100目的聚合物颗粒，以石油醚-氯仿(50:50，V:V)溶剂洗脱分子聚合物中的甘草类黄酮模板，最终得到不含甘草类黄酮的分子印迹聚合物。最后将不含甘草类黄酮的分子聚合物装柱备用。(2)提取有效部位：取400g甘草药材粉碎，干燥使其含水量少于4％，用5L的95％乙醇提取3次，提取温度为40℃，提取时间分别为2h，提取物通过脱色大孔树脂，收集脱色后的滤过液，然后旋干制成浸膏备用。(3)过柱：取步骤(2)中的提取物浸膏，用100mL60％乙醇溶液溶解，然后让其通过步骤(1)中装有不含甘草类黄酮分子印迹聚合物的层析柱，上样流速为2BV/h，收集滤过液；结束后使用流速为2BV/h的60％乙醇溶液洗脱柱子，依次收集含甘草类黄酮的洗脱液。(4)收集产物：将滤过液和洗脱液旋干，析出各组分，高转速离心，收集各组分，在0.093MPa的真空度下干燥，分别得脱色后的甘草提取物和甘草类黄酮。对比例3(1)取光果甘草400g，分别用95％乙醇40、35、30kg回流提取2.0、1.5、1.0h，第三次提取液套用，将前两次提取液并浓缩，浓缩至比重1.05～1.10。(2)依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯分别萃取3～5次，氯仿萃取液浓缩后硅藻土100g拌样，干燥后用索氏提取器提取，依次用石油醚→乙酸乙酯→丙酮→乙醇提取，回收溶剂后取乙酸乙酯部分200g用硅胶柱色谱，先用石油醚洗脱，在用石油醚-甲醇梯度洗脱(6个梯度，100:5、100:10，100:15，100:20，100:25，100:30，V:V)，取100:15洗脱液采用硅胶柱色谱进行分离，以氯仿-甲醇(100:3～100:10，V:V)梯度洗脱，氯仿-甲醇(100:3～100:6，V:V)洗脱部分用制备硅胶薄层分离，以石油醚-乙酸乙酯(100:15，V:V)进行分离，制得化合物约10mg。(3)化合物采用氯仿-甲醇(100:7～100:10，V:V)溶解并经硅胶减压柱分离，以石油醚-丙酮(100:8，V:V)洗脱，在洗脱液中加入3～5％活性炭回流脱色30min，浓缩结晶。(4)结晶物中加入石油醚、正己烷或乙醚中之一，充分搅匀滴入少量甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷或正丁醇中之一或混合溶剂，直至结晶物上少量色素漂洗干净，得到白色有光泽的光甘草定，含量98.8％。对比例4本对比例具体方法如下：(1)备料各组分按如下用量配比配料：模板分子(甘草类黄酮，包括0.25g甘草素、0.25g甘草苷、0.25g异甘草素、0.25g异甘草苷，下同)0.97g，功能单体(甲基丙烯酸)1.63g，交联剂(二甲基丙烯酸乙二醇酯)19.00g，引发剂(偶氮二异丁腈)0.10g，溶剂(乙腈和氯仿的重量比为1:1的混合溶剂)42.00g。(2)制备带有模板分子的分子印迹聚合物将(1)中备好的模板分子甘草类黄酮、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈、乙腈与氯仿的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的分子印迹聚合物，然后将其碾磨过60目和100目筛，即得到60～100目带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒。(3)提纯带有模板分子的分子印迹聚合物用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱由(2)所制得的带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于提纯甘草类黄酮的分子印迹聚合物18.4g。(4)取15克步骤(2)所制得的用于提纯甘草类黄酮的分子印迹聚合物装柱。提取有效部位：取400g甘草药材粉碎，干燥使其含水量少于4％，用5L的95％乙醇提取3次，提取温度为40℃，提取时间分别为2h，提取物通过脱色大孔树脂，收集脱色后的滤过液，然后旋干制成浸膏备用。1L氯仿复溶后上柱。待上柱溶液流尽后，用甲醇体积分数为5％的乙腈溶液300毫升进行淋洗，层析柱用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，收集滤过液和洗脱液。将滤过液和洗脱液旋干，析出各组分，高转速离心，收集各组分，在0.093MPa的真空度下干燥，分别得脱色后的甘草提取物和甘草类黄酮(甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷)。对比例5本实施例以金属离子作为桥接剂和不含金属离子的甘草类黄酮为模板的分子印迹整体柱的制备。具体步骤如下：原位聚合法制备甘草类黄酮印迹整体柱：a.将质量百分数模板甘草类黄酮3.09％，桥接剂乙酸钴1.64％，功能单体4-乙烯基吡啶2.76％，引发剂偶氮二异丁腈0.29％，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯26.04％，溶于致孔剂为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐43.59％、N,N-二甲基甲酰胺3.32％，二甲基亚砜19.27％的混合致孔剂溶液中；超声溶解30min，使之溶解、澄清，之后通入氮气，除去预聚合混合液中的氧气，再将预聚合混合液注入不锈钢柱(100×4.6mmI.D.)中，将两端封住，于50-60℃水浴中反应16-18h。(将上述预聚合混合液注入密封容器中，于50-60℃水浴中反应16-18h，得到金属离子为桥接剂的甘草类黄酮分子印迹聚合物)。b.将反应好的柱子连于HPLC的高压泵上，先用乙腈冲洗，除去整体柱中残留的致孔剂及可溶性物质，流速由0.1mL/min逐渐升至0.5mL/min，冲够100mL后换成甲醇/乙酸(v/v,7/3)混合溶液150mL冲洗除去模板分子。最后使用流动相将系统平衡至基线水平。不含有金属离子的甘草类黄酮分子印迹整体柱制备，除了不加乙酸钴外，其余步骤同上。c.取15克所制得的用于提纯甘草类黄酮的分子印迹聚合物装柱。提取有效部位：取400g甘草药材粉碎，干燥使其含水量少于4％，用5L的95％乙醇提取3次，提取温度为40℃，提取时间分别为2h，提取物通过脱色大孔树脂，收集脱色后的滤过液，然后旋干制成浸膏备用。d.以1L氯仿将甘草浸膏复溶后上柱。待上柱溶液流尽后，用甲醇体积分数为5％的乙腈溶液300毫升进行淋洗，层析柱用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，收集滤过液和洗脱液。将滤过液和洗脱液旋干，析出各组分，高转速离心，收集各组分，在0.093MPa的真空度下干燥，分别得脱色后的甘草提取物和甘草类黄酮(甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷)。试验例1脱色效果试验针对上述实施例和对比例的脱色效果对比。本专利采用了的标准比色法，建立了如图1所示色度在5～450的比色表。上述实施例和对比例的色度数据及回收率见下表所示。表1色度数据及回收率结果项目实施例1实施例2对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5色度值8012535030050175250回收率/％92.491.691.290.4＜181.474.1注：回收率指甘草提取物的整体回收率。根据表中数据显示，与实施例相比，对比例1和2的色度值要更高，说明其中颜色较深的组分并未分离完全，从整个流程来看，区别在于制备分子印迹聚合物时所采用的洗脱剂与实施例不同，说明乙醚、石油醚和氯仿三种溶剂无法有效洗脱甘草提取物中的深色组分；对比例3采用传统的有机溶剂溶解洗脱、结晶和活性炭吸附脱色的组合方法，虽然最终成分光甘草定含量很高，且脱色效果最好，但整个操作步骤复杂、溶剂种类繁多，回收率太低(最终基本只有光甘草定，其他组分基本去除)；对比例4采用不同于实施例的功能单体，总体分离效果与实施例更为接近，但效果会差一些；对比例5相比于实施例，脱色效果较差，回收率也比较低，说明以金属离子作为桥连剂的效果一般。试验例2活性成分检测根据对实施例和对比例的成分分析，7个甘草提取物的成分如下表所示：表2甘草提取物的成分分析结果由于主要的显色成分为甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷，对比例1和2所采用的溶剂对甘草素和异甘草素的洗脱效果较佳，但对甘草苷和异甘草苷的洗脱能力较差，因此最终只有甘草素和异甘草素得到分离；对比例3则对除了光甘草定以外的其他类黄酮成分都进行了分离，因此最终的光甘草定含量很高；对比例4和5情况类似，无法将颜色较深的组分甘草苷和异甘草苷完全分离，使得分离后的提取物中依然有残留。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3