微流控芯片的制作方法

本发明涉及用于微生物学测试，特别是微生物鉴定和抗微生物敏感感性测试(ast)的测试卡。抗生素耐药性的表型测定需要在抗生素存在下培养分离的微生物(如从患者收集的样品)(在本说明书中，如果测定涉及这种组合的敏感性，则“抗生素”也可以是指两种或更多种不同抗生素的组合)，并检查培养期间是否发生了微生物生长。最小抑制浓度(mic)的确定需要针对不同的抗生素浓度进行这种培养。添加特定的辅助试剂可以允许测定耐药机制。为了进行药物敏感性和mic确定的自动测试(通常与样品中存在的微生物的鉴定组合)，使用一次性测试卡，其中在多个温育区段中同时培养从样品中分离出的细菌。在本申请的上下文中，每当提及“细菌”时，其同样适用于其他微生物，例如单细胞真菌。在准备待分析的分离株并将其放置于卡上之后，在专用设备(所谓的“分析仪”)中自动执行进一步的步骤。这些步骤通常包括微生物的培养和循环光学测量以检测其生长。测试卡通常是由聚合物材料制成的微流控芯片。样品放入芯片上的样品室中，在其中流动通过微流体通道的网络至多个其中进行温育的独立的温育区段。样品流动和温育区段的填充可以通过压差、重力或毛细管力驱动。一个重要的问题是如何可以确定多种抗生素及其组合的敏感性和mic。在现有技术中已知的用于这些类型测试的卡仅具有64至136个温育区段，其限制了单次测试中获得的信息。从用户的角度来看，这是根本性的问题，因为即使进行针对给定微生物菌株的测试也无法保证结果与给定国家/地区以及eucast(europeancommitteeonantimicrobialsusceptibilitytesting)或clsi(clinical&laboratorystandardsinstitute)制定的准则相一致。通常，有关耐药性的信息是作为所谓的抗生素浓度断点而获得的，而不是需要进行大量培养的实际mic水平。本发明旨在解决这个和其它与用于微生物鉴定和药物敏感性测试的测试卡的功能和正确操作有关的技术问题。
背景技术：
：ep0785433a2描述了一种用于微生物学测试的卡，其中样品在压力差下填充温育区段。在填充芯片之前，将样品放在使用软管与芯片连接的单独容器中。尽管已确定需要“在固定尺寸的卡片上放置更多孔”，但该芯片只有45个温育区段，这大大限制了可以在单次测试中进行的可能测试的数量。部分原因是“向卡中添加更多孔可能会增加孔间交叉污染的可能性”，其“可能是由样品、生长介质或试剂沿流体通道网络从一个孔扩散到相邻的孔而造成的”。为了避免这种情况，在优选的实施方式中，沿流体通道测量的相邻孔之间的分隔距离“在粗略测量为8.9cm×5.7cm的卡片中大于或等于2.5cm(...)”。填充程序需要额外的系统元件(样品容器和软管)，这会增加操作复杂性和污染风险。专利申请ep1696238a2中公开了一种类似的芯片。其通过补偿芯片周围的压力填充，该压力预先降低到48-62mbar。填充过程持续3-60s，并且9095％的样品流向温育区段。另外，通向温育区段的通道是倾斜的，因此重力可以帮助对其填充。根据说明书，使用具有圆形截面的通道，与矩形通道相比，确保流动阻力较低和扰动较小。为了允许适当的样品体积流动，通向不同数量分支(温育区段)的通道具有不同的横截面。wo2012/048096a2显示了用于ast的微流控芯片，其具有用于样品过量的腔室，使得其吸入芯片的容积可以大于温育片段和微流控通道网络的容积之和。在一些现有技术的微流控芯片中，也包括于us2003/0152994a1的微流控芯片(图9)中，通过温育区段的布置，需要这样的腔室，称为样品过量室，溢流池或真空腔室，位于不通气的盲流体分布通道的末端，其中从样品源通向各自温育区段的微流控通道之间的长度和/或流动阻力不均性会导致温育室的填充不均。wo2012/048096a2的样品过量通道比引导样品进入温育区段的通道小(即，截面积较小)，使得填充过程足够缓慢以确保温育区段的填充适当。此外，描述非水性液体(疏水性液体)的可能使用是为了在将样品充满后分隔温育区段。为此，可以使用各种各样的液体，包括矿物油、烯烃、酯、酰胺、胺、硅氧烷、有机硅氧烷、醚、乙缩醛、碳酸二烷基酯、烃。液体分隔的温育区段也可以放置于外部容器中，在填充过程期间，细菌悬浮液会存储于该外部容器中，因为非水性液体不会与这种悬浮液(通常是肉汤中的悬浮液)混合。上述微流控芯片具有比其先前版本的申请ep0785433a2中公开的测试卡更多的温育区段。然而，它们的数量(最多140个)受限于约14μl至约15μl的单个温育孔的大致容积，或约2μl至约4μl的单个除泡器(bubbletrap)的容积，以及“溢流池”的存在，仍然太小而无法进行广泛的鉴定和敏感分析试验。在上述关于测试卡的申请和其他出版物中讨论了使用非水性液体分隔微流控芯片中的腔室，例如，k.a.heyriesetal.megapixeldigitalpcr(naturemethodsvol8no8,august2011)的文章。在这些方案中，非水性液体从外部提供给系统。专利申请wo2014/052671a1指定了用于生物学分析(多重pcr)的装置(蜂窝管)，其中具有非水性液体的油室是系统的一部分，并且可以与反应室的区域流体连接。专利申请us2017/0029871中描述的用于样品制备以进行pcr反应的药筒中使用了类似方案，其中公共流体通道用于填充与其串联的多个孔。样品和密封剂储池没有布置于同一微流控装置中，但可以通过阀门与其连接。该方案的缺点包括孔填充不均匀和污染风险增加。在专利申请ep0903569a1和us2009/0155128a1中也存在用于在多个独立的温育区段中进行自动微生物学测试的卡。这些芯片分别由重力或毛细力填充。us2012/0082599a1公开了通过向样品施加比在这些封闭结构中产生的压力更高的压力而填充封闭的室(死端)。后者用作“在截面中完全填充通道支腿的液体输送方向上对前端面施压的压力源”，并由此“防止少量流体与末端表面意外分离，并由于润湿引导或拖动邻近通道壁附近的部分流体量，并且以这种方式确保其前侧对输送的流体的精确划分”。在该文件中讨论的实施方式中，封闭结构中的压力可以通过改变其容积(例如，通过使用柔性膜或可移动活塞)另外控制，但并未提及在开始填充程序之前降低压力和随后将其升高到大气压的填充程序。这可能是由于以下事实：本发明的明显优势之一是控制流动的能力，通过控制施加于样品上的压力，可以在两个方向上驱动其流动，或使其保持静止，使得反应、检测或混合发生的位置可以在芯片上被隔开。us2013/0065280a1描述了一种芯片，具有基板以及样品室，分配通道，反应室，包含防止交叉污染的防混合材料的防混合室，两个阀，一个用于关闭样品室而另一个用于关闭防混合室，和在由此排出空气的分配通道末端的开口通气孔。由于分配通道是通气的，因此没有背压防止样品过早地泄漏出样品室，这需要在样品室的出口处使用阀门。us2016/0354777a1公开了沿着主通道段以n个串联布置的流体港，主通道段通过分叉连接到单个入口(图10a和10b)并且，还通过分叉连接到单个出口(图10a)，或每个主通道各自通往大型出口储池(图10b)。可商购的用于自动微生物测试的系统，包括使用专用测试卡(如上述专利申请中公开的卡)确定抗生素抗性的系统。这些包括biomerieux和phoenix(bectondickinson)提供的vitek。microscan和sensititre使用了ast的96孔板。总而言之，在现有技术中已知用于自动ast测试的卡。这些卡允许在多个温育区段中进行培养。在将这些区段填充样品后，可以用非水性液体分隔各腔室，以防止交叉污染。它们的主要技术限制之一是可以在同一样品上同时进行的不同测试的数量，这不允许评价整个推荐抗生素范围中的实际mic值，因此在单次运行时间后无法提供及时而准确的治疗感染患者所需的全面信息。技术实现要素：现有技术卡都没有教导根据本发明的装置或方法，其允许进行广泛的微生物学测试，这需要在至多达数百个温育区段中培养微生物培养物，而同时通过物理隔离不同区段内的样品的子体积，确保它们之间不会受到污染，其中将用于防止交叉污染的非水性液体放置于芯片上的独立储池中。本发明的优点在于，为了执行填充和分隔温育区段的过程，仅需要将芯片放置于其中可以获得合适压力(和温度，如果使用蜡阀)的环境中。不需要外部非水性液体罐或任何用于传输非水性液体如矿物油等至芯片上的装置。本发明涉及一种微流控芯片，其包括多个其中温育和检测任何微生物生长的独立的温育区段。在实施方式的实施例中提出了至多达640个独立的温育区段，但该技术可以在单个芯片上提供更多，例如至多达2,000个独立的温育区段。该芯片还具有样品储池和可以用于将温育区段彼此分隔开而防止交叉污染的非水性液体储池(如矿物油或其他不与水混合的液体)。非水性液体还可以防止液体从温育区段中蒸发。为了开始分析，使已装载到样品储池中的样品从该储池流入微流控结构并填充各个温育孔。然后，非水性液体从储池中释放并流入微流控通道中，从而将温育区段彼此分隔开，防止区段之间的污染。非水性液体的流动可以通过，例如，热敏阀(例如，由蜡或另一种低熔点物质制成)或本领域技术人员已知的其他常规阀控制。优选该阀是可远程操作的。通过压力差实现样品从样品储池流到温育区段和随后由非水性液体对温育区段彼此的隔开。为了产生这种差异，首先将样品在其样品储池中的芯片放置于环境(腔室)中，其中压力随后降低至低于环境大气压(即，放置芯片的腔室外面的环境压力)的某个值p0。这导致空气从芯片内部(即，从温育区段和微流控通道)通过样品储池中的样品排出并排到芯片之外，这导致芯片内部的压力也下降到p0。腔室中的压力随后升高，这导致系统中的压力平衡。腔室中压力的升高压缩了微流控系统中的空气，并迫使样品从样品储池移动至温育区段。在随后的步骤中，压力的进一步增加可以用于驱动非水性液体的流动。填充过程可以在任何合适的填充室或容器中进行，其可以是干燥器，用于同时填充一个或多个芯片的专用仪器，或能够产生低于大气压的压力的任何其他仪器。本发明还涉及用预先放置于样品储池中的样品填充芯片的温育孔的方法。对填充温育孔和分隔温育区段的非水性液体流动的过程的热力学分析表明，对于各个区段的给定容积的部分，可以选择一组压力以确保这些过程的最佳过程。这些是芯片的微流控结构内的空气压力，因此，这些也是在填充期间应该在其中放置芯片的容器中产生的压力。需要以下压力：·p0，填充室内的压力要降低到压力；·p1>p0，样品流至温育区段的压力；·p>p1，非水液体流至微流控通道的压力。这些压力可以用于确保填充过程正确，在此之后温育区段的预定接收一部分样品的部分(称为“温育孔”)优选基本上不含非水性液体或空气，温育区段之间不存在污染，并且该芯片上离样品储池最远的温育区段中含有的样品子体积的体积偏差降低。本发明的优选方面如下：一种用于进行微生物学测试的微流控芯片，包括：基板，其中布置各自具有入口的温育区段，具有出口的样品储池，和将所述样品储池的出口与所述温育区段的每个入口连接的微流控通道，其中所述微流控芯片还包含用于包含非水性液体的非水性液体储池，其中所述储池是经由可释放的气密和液密阀与微流控通道可连接的。根据前述方面的芯片，其中温育区段的数量等于或大于100个温育区段，优选等于或大于128个温育区段，更优选等于或大于320个温育区段，更加优选等于或大于640个温育区段，而最优选等于或大于1280个温育区段。根据前述方面中任一方面的芯片，其中所述微生物学测试属于包括以下的组：微生物鉴定，确定对抗生素或抗生素组合的敏感性，确定最小抑制浓度(mic)或检测抗生素抗药性的机理。根据前述方面中任一项的芯片，其中所述芯片由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃聚合物或环烯烃共聚物制成。根据前述方面中任一项的芯片，其中所述阀是热敏阀。根据前述方面中任一项的芯片，其中所述阀是热敏蜡阀，其含有在大于或等于37℃的温度下熔化的蜡。根据前述方面中任一项的芯片，其中优选以分形的方式布置温育区段，其中将每个温育区段与样品储池连接的微通道基本上等长和/或具有相同的流动阻力。根据前述方面中任一项的芯片，其中沿着连接这些区段的微流控通道测量的两个相邻温育区段之间的最短距离小于或等于10mm，优选小于或等于8mm，更优选小于或等于7mm。根据前述方面中任一项的芯片，其中样品储池的容积比温育孔的总容积大至少三倍。根据前述方面中任一项的芯片，其中非水性液体储池的容积比从样品储池通向温育区段的微流控通道的总容积大至少两倍，优选大至少三倍。根据前述方面中任一项的芯片，其中样品储池为细长形状，并且其最大纵向尺寸大于或等于30mm，优选大于或等于40mm，更优选大于或等于50mm。根据前述方面中任一项的芯片，其中样品储池具有入口端和出口端，其中出口端比入口端更宽和/或出口端的垂直于样品储池的纵轴的样品储池的宽度大于或等于5mm，优选大于或等于7mm，更优选大于或等于10mm。根据前述方面任一方面的芯片，其中样品储池具有至少第一侧壁和相对的第二侧壁，其中至少一个突起从所述第一侧壁突出，其中突起在垂直于侧壁的方向上测量的宽度大于或等于1mm，优选大于或等于2mm，更优选大于或等于3mm，和/或其中突起的远端与相对的侧壁之间的最短距离优选大于或等于3mm，更优选大于或等于4mm。根据前述方面中任一项的芯片，其中非水液体储池具有入口端和出口端，并且出口端的宽度比入口端的宽度窄。根据前述方面中任一项的芯片，其中非水液体储池在其最宽处的宽度大于或等于4mm，优选大于或等于5mm，更优选大于或等于6mm。根据前述方面中任一项的芯片，其中样品储池出口开口与样品储池的最低点之间的距离(图12中的d1)，以及非水性液体通过其进入样品储池的开口和最近的样品储池的侧壁之间的距离(图12中的d2)等于或小于3mm，更优选等于或小于2mm。本发明进一步的方面涉及：一种填充根据前述方面中任一项的微流控芯片中的温育区段的方法，依次包括以下步骤：a.在所述非水性液体储池中提供非水性液体，b.将样品输入样品储池中，c.将芯片放入与其周围环境隔离的气密性密封容器中；d.将所述容器中的压力降低至值p0，e.将所述气密性密封的容器中的压力升高到值p1，在其下样品从样品储池流动至将所述样品储池与温育区段连接的微流控通道，并进一步进入所述温育区段，f.激活阀以打开所述从非水性液体容器至连接所述样品储池和所述温育区段的所述微流控通道的流动路径，和g.进一步将所述气密性密封的容器中的压力升高至值p2，以驱动所述非水性液体流入将样品储池和所述非水性液体容器与温育区段相连的微流控通道中；h.可选地随后进一步将所述气密性密封容器中的压力升高至环境大气压patm，其中p0范围为至p1范围为至且p2范围为和至patm，其中patm表示所述气密性密封的容器外部的环境大气压力，n—所述芯片中的温育区段的数量，va—温育区段的入口通道，即连接主微流体网络与温育孔的通道的容积，vb—温育孔的容积，vc—连接温育孔和气体腔的气体交换通道的容积，vd—气体腔的容积，vin—主微流体网络的进入通道，即从样品储池通向主微流体网络的第一分支的通道的容积，v总—从样品储池通向温育区段的微流控通道网络除所述进入通道的总容积。根据前述方法方面中任一项的方法，其中在步骤g或步骤h之后，微流控芯片永久密封并且将芯片的内部与其周围环境分隔开。根据前述方法方面中任一项的方法，其中根据astmd7279，所述非水性液体具有大于或等于20cp，优选大于或等于50cp的粘度。具体实施方式芯片的结构图1显示了根据本发明的芯片的第一主表面的示意性平面视图。图2显示了图1的芯片的第二主表面的示意性平面视图。图3显示了图1的芯片的第二主表面中的通道的详细结构的示意图。图4显示了包括8个温育区段的芯片的第一主表面的截面的放大示意图。图5显示了具有温育区段的串联连接的芯片的示意图。图6示意性地显示了具有包括16个温育区段的分形几何形状的芯片的一部分的平面视图，图7示意性地显示了具有包括32个温育区段的分形几何形状的芯片的一部分的平面视图，图8示意性地显示了具有包括128个温育区段的分形几何形状的芯片的一部分的平面视图，图9示意性地显示了具有包括640个温育区段的分形几何形状的芯片的一部分的平面视图，图10示意性地显示了图9的芯片的一部分的平面图，其中突出了通向具有不同的温育区段数目的两个区域的进料通道。图11示意性地显示了用于使用根据本发明的芯片的根据本发明法人方法中的阶段。图12显示了根据本发明的样品储池和非水性液体储池的一个实施方式的平面视图。图1和图2示意性地显示了根据本发明的微流控芯片1的第一实施方式。芯片由基板2形成。该基板优选是平面的，具有第一主面3和优选平行的第二主面5。基板可以由任何液体和蒸汽不可渗透的材料，例如，聚合物、金属或玻璃制成。基板的厚度优选等于或大于1.5mm且小于或等于3.00mm。基板可以制成一个部件(例如，通过注射模制或铣削聚合物)，或可以由两个部件构成，即基底板(带有温育区段和微流控通道)和通过现有技术中已知的粘结方法连接在一起的储池。该第一主面的表面由第一不可渗透的基本上透明的材料层7覆盖，且第二主面的表面由第二不可渗透的基本上透明的材料层9覆盖。优选每个这些层等于或大于0.05mm厚且小于或等于0.15mm厚。这些层防止不期望的气体和液体从基板中形成的结构(稍后描述)进入或释放，同时允许光通过温育孔，从而容许对温育孔中的样品的光学检查。微流控芯片1包括：样品储池11，用于接收和存储用于分析的样品(例如，细菌的接种物)；非水性液体容器13，用于接收和存储非水性液体；和温育区段区域15，其包括多个温育区段17，在每个温育区段中可以培养一部分样品。通过非水性液体入口通道19可以向非水性液体储池13供应非水性液体，该非水性液体入口通道19从第一主面上的非水性液体入口开口21穿过基板通向非水性液体储池。通过样品入口通道23可以向样品储池11供给样品，例如用于分析的细菌接种物，该样品入口通道23从第一主面上的样品入口开口25穿过基板通向样品储池。样品储池具有通向芯片的第二主面上的基板中形成的通道22的出口开口27。通道22通向在温育区段区域15中在基板中形成的通道31。该通道穿过基板并连接通道22和基板第一主面中形成的通道33。通道33经由另外的通道34连接至微流控通道35的网络，其通向形成于基板中的温育区段17。优选地，微流控通道具有方形截面。优选微流控通道具有等于或大于0.05平方毫米且小于或等于1平方毫米的截面积，更优选微流控通道具有等于或大于0.16平方毫米而小于或等于0.64平方毫米的截面积。非水性液体储池具有通向通道29并且进一步经由该通道到达出口开口39'的出口开口39，非水性液体通过该出口开口39'进入样品储池。通道29可以由位于通道29中的蜡阀24或其他优选远程激活的阀临时阻断，其在关闭时会防止非水性液体流过通道29。例如，当在蜡阀的情况下通过加热而打开阀24时，非水性液体可以流过通道29并进入样品储池。该芯片优选具有在两个或更多个边缘28、28'上形成的凹口26、26'，以允许将该芯片钩到用于携带分析仪装置(未显示)中的芯片和/或容器中的篮子(未显示)的边缘上，使得填充期间样品入口开口25处于样品储池出口开口27上方。温育区段包括多个温育区段17和微流控通道35，该微流控通道35可以将样品引导至这些温育区段。样品通过形成于芯片基板的两个主面上的通道(22、33、35)的互连网络(也称为“主微流控网络”)传输到各个温育区段，这提高了芯片上空间的有效使用，因此允许在单个芯片中容纳更多的区段。附图中显示的芯片具有640个独立的温育区段，其中可以进行细菌(或其他微生物)的培养。在填充过程期间，位于样品储池开始处的样品流向通道22。该通道以通道31结束，样品通过通道31进入芯片第一主面上的通道33中。该通道将样品引导至微流控通道35的网络。在本发明的该实施方式中，微流控通道的网络布置为通向温育区段的通道的分形结构，其中样品被进一步分成等分部分，其经由分支通道进入更小的微通道结构。更具体地，图1-2中的芯片由具有128和512个温育区段的两个不对称部分构成。优选地，从每个从样品储池通向各个温育区段的样品通道的流动阻力对于每个这种通路基本相同，使得到达每个温育区段的样品量基本相同。图3显示了通过这些相连的微通道的一个路径的实例，一部分样品沿通道36向下流动直到到达具有次级通道38的t型岔口37。在此处，基本上一半的样品在次级通道的第一分支38'中沿一个方向(例如，向左)流动，而另一半样品在第二分支38″中沿相反方向(例如，向右)流动。每个这些分支由此通向具有三级通道41的t型岔口40。在t型岔口40处，基本上一半样品在三级通道的第一分支41'中沿一个方向(例如，向左)流动，而另一半的样品在第二分支41″中沿相反方向(例如，向右)流动。每个这些分支由此通向具有四级通道43的t型岔口42。在t型岔口处，基本上一半的样品在四级通道的第一分支43'中沿一个方向(例如，向左)流动，而另一半样品在第二分支43″中沿相反的方向(例如，向右)流动。每个这些分支由此通向具有五级通道45的t型岔口44。在t型岔口处，基本上一半的样品在五级通道的第一分支45'中沿一个方向(例如，向左)流动，而另一半样品在第二分支45”中沿相反的方向(例如，向右)流动。每个这些分支由此通向具有六级通道47的t型岔口46。此处，基本上一半的样品在六级通道的第一分支47″中沿一个方向(例如，向左)流动，而另一半的样品在第二分支47'中沿相反的方向(例如，向右)流动。每个这些分支由此通向传输通道49，其穿过基板(但不穿过不可渗透材料层)，并将样品引导至具有两个分支51′，51″的七级通道51，每个分支，如图4所示，在基板的第一主面的表面中，沿两个相反的方向从传送通道延伸至具有传送通道53的t型岔口52。在t型岔口52处，基本上一半的样品在传送通道的第一分支53'中沿一个方向(例如，向左)流动，而另一半的样品在第二分支53″中沿相反的方向(例如，向右)流动。每个这些分支由此通向具有分流器通道57的t型岔口54。在t型岔口54处，基本上一半的样品沿一个方向(例如，向右)流入第一关联温育区段17'的入口通道57'，而另一半的样品沿相反的方向(例如，向左)进入第二关联温育区段17″的入口通道57″。每个温育区段17包括温育孔113，温育期间小体积的样品所处的腔室，通过气体交换通道115连接至其关联的未通气的气体腔111，包括充满空气或微生物生长所需的任何其他气体或气体混合物的腔室。不通气的气体腔防止样品的污染和样品或样品流体通过蒸发的损失，同时提供可以被温育室内的细胞使用的气体。一旦样品进入温育孔，操作阀以释放非水性液体，例如，加热蜡阀而使蜡熔化，从而从储池13中释放非水性液体。这种非水性液体经由与残留于微流控通道中的样品相同的路径流动，直到其到达至少部分填充的分流器通道57'，57″，从而提供防止气体或水性流体从一个温育区段迁移至另一个的障碍。根据astm方法astmd7279测定，非水性液体的粘度(在用于装载芯片的温度下)大于或等于20cp，更优选大于或等于50cp。图1-4中显示的芯片的实施方式具有128×85mm的整体尺寸，并且其基板的厚度等于2.2mm。但任何尺寸都是可能的，条件是它们可以容纳所需数量的温育区段并满足本说明书中的其他标准。例如，设计了具有128个温育区段的芯片，其总体尺寸为85.5×49.7mm。只要是诊断芯片的期望性能对于用户方便，也可以制造出更大尺寸的芯片。芯片操作说明在以下描述中，符号patm是指装置外部环境中的环境大气压，其中根据以下描述的方法填充温育区段。温育区段串联连接的芯片下面介绍在温育区段之间具有串联连接的芯片。在图5中示意性地显示了温育区段与样品储池串联连接的芯片109。为简单起见，图5仅显示了从主微流控通道分支的一个温育区段，但是优选许多温育区段由其分支。它们可以位于主通道的两侧。另外，该芯片可以包括许多这样的主通道。储池118包括用于包含样品的部分119和用于包含非水性液体121的储池120，其可以通过阀(未显示)与部分119离开。每个温育区段110包括4个元件，即容积vd的气体腔111，容积vb的温育孔113，容积为vc的连接这两个部分的微流控通道115，也称为气体交换通道，和容积va的微流控通道117，也称为温育区段的入口通道，从主通道123通向温育孔。因此，温育区段的总容积vabcd等于va+vb+vc+vd。容积为vkg的主通道123通过容积vin的吸入通道125连接至储池118，并通过容积vout的通道127连接至容积vvac的真空室129。因此，主通道的总容积vokg为各个容积的总和，即vokg＝vin+vkg+vout。在温育区段串联连接的芯片的情况下，主微流体网络的吸入通道的容积vin定义为主微流体网络的样品储池出口与温育区段第一(近侧)入口通道117从主微流体网络分支处的位置之间的部分的容积。具有分形几何形状的芯片图6、图7和图8示意性显示了分别包括16、32和128个温育区段的具有分形几何形状的芯片的部分。在图6中，标出了每个温育区段的元件。它们是：容积为vb的温育孔(62)，容积为vd的气体腔(64)，和微流控通道61(容积为va的温育区段入口通道)和63(容积为vc的气体交换通道)。优选地，气体腔64位于将样品引导至温育孔的入口通道61下方，并与入口通道通过预定厚度的基板材料分隔开。使吸入通道与气体腔重叠允许更有效地利用芯片上的空间，使得具有易于处理的尺寸的芯片(例如，约128mm×85mm的标准尺寸微孔板)，大量紧密间隔的温育区段(至多达640个或更多)可以位于芯片上，这通过在单次测试期间进行更多的细菌培养而改进其功能性。应当注意的是，独立反应孔的数量是限制现有技术ast测试卡功能的主要因素。在单个芯片上容纳如此多的温育区段的可能性使得可以获取有关样品中细菌的敏感性的全面信息(即通过允许测试更多抗生素或其组合的可能耐药性，确定需要进行大量培养的真正mic而不是确定抗生素浓度断点，可能发现耐药机制)。在这方面中，温育区段可以获得独特的性能，其显著超过现有技术中已知的ast测试卡的性能。优选地，如图6-8中最清楚地显示，为了有效利用芯片的面积，温育孔和气体腔之间的微流控通道63形成于基板的一个主面中和基板的相对主面中形成的一些或全部其他微流控通道中。通道65，66，67和68分别将样品引导至2、4、8和16个温育区段。类似地，通道70，81和82分别将样品引导至32、64和128个温育区段。计算1.芯片正确运行的数学模型和条件：1.1.关于几何结构的假设：1.1.1.分形的级等于i，表示温育区段vabcd的n＝2i1.1.2.与串联连接的芯片相比，温育区段的入口通道的形状变化。1.1.3.基础单元由容积为vabcd的两个温育区段构成。通道vk通向k个温育区段。1.1.4.没有真空室。1.2.温育片段填充期间的步骤：1.2.1.压力降低至值p0。1.2.2.通过将压力改变为示例性的优选压力p1，导致样品从样品储器流向微流控系统。因此，在微流控系统中将有以下的样品体积：1.2.3.在示例性的优选压力p2下，驱动非水性液体流入将样品储池和所述非水性液体储池与温育区段连接的微流控通道。然后向主微流体网络的通道进料体积为的非水性液体而将温育区段分隔开。1.2.4.在压力p3＝patm下使非水性液体进一步流入微流控系统。这允许压缩气体腔vd中的空气，并将样品充满整个温育孔。1.3.总结：1.3.1.在温度t1＝20℃下填充后，芯片的微流控结构中包含的气体v空气、样品vw和非水性液体vo的示例性优选体积公式：v空气＝2ivd1.3.2.温度t2＝37℃时的体积公式：1.3.3.最佳压力值：其中：是从样品储池通向温育区段的所有通道(除进入通道vin以外)的容积之和；vin是主微流体网络的进入通道的容积，即从样品储池(和非水性液体储池)通向芯片的分形微流控结构即第一分支点的通道；因此是从样品储池通向温育区段的所有通道的容积之和；p3是大气压。1.4.输入数据：p3＝patm，va＝0.197μl，vb＝2.45μl，vc＝0.174μl，vd＝1.17μl，i＝7，v2＝1·0.5·0.5μl＝0.25μl，v4＝2·0.5·0.5μl＝0.5μl，v8＝4·0.5·0.5μl＝1μl，v16＝4·0.5·0.5μl＝1μl，v32＝8·0.5·0.5μl＝2μl，v64＝8·0.5·0.5μl＝2μl，v128＝16·0.5·0.5μl＝4μl，vin＝4μl.1.4.1.结果-允许具有以上述容积的芯片和不同部分的容积之间的比例正确运行的最佳压力值：p3＝patm＝1013.25mbar，p0＝0.274p3＝278mbar，p1＝0.645p3＝653mbarp2＝0.906p3＝918mbar.具有分形几何结构和不对称分支的芯片1.1.芯片的几何结构不对称分形芯片的实例如图9所示。该芯片包括640个温育区段，其由以下结构构成i)4个具有128个温育区段的部分(如上所述)，图9中由91表示；ii)2个具有64个温育区段的部分，图9中由92表示。1.2.数学和设计假设：1.2.1.(从模型的角度来看)所有的温育区段是相同且不可区分的。1.2.2.每单个温育区段的所有供应通道的分容积(通向温育区段的所有通道的容积(包括通道vin)之和与共享这些通道的温育区段的数量之商)是恒定的。这对于每个温育区段可以通过对于每个从样品储池通向所涉及的温育区段的微流控通道部分将微流控通道段的容积与其通向的温育区段的数量的商求和而计算。1.2.3.所有温育区段均并联连接。这意味着只能存在通道的分支(或更一般而言，每个通道只能在岔口之处分成两个分支)，而没有任何串联连接。上述条件导致温育区段呈分形分布和样品和非水性液体均匀分配。1.3.数学模型第1.2点的假设并不会改变前一小节中推导的压力值，因为它们仅取决于温育区段中的样品和空气所占的容积，其是相同的。因此，我们获得以下压力值：i)最佳初始压力：其中v总是指从样品储池通向温育区段的所有通道的容积之和(没有进入通道vin)，且n表示温育区段的总数。ii)使样品流入温育区段所需的最佳压力：iii)用非水性液体隔离温育区段所需的最佳压力：1.4.结论—优化不对称分形芯片的几何结构对于确保其正确运行是必要的：1.4.1.在第一分叉100(图10)中，流入右侧的温育区段的样品的体积应该相应地大于流入左侧的温育区段的样品的体积。这些体积之比等于右侧和左侧的温育区段数之比。1.4.2.以上假设采用了相似的空气体积比，因此采用了右侧和左侧的通道容积比。在这种情况下，具有以下对称性：i)图10中的通道101-104和通道105-107必须分别具有与n右和n左成正比的容积，这可以表示为以下公式：ii)其他通道由相同数量的温育区段共享。因此，分叉a两侧的所有此类通道均相同，并且其数量随n右和n左按比例增加。结论1.1.具有分形几何结构的芯片不需要任何真空室129用于均匀填充所有的孔。因此，所需的样品体积等于具有可能的少量保留的温育孔的容积之和。1.2.温育区段的均匀填充不需要任何特定的液体流量控制。其通过热平衡和压力平衡实现。1.3.使用真空泵可以容易地施加所需的压力值。填充偏差等于或小于5％不会影响芯片的正确运行。1.4.上述推导显示压力的最佳值。然而，由于空气、样品和非水性液体对温育区段(va-vd)的元件的不同占据，压力可以以以一定容限施加。这些不同的构造应该确保样品一定不能进入气体腔，并且气体和非水性液体一定不能进入温育孔。但是，根据以下公式和规定，该条件为p0、p1和p2值留有一定的余量：·(气体仅填充气体腔)；·(气体填充气体腔和每个气体交换通道的一半)·(气体填充气体腔和气体交换通道)·(气体仅填充气体腔，样品仅填充温育孔)·(气体填充气体腔和每个气体交换通道的一半，样品填充温育孔和所有气体交换和入口通道的一半)·(气体填充气体腔，样品填充温育孔和入口和气体交换通道)·(气体填充气体腔，样品填充温育孔和气体交换通道，非水性液体填充入口通道(或它们的部分，取决于p1)以及通向温育区段的通道)·(气体填充气体腔和气体交换通道的一半，样品填充温育孔、气体交换通道的一半和每个入口通道的一部分(取决于p1)，非水性液体填充每个入口通道的一部分(取决于p1)和通向温育区段的通道)·p2max＝patm(气体填充气体腔和气体交换通道，样品填充温育孔和每个进气通道的一部分(取决于p1)，非水性液体填充每个入口通道的一部分(取决于p1)和通向温育区段的通道)。下表显示了如上定义的压力的示例值，其是针对具有不对称分支和容纳640个温育区段的芯片计算的。使用以下容积va＝0.36μl，vb＝2.26μl，vc＝0.26μl，vd＝1.06μl，vin＝0μl，而v总＝668.2μl。另外，patm假定等于1013.25mbar。p0min215.50mbarp0opt241.92mbarp0max268.35mbarp1min435.88mbarp1opt499.48mbarp1max510.46mbarp2min639.31mbarp2opt880.12mbarp2max1013.25mbar图11a至11g示意性地显示了填充芯片的一个温育孔的步骤的侧视图。图11a示意性地显示了芯片的一部分。该芯片包括：用于接收和存储用于分析的样品的样品储池11，用于接收和存储非水性液体的非水性液体储池13，通向非水性液体储池的非水性液体入口开口21，通向样品储池的样品入口通道23，通向通道22的样品储池出口开口27，通向通道22的非水性液体储池出口开口39，可以防止非水性液体离开非水性液体储池和进入样品储池的蜡阀24，从样品储池通向温育区段17′的入口通道57′的通道网络，通过气体交换通道115连接至其相关的不通气气体腔111的温育孔113。芯片中的腔室和通道周围和内部的环境压力为大气压patm。在图11b中，非水液体储池已经部分填充有非水性液体nal并在大气压下密封了入口开口21。在图11c中，样品储池已经部分填充有样品sam。入口开口保持对环境压力敞开。通道的网络的入口处存在的毛细管力和表面张力与样品储池下游封闭(不通气)的微流孔系统中含有的气体的背压之间的相互作用阻止样品进入通道网络。芯片放置于其中压力随后降低至低于大气压的压力p0的腔室内。这导致微流控系统中的气体膨胀，并使芯片中的一些气体从气体腔、气体交换通道、温育孔、入口通道和通道网络(主微流控网络)流出并穿过样品储池中的样品而到达芯片外部，直到微流控系统内部的压力等于p0。在图11d中，压力已升至高于p0的p1。样品上游和下游之间的压力差导致样品被推出样品储池而进入微流控系统，直到气体腔、气体交换通道、温育孔、入口通道和通道网络内的压力基本等于p1。在图11e中，非水性液体储池和样品储池之间的阀已打开。由于非水性液体储池中的压力最初大于p1，非水性液体储池中的非水性液体将从非水性液体储池流入样品储池，直到非水性液体储池中的压力下降至p1。优选地，非水性液体的密度大于样品的密度，使得过量的样品漂浮于非水性液体的顶部。在图11f中，环境压力升高到p2，其可以小于大气压或等于大气压。非水性液体被吸入通道网络中并到达温育区段17'的入口通道57'，从而防止温育区段17'与任何相邻的温育区段之间的交叉污染(串扰)。图11g显示了如果压力p2小于大气压则非水性液体继续渗透到温育区段中，且其会在芯片经受等于大气压patm的环境压力时发生。图12显示了根据本发明一个实施方式的样品储池141的实施方式的平面视图。以下段落与图12一起描述根据本发明的样品和非水性液体储池的正确运行的优选条件。当初始环境压力下降时，来自微流控结构的气体通过流经储池中的样品的通道从芯片内部排出。可选地，通过在装载样品之后用对液体不可渗透的材料覆盖样品入口开口可以防止样品流失。优选地该材料是气体可渗透的，以允许气体从样品储池中排出。由于在温育区段填充期间样品入口开口25并不一定由液体不可渗透材料覆盖(实际上其甚至可以是敞开的)，期望的是提供有助于确保样品不应通过该开口而损失的装置。这可以通过以下实现：将样品储池的垂直高度hs设置得足够大，以在储池中的样品表面和进口开口之间留出足够的距离，以防止在进口开口布置高于样品储池的出口开口时在正常使用中产生泄漏。优选地，芯片装载有样品并在基板的主表面垂直于水平面并且样品储池的入口开口高于样品储池出口的情况下运行。高度hs优选地大于或等于30mm，更优选大于或等于40mm，更加优选大于或等于50mm。此外，通过对样品储池提供一个或多个内部突起131和132，可以增强防止气体在通过样品储池排出期间被气泡夹带的样品泄漏。这些突起从储池的侧壁突出，并防止样品被向上流动的气泡推上去。它们应足够大，以改变气体可以通过其流动的通道的截面并改变气泡的形状。然而，突起的远端与相对的侧壁之间的距离也应大于毛细作用力促进液体流动的距离，以防止毛细作用力在此处影响样品。因此，样品储池的宽度ws优选大于或等于6mm，更优选大于或等于7mm，更加优选大于或等于9mm。突起的宽度wp优选大于或等于1mm，更优选大于或等于2mm，更加优选大于或等于3mm。突起的远侧末端与相对侧壁之间的间隙的宽度wg优选大于或等于3mm，更优选大于或等于4mm。样品储池在其下端(即与样品入口开口相对)处可以更宽。与狭窄的样品储池下端相比，这有助于排出气体，并且对于给定的样品体积，增加从样品的暴露表面至样品入口开口的距离，这有助于防止泄漏。所有宽度尺寸(即，垂直于样品储池的纵轴)都与这些效果有关。优选地样品储池在下端附近垂直于基板平面的宽度大于或等于5mm，更优选大于或等于7mm。优选地样品储池下部的基板平面中的宽度大于或等于10mm。这些条件显著影响样品储池的容积。其最小值等于单个温育孔的容积与芯片中温育区段数目的乘积。对于具有640个段的芯片，这个最小容积等于或大于1.5ml，但对于更小的区段数量则更小(例如，对于具有128个段的芯片约为0.29ml)。然而，从以上考虑因素可以看出，样品储池的容积应该更大。优选地其等于或大于其连接的芯片所有温育区段的温育孔的总容积的两倍，并且更优选其等于或大于温育区段的总容积的三倍。非水性液体(nal)储池143还应该具有大于最小nal体积的容积，该最小nal体积等于从样品储池通向所有温育区段的微流控通道的总容积。当nal在阀激活后流向样品储池时，液体之上的气体应该将其压力从patm改变成p1，其中p1是样品流入温育区段时微流控芯片中的压力。为了从储池中推出基本上全部体积的nal，其容积不应该小于其中vnal是上述的nal的最小体积。由于p1可以为约0.67patm或更小(通常随着温育区段数量的增加而降低)，因此nal储池具有优选等于或大于从样品储池通向所有温育区段的通道总容积的两倍的容积，更优选其等于或大于三倍的总容积。该储池还应该足够宽，使得毛细作用力不会阻止nal流至样品储池。该储池宽度wn优选大于或等于4mm，更优选大于或等于5mm，更加优选大于或等于6mm。由于nal通过nal出口开口39'进入样品储池并通过样品储池出口开口27离开时，其正确定位对于最小化nal的死体积是重要的。样品储池封闭于这些开口之间的部分的容积vact可以大于以上定义的nal最小体积。开口27优选还应该优选以小于或等于3mm的距离d1位于靠近样品储池的最低点。当进入样品储池的nal流下样品储池的侧壁时，这也是有利的。为此，优选的是小于或等于3mm的距离d2。根据本发明的芯片的一个实施方式具有基板，该基板的长度为12至13.5cm，优选12.8cm的长度，且宽度为8至9cm，优选8.5cm，如先前第14页描述的。最优选地，其具有ansislas1-2004(r2012)“微孔板的封装外形尺寸(footprintdimensionsformicroplates)”中规定的微孔板的封装外形尺寸，即127.76mm(公差±0.5mm)×85.48mm(公差±0.5mm)。优选地，其深度为0.19至0.22cm，优选0.20cm。优选地，如果基板由如先前在第9页中描述的连接在一起的两个部件制成，则基板可以具有等于或大于0.19cm且小于或等于0.22cm的厚度，并且储池部分厚度较大，例如，等于或大于1cm而等于或小于1.5cm。通过选择合适的腔室和微通道尺寸并将其设置于基板的两个主表面上，例如，如图1-2和图6-9最清楚地显示的，在芯片上可以形成共640个温育区段。优选地，样品储池的容积等于或大于4ml，小于或等于6ml，且更优选为5ml。优选非水储池的容积等于或大于2.0ml，小于或等于3.0ml，且更优选为2.5ml。优选微流控通道的总容积等于或大于500μl，小于或等于900μl，且更优选为约668μl。优选地，每个温育区段具有等于或大于3.0μl，小于或等于5.0μl的容积，且更优选约3.94μl的容积。优选地，每个温育孔具有等于或大于2.0μl，小于或等于2.50μl的容积，且更优选约2.26μl的容积。优选地，每个气体交换通道具有等于或大于0.2μl，小于或等于0.3μl的容积，且更优选约0.26μl的容积。优选地，不通气的气体腔每个具有等于或大于0.75μl，小于或等于1.25μl的容积，且更优选约1.06μl的容积。当前第1页12