专利名称：唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条及诊断法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫诊断检测盒或检测条及其诊断方法，尤是针对“唐氏综合症”血液中的相关抗原作出快速检测的检测盒或检测条及其诊断方法。
“唐氏综合症”Down’s Syndrom(缩写DS)即第21对染色体为3倍体，是一种常见先天性遗传性的智力发育障碍，新生儿含有不同程度痴呆，呈现精神呆滞，其发病率为千分之1.3。故在妊娠期早期诊断是优生的十分重要的一环。现有的早期诊断方法是母体妊娠期诊断，用羊膜穿刺或绒毛膜取样，这种方法具有损伤性，可诱发流产，其发生率为0.5-1.5％。
本发明目的在于提供一种能一步快速安全检测唐氏综合症免疫诊断检测盒或检测条及其诊断方法。
本发明是通过检测孕妇血液中与“唐氏综合症”相关的指标，如绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)，甲胎蛋白(α-FP)，妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated PlasmaProtein A，缩写PAPP-A)。本发明是在先申请的“半定量一步法免疫诊断法”申请号98122892.5的应用。基于抗原、抗体、可见颗粒标记以及固相层析的原理。可见颗粒标记包括象金标、硒标、碳标等。用半定量检测与“唐氏综合症”相关抗原在血液中浓度。
本发明的唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条，由标记抗体固相区；固相膜层析区；对照区；试验区；吸水纸分贴在一个平面板上组成。
固相膜层析区的层析膜为涂固有抗体的层析膜，标记抗体固相区的标记抗体为可见颗粒标记抗体如象金标、硒标、碳标等。
检测盒用于检测绒毛膜促性腺激素(hCG)时，所述的标记抗体固相区的标记抗体由抗绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和胶体金溶液、复合化学组分组成。
当检测盒或检测条用于检测绒毛膜促性腺激素(hCG)时，所述的包被抗体含有另一配对的抗绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。
当检测盒或检测条用于检测甲胎蛋白(α-FP)时，标记抗体固相区的标记抗体由作用于抗原不同位点上的抗α-FP单克隆抗体和胶体金溶液，复合化学组分组成。
当检测盒或检测条用于检测甲胎蛋白(α-FP)时，所述的包被抗体含有另一配对的抗α-FP单克隆抗体。
本发明是在检测与唐氏综合症相关的血液指标中的指标如绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、甲胎蛋白(α-FP)、妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated Plasma ProteinA，缩写PAPP-A)中应用。
本发明的检测盒或检测条含有或不含有待测物质抗原阻断剂。
本发明的唐氏综合症一步快速免疫诊断方法，包括有以下步骤(1)唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条；(2)待测物质为唐氏综合症相关的抗原血液浓度；(3)设定试验区和对照区，对照区颜色深浅程度代表待测物质的某一特定浓度即临界值，待测物质于检测盒或检测条的试验区所形成的色带与检测盒或检测条的对照区的色带颜色进行对比，以半定量方式决定待测物质抗原的浓度水平再以此判断唐氏综合症的可能性。
其待测物质为绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、甲胎蛋白(α-FP)、妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated Plasma Protein A，缩写PAPP-A)。
检测的血液中与唐氏综合症相关的指标是通过检测盒或检测条进行检测，检测盒或检测条的固相膜上设有试验区(T)和对照区(一个对照区C，或二个对照区C1/C2)。对照区色带深浅相当于某特定浓度待测指标称临界值。比较试验区和对照区色带，可判断待测抗原浓度范围。如待测浓度高于(或低于)临界值，予示胎儿有较大可能性为“唐氏综合症”患者，需进一步随访确诊。
检测盒或检测条包括一条层析吸收膜和一对能选择性鉴别待测样品血中相关抗原的单克隆抗体。层析膜的试验带上涂有相关单克隆抗体，而对照带上则涂有羊抗鼠抗体，其共分7个区，第1区是玻璃纤维膜，为样品吸收区，第2区为标记抗体固相区，第3区为固相膜层析区，第4区为对照区C1，是低临界值区，第5区为试验区T，第6区为对照区C2，是高临界值，第7区为吸水纸片，待测样滴加于第一区的玻璃纤维膜，展开剂以毛细管原理溶解第2区标记抗体、沿第3区层析膜上行。这时待测抗原成分与标记抗体形成紫色抗原抗体复合物。展开剂继续上行时，在第4、5、6区分别形成沉淀线。对照区“4、6”沉淀线颜色相当于“高”和“低”两个临界值(某些诊断只需一个临界值即检测盒或检测条只有一个对照区)。实验区“5”，即“T”的色带深浅与待测抗原含量成正比。抗原含量愈高色带愈深。在测试设定时间，约5-10分钟时，将“T”区的色带深浅与“C”区颜色比较，以决定抗原浓度范围。
检测盒或检测条的制备方法1、标记抗体的制备将所需抗体加入所需量胶体金溶液，搅拌10分钟后，加入1/10体积的1％小牛血清蛋白液作稳定剂，高速离心，取得红色沉淀物，即标记抗体。
2、将上述沉淀物溶解于缓冲剂F中，加之适量阻断剂，铺于玻璃纸上，真空抽干。
3、包被抗体制备将与标记抗体相对应之另一抗体溶液用喷雾方法划线于硝基纤维膜上，于37℃烘干20分钟。
4、装配将上述各组分贴在有胶面的塑料薄板上，上下两端再贴上吸水纸。切割成条，再装入塑壳之中。
如图1所示一步快速免疫诊断法的检测盒的结构示意图。
1—第1区样品吸收区2—第2区标记抗体固相区3—第3区固相膜层析区4—第4区对照区C15—第5区试验区T6—第6区对照区C27—第7区吸水纸片由于孕期不同，血中相关抗原的含量也不同，按孕妇的周龄不同，检测盒共有四种，如表1所示。
表1.不同孕龄的检测盒试验编号 用于测试孕妇的周龄14 1415 1516 1617 17实施例1DS-HCG测试1、材料单抗鼠抗体hCG标准品、吸水纸片、包被抗体是抗α-hCG单克隆抗体，标记抗体是抗β-hCG单克隆抗体、胶体金、硝基纤维膜、玻璃纤维膜、阻断剂、缓冲剂F。
2、方法(1)标记抗体将所需量的抗β-hCG抗体加入相应量胶体金溶液，搅拌10分钟后，加1/10体积的1％小牛血清蛋白作稳定剂，高速离心，取得红色沉淀物即为标记抗体。
(2)将上述沉淀物溶解于缓冲剂F，加之适量阻断剂，铺于玻璃纤维膜上，真空抽干。
(3)包被抗体，将抗α-hCG单克隆抗体溶液用喷雾方法划线于硝基纤维膜上，于37℃烘干20分钟。
(4)将上述各组分贴在有胶面的塑料薄板上，上下两端再贴上吸水纸，切割成条，制得本发明检测盒。
孕妇血液中hCG浓度与孕周有关。唐氏综合症孕妇血中hCG的水平为正常值的1.94倍，具体数据如表2。
表2正常与患者孕妇血液hCG水平
如某孕妇血液中hCG高于正常水平1.94倍，其婴儿患“唐氏综合”的可能性为65-75％。用于测定14周孕妇血样的检测盒，其第6区“C2”相当于hCG 64IU/ml水平，第4区“C1”相当于33IU/ml。测试时取14周孕妇血样，于加样后10分钟时，比较试验区“T”带与“C1带和C2”带的颜色深浅，如T＞C2，其婴儿患“唐氏综合症”的可能性为65-75％。以此类推其它孕周测试盒。
3.操作方法如图1所示首先将14周孕妇血样滴加至第一区玻璃纤维膜1上，展开剂以毛细管原理溶解于第2区标记抗体固相区2中、沿第3区固相膜层析区3上行，约数分钟，第5区试验区T5处形成色带T，在指定时间时，如10分钟，比较T带与第4区4中的C1带和第6区6中C2带颜色的深浅，如T带颜色深于C2带的颜色即可判断患唐氏综合症可能性为65-75％。
4.测试结果①产品批内差异检测
每个浓度测10管，其测定值和标准值100％一致。②产品批间差异检测用10种浓度(同批内差异)，四个不同批的测试盒在10天内重复测定10次，其测定值和标准值100％一致。③特异性检测如表3所示，下列物质对检测结果无干扰影响。
5.方法学评价特异性如表3所列的有可能干扰测试结果的物质在所试浓度下并不干扰血中hCG的测定。
正确性102个孕妇血样，用本检测盒和酶联法定量诊断法平行对比，其相关性为99％，参见表4。
表3测试有可能干扰测定结果的物质和浓度所加物浓度醋酸酚20mg/dl抗坏血酸 20mg/dl乙酰水杨酸20mg/dl阿托品20mg/dl咖啡因20mg/dl龙胆酸，2、5二羟苯甲酸20mg/dl氨苄青霉素20mg/dl四环素20mg/dl白蛋白2000ng/dl葡萄糖2000ng/dl人血清蛋白2000ng/dl尿酸 10mg/dl考的松200mg/dlDHEA-S500ng/dl雌二醇(E2) 25ng/dl雌三醇(E3) 25ng/dl黄体生成素(LH)300mIU/ml甲状腺刺激素(TSH) 1000μIU/ml滤泡刺激素(FSH) 1000mIU/ml
表4本发明与酶联法相关性(DS-hCG)病例 酶联法(IU/ml) 本发明方法117.1 T＜T2243.4 C2＜T＜C1332.0 T＝C2411.4 T＜C2512.7 T＜C2624.5 T＜C2721.4 T＜C2826.6 T＜C2915.5 T＜C210 47.9 C2＜T＜C111 66.9 T＞C112 12.0 T＜C213 34.0 T＝C214 20.0 T＜C215 21.4 T＜C216 19.9 T＜C217 29.3 T＜C21 8 31.2 T＝C219 19.4 T＜C220 47.9 C2＜T＜C121 32.1 T＝C222 49.4 C2＜T＜C123 50.6 C2＜T＜C124 32.2 T＝C225 17.1 T＜C226 19.4 T＜C227 29.3 T＜C228 39.3 C2＜T＜C129 27.2 T＜C230 8.4 T＜C231 29.9 T＜C232 44.0 C2＜T＜C133 36.4C2＜T＜C134 25.5T＜C235 21.1T＜C236 36.5C2＜T＜C137 29.4T＜C238 49.2C2＜T＜C139 28.1T＜C240 22.1T＜C241 34.1C2＜T＜C142 33.9T＝C243 12.6T＜C244 47.2C2＜T＜C145 18.1T＜C246 52.7C2＜T＜C147 22.1T＜C248 49.1C2＜T＜C149 21.2T＜C250 19.0T＜C251 12.7T＜C252 47.2C2＜T＜C153 51.2C2＜T＜C154 31.9T＝C255 49.1C2＜T＜C156 26.9T＜C257 28.2T＜C258 17.0T＜C259 29.4T＜C260 52.1C2＜T＜C161 9.1 T＜C262 47.7C2＜T＜C163 31.9T＝C264* 23.3T＝C265 18.9T＜C266 53.3C2＜T＜C167 21.1T＜C268 32.6T＝C269 42.2 C2＜T＜C170 19.9 T＜C271 17.8 T＜C272 18.4 T＜C273 29.3 T＜C274 66.2 T＞C175 26.9 T＜C276 42.1 C2＞T＞C177 29.0 C2＜T78 40.6 C2＜T＜C179 21.1 T＜C280 55.2 C2＜T＜C181 29.1 T＜C282 48.8 C2＜T＜C183 51.9 C2＜T＜C184 32.9 T＝C285 33.1 T＝C286 19.9 T＜C287 22.7 T＜C288 54.4 C2＜T＜C189 44.4 C2＜T＜C190 28.1 T＜C291 32.4 T＝C292 22.0 T＜C293 30.1 T＜C294 58.9 C2＜T＜C195 11.9 T＜C296 28.1 T＜C297 39.9 C2＜T＜C198 51.1 C2＜T＜C199 24.4 T＜C2100 32.8 T＝C2101 49.2 C2＜T＜C1102 19.9 T＜C2
综上所述，本发明用检测盒或检测条检测DS-hCG浓度与酶联法的相关性为99.0％。
实施例2 α-FP测试检测盒制备方法1、材料单克隆抗鼠抗体α-FP标准品、吸水纸片、包被抗体是抗α-FP单克隆抗体，标记抗体是另一作用于抗原不同位点上的抗α-FP单克隆抗体、胶体金、硝基纤维膜、玻璃纤维膜、阻断剂、缓冲剂F。
2、方法(1)标记抗体将所需量的另一作用于抗原不同位点的抗α-FP单克隆抗加入相应量胶体金溶液，搅拌10分钟后，加1/10体积的1％小牛血清蛋白作稳定剂，高速离心，取得红色沉淀物即为标记抗体。
(2)将上述沉淀物溶解于缓冲剂F，加之适量阻断剂，铺于玻璃纤维膜上，真空抽干。
(3)包被抗体将另一抗α-FP单克隆抗体溶液用喷雾方法划线于硝基纤维膜上，于37℃烘干20分钟。
(4)将上述各组分贴在有胶面的塑料薄板上，上下两端再贴上吸水纸，切割成条，便制得本发明检测盒。
孕妇血液中α-FP浓度水平随孕周而异。婴儿“患唐氏综症”的孕妇血中α-FP水平低于正常值的0.77倍(见表5)。
表5正常与患者孕妇α-FP水平
如某孕妇血液中α-FP浓度水平低于正常值的0.77倍，其婴儿患“唐氏综合症”的可能性为65-75％。14孕周检测盒第6区对照区的“C”相当于9.2IU/ml(该测试盒仅需一条)。于滴样后约10分钟时，比较“T”和“C”颜色的深浅，若T＜C其婴儿患“唐氏综合症”的可能性为65-75％。以此类推其它孕周测试盒。
3、操作方法将14周孕妇血样滴加至第一区玻璃纤维膜1上，展开剂毛细管原理溶解于第2区标记抗体固相区2中，沿第3区固相膜层析区3上行，约数分钟，第5区试验T5处形成色带T，比较第5区中T带与第6区中的C带的颜色深浅，如C带颜色深于T带的颜色，即可判断患唐氏综合症可能性为65-75％。
4、方法学评价特异性如表3所示的各物质在所试验浓度下，并不干扰血样中α-FP 0和9.2UIU/ml的测定。
正确性取102例用酶联法诊断的病人的血清，用本检测盒和酶联法同时比较，其相关性为99.0％，参见表6。
精密度批内差异共测了含有α-FP 0、6、9.2和12 UIU/ml的标准样品四种浓度，每个浓度测10管，结果测定值和标准值100％一致。
批间差异用4个不同的浓度(0、6、9.2和12 UIU/ml)四个不同批号的诊断盒在10天内重复测定10次，其测定值和标准值100％一致。
表6本发明与酶联法相关性(α-FP)病例酶联法(IU/ml) 本发明方法13.2 T＜C24.8 T＜C314.4 T＞C411.2 T＞C520.8 T＞C68.9 T＝C711.7 T＞C816.6 T＞C94.2 T＜C10 4.4 T＜C11 16.2 T＞C12 5.0 T＜C13 19.6 T＞C14 7.0 T＜C15 11.1 T＞C16 17.5 T＞C17 17.4 T＞C18 16.2 T＞C19 7.2 T＜C20 2.7 T＜C21 14.3 T＞C22 4.4 T＜C23 4.6 T＜C24 9.2 T＝C25 10.4 T＜C26 16.6 T＞C27 14.2 T＞C28 12.3 T＞C29 8.9 T＝C30 6.0 T＜C31 18.9 T＞C32 2.0 T＜C33 20.0 T＞C34 13.3 T＞C35 8.7 T＝C36 7.4 T＜C37 18.7T＞C38 4.1 T＜C39 8.9 T＝C40 5.5 T＜C41 4.1 T＜C42 3.9 T＜C43 12.2T＞C44 18.1T＞C45 22.0T＞C46 2.9 T＜C47 17.6T＞C48 2.3 T＜C49 5.2 T＜C50 7.6 T＜C51 12.2T＞C52 17.0T＞C53 19.0T＞C54 17.2T＞C55 12.7T＞C56 3.3 T＜C57 14.0T＞C58 5.0 T＜C59 19.1T＞C60 12.6T＞C61 14.4T＞C62 6.4 T＜C63 12.4T＞C64 13.9T＞C65 13.2T＞C66 4.8 T＜C67 8.9 T＝C68 2.9 T＜C69 5.0 T＜C70 4.9 T＜C71 8.1 T＜C72 3.3 T＜C73 6.0 T＜C74 6.7 T＜C75 7.4 T＜C76 14.2T＞C77 18.9 T＞C78 15.4 T＞C79 20.3 T＞C80 6.9 T＜C81 3.9 T＜C82 5.6 T＜C83 6.2 T＜C84 5.5 T＜C85 6.7 T＜C86 9.0 T＝C87 5.3 T＜C88 14.9 T＞C89 18.1 T＞C90 13.2 T＞C91 8.0 T＜C92 8.9 T＝C93 15.5 T＞C94 16.9 T＞C95 5.9 T＜C96 4.5 T＜C97 7.2 T＜C98 4.1 T＜C99 6.9 T＜C100 7.2 T＜C101 4.8 T＜C102 15.0 T＞C综上所述，本发明检测盒或检测条检测α-FP浓度与酶联法相关性为99.0％。
本发明与酶联法及羊膜穿刺法临床比较如表7所示，临床作了28例实例对比研究。
表7本发明与酶联法及羊膜穿刺法临床比较编号 α-FP DS-α-FP HCG DS-hCG 羊膜穿刺法酶联法 本发明方法 酶联法 本发明方法1 15.4 T＞C 32.0C1＜T＜C2 正常2 13.8 T＞C 42.2C1＜T＜C2 正常3 15.9 T＞C 31.0C1＞T 正常4 15.1 T＞C 29.8C1＞T 正常5 12.8 T＞C 45.6C1＜T＜C2 正常6 15.4 T＞C 32.2C1＝T 正常7 14.2 T＞C 49.6C1＜T＜C2 正常8 16.3 T＞C 30.8C1＞T 正常9 13.1 T＞C 44.1C1＜T＜C2 正常1012.8 T＞C 33.7C1＝T 正常1116.2 T＞C 48.2C1＜T＜C2 正常1214.9 T＞C 40.7C1＜T＜C2 正常1313.7 T＞C 29.1C1＞T 正常1412.4 T＞C 49.2C1＜T＜C2 正常1512.9 T＞C 51.4C1＜T＜C2 正常167.1 T＜C 70.1T＞C2 三倍体即DS唐氏综合症1712.8 T＞C 39.4C1＜T＜C2 正常1814.1 T＞C 58.6C1＜T＜C2 正常1912.9 T＞C 50.4C1＜T＜C2 正常2013.1 T＞C 49.6C1＜T＜C2 正常2112.2 T＞C 39.9C1＜T＜C2 正常2211.6 T＞C 55.2C1＜T＜C2 正常2313.6 T＞C 52.2C1＜T＜C2 正常2412.9 T＞C 47.5C1＜T＜C2 正常256.6 T＜C 72.2T＞C2 三倍体即DS唐氏综合症2612.9 T＞C 52.2C1＜T＜C2 正常276.9 T＜C 69.8T＞C2 三倍体即DS唐氏综合症2813.1 T＞C 52.2C1＜T＜C2 正常注孕周为14-15周综上所述，请参见表7，临床数据表明，使用本发明检测盒或检测条检测h-CG与α-FP的浓度诊断“唐氏综合症”与酶联法及羊膜穿刺法结果完全一致。
权利要求
1.一种唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条，其特征在于由标记抗体固相区；固相膜层析区；对照区；试验区；吸水纸分贴在一个平面板上组成。
2.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒或检测条，其特征在于固相膜层析区的层析膜为涂固有抗体的层析膜，标记抗体固相区的标记抗体为可见颗粒标记抗体。
3.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒或检测条，其特征在于当检测盒用于检测绒毛膜促性腺激素(hCG)时，所述的标记抗体固相区的标记抗体由抗绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和胶体金溶液、复合化学组份组成。
4.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒或检测条，其特征在于当检测盒或检测条用于检测绒毛膜促性腺激素(hCG)时，所述的包被抗体含有另一配对的抗绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒或检测条，其特征在于当检测盒或检测条用于检测甲胎蛋白(α-FP)时，标记抗体固相区的标记抗体由作用于抗原不同位点上的抗α-FP单克隆抗体和胶体金溶液，复合化学组份组成。
6.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒检测条，其特征在于当检测盒或检测条用于检测甲胎蛋白(α-FP)时，所述的包被抗体含有另一配对的抗α-FP单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒或检测条，是在检测与唐氏综合症相关的血液指标中的指标绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)和甲胎蛋白(α-FP)、妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated Plasma Protein A，缩写PAPP-A)中应用。
8.根据权利要求1所述的一步快速免疫诊断检测盒或检测条，其特征在于含有或不含有待测物质抗原阻断剂。
9.一种唐氏综合症一步快速免疫诊断方法，包括有以下步骤(1)唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条；(2)待测物质为唐氏综合症相关的抗原血液浓度；(3)设定试验区和对照区，对照区颜色深浅程度代表待测物质的某一特定浓度即临界值，待测物质于检测盒或检测条的试验区所形成的色带与检测盒或检测条的对照区的色带颜色进行对比，以半定量方式决定待测物质抗原的浓度水平再以此判断唐氏综合症的可能性。
10.根据权利要求9所述唐氏综合症一步快速免疫诊断方法，其特征在于其待测物质为绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、甲胎蛋白(α-FP)、妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated Plasma Protein A，缩写PAPP-A)。
全文摘要
本发明系利用半定量一步法诊断法,检测与唐氏综合症相关抗原指标的血液浓度,可早期预测唐氏综合症。本法仅需数滴血液或血清,于特定时间内将试验区(T)色带深浅与对照区(一个或数个)比较,即可决定待测指标的浓度范围。
文档编号G01N33/76GK1330270SQ00118669
公开日2002年1月9日 申请日期2000年6月15日 优先权日2000年6月15日
发明者卢惟钊, 卢儆翊, 顾芝萍, 曹霖 申请人:卢氏实验公司, 中国科学院上海药物研究所