组织重现和图像自动分析的制作方法

专利名称：组织重现和图像自动分析的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及光显微术，尤其涉及细胞化学染色和免疫生物化学染色自动分析技术。
背景技术：
当前的细胞成像系统中，由自动显微系统扫描包含染色细胞试样的染色玻片的区域。玻片的整个细胞试样区成像为一系列视场图像。为了进一步分析，必须分别分析各视场图像，使全部感举的候补对象位于视场图像内。此方法适合不大于观察图像宽度或长度范围的细胞体或细胞簇。对自动分析和人工分析而言，形态特征往往仅分析一个视场，从而分析环境仅限于一块玻片上的该视场。

发明内容
揭示一种生物试样图像自动分析方法。将生物试样染色或对比染色以提供特定标记，或者在免疫组织化学或原位混成的情况下，以可检测的方式对该标记示踪。这些标记包含本领域公知的酶、放射性同位素、萤光物或其他标记。然后，由光成像系统在多个位置扫描试样，以获取图像。而且，用相邻位置重现并提供整个试样的全部图像。又进一步处理重现的整个试样图像，以识别具有关注对象或关注区的坐标。对关注的候补对象选择这些坐标。一较佳实施例中，自动取得所关注候补对象的低倍率图像。最好该图像是彩色数字图像。对各试样中所关注像素的候补对象自动进行形态处理，以识别假像素和其余不识别为假像素的所关注像素候补对象。将取得低倍率图像的装置调节到较高的倍率，以便在低倍率图像对应的位置坐标，对每一候补对象或关注区获取高倍率图像。在第一彩色空间的高倍率图像的像素自动变换到第二彩色空间，以区别所关注像素的高倍率候补对像和背景像素并且识别所关注高倍率对象和第二彩色空间的关注像素的候补对象。因此，病理学家或技术专家能识别所关注的候补对象是否已对关注的标记特定染色，或对比染色，或者既特定染色又对比染色。
又揭示一种细胞图像自动形成方法，用于分析生物试样，该试样用苏木精和曙红(H/E)在一组织部分连续染色，并且借助一种或几种免疫组织化学(IHC)法和/或原位混成(ISH)法在并行的组织部分连续染色。为了识别在单一视场图像或用单一染色法不能获取的组织中的结构，本发明提供一种重现方法，以同时分析许多玻片上的许多视场。该方法用自动的方式将复合图像配对，以进行处理和分析。在机动化镜台上支承装有为识别结构而染色的生物试样的玻片。产生生物试样的图像，进行数字化并加以存储。由于物镜的视场小于整个生物试样，形成组织重现。然后，按一种顺序将这些存储的整个组织部分的图像放在一起，使H/E染色玻片与免疫组织化学玻片配对，以便病理学家可同时进行图像分析。可叠加该图像，或将其当作相邻图像观察。
一实施例中，本发明提供一种生物试样图像自动分析方法，该方法提供要分析的生物试样，在多个坐标自动扫描该试样，在每一坐标自动取得图像，从各图像重现试样的图像以便重现图像，并且处理该重现图像以便识别候补对象或关注区。
另一实施例中，本发明提供一种组织重现方法。此方法中，将生物试样的样本分成许多子样。用染色、对比染色、免疫组织化学法、原位混成法或其组合对每一子样进行处理。然后，扫描每一样本，从各样本取得图像。重现这些图像，使第一图像与对应的连续样本图像配对，以识别对象或关注区。
又一实施例中，本发明提供一种计算机程序，驻留在计算机可读媒体，用于进行生物试样图像自动分析。该计算机程序包含使计算机处理样本用的指令，其处理方法是在多个坐标扫描样本，重现各图像的样本以便形成重现的样本，识别重现图像中的候补对象或关注区的坐标，并且在从图像得到的坐标获取图像。


图1是细胞图像自动分析装置的立体图。
图2是图1所示装置的框图。
图3是图1所示装置卸去封壳后的俯视图。
图4是图1所示装置中显微镜子系统的侧视图。
图5示出玻片载体。图5a是变化使用图1所示装置用的玻片载体的俯视图。图5b是图5a所示玻片载体的仰视图。
图6示出自动玻片处理子系统。图6a是图1所示装置中自动玻片处理子系统的俯视图。图6b是沿A-A线的图6a自动玻片处理子系统部分剖视图。
图7a～7d说明自动玻片处理子系统的输出操作。
图8是自动决定扫描区的程序的流程图。
图9是图2中显微镜控制器的框图。
图10示出组织重现的方法。
详细说明综述图1和图3示出分析细胞试样用的自动显微镜，图2示出其框图。可用机动化镜台38支承玻片70(图5)。玻片装有生物试样，该试样通常染色，以识别分析所关注的结构。生物试样定义为装在显微镜玻片上的生物原体的细胞或非细胞样本。生物试样可以是例如组织部分、生物液试样(如显微镜玻片上的零星血液细胞旋样或直接种在玻片上的细胞悬浮液)。
至少一个光学传感阵列(诸如物镜)44a位于镜台上方，光源48则位于镜台下面。来自光源的光照射镜台和玻片，并且光学传感阵列(例如物镜)产生生物试样的图像。该图像存放在存储器中。最好图像是数字化的，或者是数字图像。由于光学阵列的视场小于整个生物试样，使镜台在平面方向移动该方向视场长度所对应的距离。于是，可捕捉该位置产生的图像，并加以存储。由于原图像存在光翻动，所捕获的图像沿其中心线翻动。在同一方向继续移动镜台并捕捉移动所得图像，直到达到玻片试样区的末端。这时，镜台在其他平面方向上移动该方向上视场长度所对应的距离，并产生另一图像加以存储。玻片用这种方式横向移动或扫描，直到通过物镜观察到玻上的整个试样区。然后，用一种顺序将这些存储的图像放在一起，该顺序集合这些图像以产生细胞试样的复合图像或重现图像。于是，可分析此图像，以检测跨越一个以上像界或一个以上玻片延伸的结构，同时作进一步分析。该分析的可识别视场中或叠盖二个或多个视场的对象中的候补对象或关注区。这种情况下，此系统会自动决定这候补对象的坐标，并可得到不同倍率的附加图像。
现有细胞成像系统中由自动显微系统扫描玻片区，用上述方式以系列视场图像形成整个玻片试样区的图像。然而，这些系统要求分别分析各视场图像，以便使关注的全部候补对象位于视场图像内，供进一步分析。这种方法可用于规模不超过图像的视场宽度或长度的细胞物。为了识别一个视场图像中不能捕获的组织的结构，本发明采用一种识别包含要分析的部分组织结构的视场图像的分析方法。首先识别相互邻近的视场图像，然后将这些视场图像识别包含有染色、抗体或试样要识别的组织结构。接着，又在高倍率下观察此组织图像部分，以另外取得详况。尚未揭示从视场图像自动建立组合试样图像，并且处理该组合图像或其构成图像，以识别超过一个视场的组织结构。
此外，现有自动系统的问题是不断需要操作者进行输入，使细胞对象处于初始位置的以便分析。这种不断依赖人工输入会导致出错，包括错过关注对象。这些差错会严重，尤其对所谓稀有事件的化验，例如在百万常规细胞繁殖的细胞中找出一个染色细胞。此外，人工方法非常费时，并且会要求进行高度训练，以正确识别或定量分析细胞。除了长时间厌烦人工检验会产生潜在差错外，相关的人工劳动还导致这些过程成本高。因此，需要一种能快速准确扫描玻片上大量生物物质的改良的自动细胞图像分析系统。
除非已定义，这是用的全部科技术语，其含义与本发明技术领域普通人员公知的相同。虽然本发明实践或测试中可用类似或等同于这里说明的方法和材料，但下文说明适当的方法和材料。
核染色剂、夹层染料和对比染色剂术语“核染色剂”指优先染色真核细胞核的细胞化学染色剂。许多核染色剂为夹层染料。术语“夹层染料”指本身能插在核酸的相邻核苷酸之间的化学化合物，用于提供可检测的颜色。
本领域已公知许多核染色剂，其中最常用的一种是苏木精。苏木精染色剂常与各种金属盐(媒染剂)组合使用。苏木精染色剂用于各种目的，依据所用的金属，具有各种颜色。铝色淀依据pH，为紫到蓝。铁色淀为深蓝。铬色淀也为深蓝。铜色淀为蓝绿到紫。镍色淀为各种紫罗蓝色调。锡色淀为红。铅色淀为深棕。锇色淀为绿棕。其他核染色剂包括吉姆沙染色、甲基绿(结合到富AT的DNA区)和核快红。
荧光染色剂包括Hoechst 33342、Hoechst 33258(Calbiochem)、在近紫外(350nm)激励并且在蓝光区(450nm)发光的二苯并酰亚胺(bisbenzimide)DNA夹层染料、噻唑橙、在可见光谱的蓝光区(515nm)激励并在绿光区(530nm)发光的DNA的荧光团染色剂、ADPI、菲啶溴红(即溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓)、普匹碘铵(即碘化3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲铵)丙基]-6-苯基菲啶)、TOTO、YOYO 1，本发明还包含SYTOX蓝或绿染色剂。优先结合富GC或富AT染色体区的几种染料与这些区结合时显示不同的荧光强度，造成荧光带图案。例如，7-氨基放线菌素D选择性的结合富GC的DNA区和9-氨基-6-氯-2甲氧基吖啶则在富AT的DNA区荧光强度最大。吖啶均二聚物与富AT的DNA区结合时，荧光发射较优。
术语“对比染色剂”与核染色剂组合使用时，指结合真核细胞区而不结合核的细胞化学染色剂。本领域已熟知许多对比染色剂。最常用的一种是曙红，它将真核细胞的细胞质染为不同的粉红色调。其他对比染色剂专用于特定细胞器官或细胞中的蛋白质。例如Kleihauer-Betke细胞化学染色专用于胎儿血红蛋白(一种优先体现于胎细胞中的血红蛋白质)，因而能定义为胎红血细胞的特定标记。术语“坐标”或“地址”用于表示试样或样本上的特定位置。可用任意数量的手段识别坐标和地址，这些手段包括X-Y坐标、r-P坐标和其他本领域技术人员知道的手段。
一实施形态中，用自动细胞成像方法识别母体血试样中的胎核红细胞。首先，按照胎儿血红蛋白的Kleihauer-Betke细胞化学染色识别胎细胞。自动细胞成像系统根据胎细胞比母体红细胞鲜红的颜色(胎儿血红蛋白的表示)将胎细胞作为对象识别。为了确保识别适当的对象，采用规模和形状的形态“滤器”，排除很小和很大的对象。
用另外的核酸的细胞化学染色剂将细胞加以对比染色，从而导致带核红血细胞(一般为胎红血细胞)为蓝色。自动图像分析系统识别鲜红对象中红细胞核的适当规模和形状的染色对象，使该成像系统可识别带核胎红细胞并进行计数。可考虑筛选胎儿的唐氏综合症，对这些细胞计数，其中，与常规妊娠相比，唐氏综合症妊娠中，这种细胞出现的频次通常较高。
一较佳实施例中，用苏木精/曙红(H/E)将玻片染色，并且将若干包含邻近部分的并行玻片染色成一个或若干个特定标记。
H/E染色的结果给细胞提供染成深蓝的核、染成粉红色调变化的细胞质、染成深桃红的肌纤维、染成深红的血红蛋白和染成桔红的红血细胞。
例如，按标准H/E规准备苏木精/曙红(H/E)玻片。标准溶液包含如下成份(1)若干吉尔苏木精(苏木精6.0g、硫酸铝4.2g、柠檬酸1.4g，碘化钠0.6g、乙二醇269ml、蒸馏水680ml)，(2)曙红(带黄曙红1.0g、蒸馏水00ml)；(3)碳酸锂1％(碳酸锂1g、蒸馏水100g)，(4)酸醇1％70％(浓酒精99ml、盐酸1ml)，(5)斯科特自来水。在包含11蒸馏水的烧杯中加入20g碳酸氢钠和3.5g硫酸镁。放入磁搅拌器，进行彻底混合，将各种盐溶解。利用过滤漏斗将该溶液倒入标瓶。
染色过程如下(1)将组织或细胞部分放入水中，(2)将这些部分放入苏木精内5分钟，(3)用自来水清洗，(4)在碳酸锂或斯科特自来水中使这些部分变“蓝”，(5)用自来水清洗，(6)将这些部分放入1％酸醇内几秒种，(7)用自来水清洗，(8)将这些部分放入曙红内5分钟，(9)用自来水清洗，(10)用分品酒精溶液脱水。装定这些部分。
特定标记是仅在生物试样成份子集中出现的分子或分子团，因而专门标识具有该标记的成份。特定标记常定义为特定抗体(单克隆或多克隆)识别的抗原，能用免疫组织化学检测。
另一组特定标记由这些标记专门与核酸试剂混成的容量规定。这些标记常用原位混成检测。
第三组特定标记可用其活性规定，能用组织化学检测。
第四组特定标记可用特定染料以组织化学法直接染色。
第五组特定标记可定义为专门结合一个或多个配体的受体。特定配体本身用于检测受体一配体复合物，所用检测方法包括组织化学、免疫组织化学或原位混成。
免疫组织化学法和原位混成法这里用的免没组织化学法包括采用检测细胞特定标记的试剂，诸如抗体和核酸试剂。包括单克隆抗体、多克隆抗体及其部分的抗体，常用于识别样本中所关注的蛋白质或多酞。根据免疫组织化学法，利用许多技术对关注的对象示踪。《分子生物学当前规约》(第14单元部分，Ausubel等著，John Wiley&Sons1995年出版)中讨论这些技术，其内容在此通过参考引入。例如，以下过程是采用抗体专门识别，尤其是HER2蛋白质的免疫组织化学染色的例子。在大部分胸癌中，按照特定标记描述HER2出现过份。此规约适用于对嵌入根据常规程序准备的组织部分的石腊染色。
此部分利用2次二甲苯浴并且通过分品酒精浴脱水后，放入去离子水，去除石腊。然后，在95C的抗原回收缓冲液培育该部分40分钟，该缓冲液包含柠檬酸盐。又将玻片冷却到室温，在同一缓冲剂中保持20分钟。然后，用去离子水冲洗玻片。
谨慎使组织部分周围的面积干燥，并且用疏水定界笔围绕玻片上试样画线。在该部分加入过氧物酶封闭液，并且在室温下培育5分钟。用洗涤缓冲液(一种平衡盐溶液)洗2次，在室温下用识别HER2蛋白质的第一抗体培育该组织部分30分钟。
用洗涤缓冲液洗3次后，用配合过氧物酶的第二抗体培育该组织部分。第二抗体专门识别第一抗体。然后，用洗涤缓冲液洗涤玻片3次。在具有DAB和双氧水的环境中培育该组织部分10分钟后，用水洗涤。
在苏木精中对该组织部分进行对比染色2分钟后，再次用水漂洗。采用含水固定媒体，以盖浆固定玻片。
细胞分子的免疫组织化学定位利用抗体与特定抗源结合的性能，其例子有关注的蛋白质，诸如高亲和力的致癌蛋白质和酶。这些抗体可用于对子细胞层或组织内的个体细胞定位抗体。
原位混成法包括专门示踪的核酸试剂，后者结合各细胞或组织部分中的细胞RNA或DNA。用标准分子生物技术制备适当的核酸试剂，该技术包括对核酸试剂的子克隆、质体制备和放射性示踪或非放射性示踪。
原位混成通常在石腊部分或冻结部分进行。这类技术常包含精选组织，以提供仅一个细胞层或少量细胞层后的样本。例如供仅一个细胞层或少量细胞层后的样本。例如包含组织样本的石腊块切割成约8um薄的组织部分，随后固定在打底玻片上，以便原位混成中进一步处理。或者，可用甲基丙烯酸盐进行分割。低温分割法尤其适用用于免疫组织化学和酶组织化学。
组织部分的免疫荧光示踪通常采用夹层测定或第一抗体与第二抗体的荧光色配合。在磷酸盐缓冲的盐水中洗涤含所关注组织部分的玻片后，将其暴露给结合所关注蛋白质对象的第一抗体，随后，洗涤该玻片后，将其暴露给合第一抗体的第二抗体。该玻片经洗涤后，进行显影。免疫组织化学染色和原位混成领域中公知的许多其他技术都能方便地适应用于这里揭示的免疫组织化学重现。
因此，本发明的方法中可用借助化学染色和/或免疫组织化学和/或原位混成技术的组合。例如可从单一组织试样制备许多子取样。可按以上讨论对第一子样本进行化学染色，并对后续的子样本采样免疫组织化学法和原位混成法。按以下讨那样对每一子样本进行扫描和处理。然后，可叠盖或处理重现的图像，以进一步识别关注对象。
组织重现组织重现是具体在将生物试样固定在玻片上时从分析的试样片构成整个试样图像的过程。通过以任何特定倍率拼合一个以上的视场产生该图像。
参阅图10，在玻片样本301的第一具体坐标捕获代表对象视场的图像302。玻片在X-Y镜台上自动重新定位，以取得对应于第二具体坐标303的第二(新)视场。此新视场最好紧邻第一视场，但只要在成像系统保持每一视场的坐标(地址/标识)，就可完成组织重现。重复此过程，直到捕获整个试样的图像。
根据每一图像的X和Y坐标，按数字方式重现试样。作为重现的一部分，由于原图像的光翻动，可将图像翻到正确。
形成组织重现图像的过程包括使装置扫描关注的显微镜玻片，并且形成扫描期间所得图像的重现图像。所形成的图像可以是整个扫描区或其部分的全色重现，例如识别关注对象或关注区的整个扫描区的重现。重现的数字图像可用于进一步处理或分析，以识别先前未检测到的关注对象和关注区。例如，在重现的数字图像中可识别叠盖一个或多个视场或玻片的关注对象或关注区。
参阅图1和图2，也称为系统的装置10包含显微镜32、机动化X、Y和Z镜台38、摄像机42适应接收并处理视频图像信号的计算机22和控制本装置并执行本方法的一套软件程序。用样本特征的光特性测量形成玻片和扫描区的图像，以寻找关注的子区，并分析这些区的特性。对样本赋值以求出关注区的图像处理方法采用24位彩色图像信号中色调、饱和度或强度以及亮度的度量产生黑中显白的关注目标图像。对该图像进行处理，其方法为分别将全色图像变换成色调、饱和度或强度以及亮度的分量，按门限值处理这些分量，在二个图像之间进行逻辑“与”，然后对所得图像进行门限处理，使任何零以上像位值成为255。参照下文说明的装置，会进一步理解上述处理和图像捕获。
自动化系统本发明提供一种自动分析生物试样的方法，不需要操作者进行输入，来定位分析用的关注生物对象或关注区。
参阅图1，带生物试样和试剂的已制备玻片放在玻片载体60(图5)中，该载体最好保持4个玻片。将该玻片载体放入自动化系统10的输入馈斗16。然后，操作者输入识别设备规约的数据，该规约包含每一玻片的扫描区的规模、形状和位置的信息，或者该系统最好在玻片处理时对每一玻片自动定位扫描区。于是，操作者启动系统10进行玻片处理。系统动作时，玻片载体60位于光学系统(诸如显微镜子系统32)的X-Y镜台38上。对载体中各玻片读取识别玻片用的任何条形码并加以存储。以通常为10X的低倍率快速扫描整个玻片。在每一扫描位置捕获一低倍率图像并进行处理，以检测候补对象或关注区。最好用颜色、规模和形状识别关注对象或关注区。各候补对象或关注区的位置可参照其坐标或地址加以存储。也存储每一视场，作为较大复合图像的部分(别处详述)。
在对镜台上载体中每一玻片完成低电平扫描时，可将光学系统调节到诸如40X或60X的高放大倍率，以便另外处理试样并捕获图像，而使X-Y镜台位于载体中各玻片上候补对象或关注区的存储位置。对各候补对象或关注区捕获高倍率图像，并执行一系列图象处理步骤，确认低倍率下完成的分析。对每一连续的对象或关注区存储高倍率图像。然后，这些图像可供病理学家或细胞技术专家检索，以进行最后诊断评价的观察。由于已存储每一对象或关注区的位置，可产生包含玻片的候补对象或关注区拼合体，并加以存储。病理学家或细胞技术专家可观看该拼合体，也可直接观看拼合体中对象或关注区位置上的玻片，以进一步评价。该拼合体可存储在磁媒体或光媒体上，以便将来参考，或者可发送到远端现场，供观察或存储。审查一块玻片包含的全部处理需要约4-100分钟，取决于扫描区规模和关注候补对象检测的数量。
本发明用于胎细胞产前诊断、稀有事件检测、快速细胞计数、组织评价和其他诊断。
自动扫描所捕获图像的处理，其步骤最好包括将图像变换到不同的色区，该变换最好通过色调、饱和度和强度。滤波所得图像的像素受到动态门限处理以抑制背景物，该处理包括执行形态处理以去除门限内图像的假图像，分析门限内图像以决定同色像素连接的一个或多个区域的存在，并将规模大于最小规模的各区归类为候补对像或关注区。
根据另一方面，自动决定扫描区，其方法包括扫描玻片，在各玻片位置捕获图像，分析各图像的纹理或彩色信息以检测试样的边缘，并存储所检测边缘对应的位置以限定扫描区。
根据再一方面，通过从扫描区中的点阵或位置初始决定焦面，达到光学系统自动聚焦。导出的焦面使低功率扫描操作中能接着快速自动聚焦。一实施例中，通过决定位置阵列上的适当聚焦位置，并执行聚焦位置阵列的最小平方拟合以取得该阵列的焦面，从而决定上述焦面。最好通过使2台的位置递增粗细迭代的固定数，以决定每一位置的聚焦处。每次迭代，捕获一图像，并计算像素方差、形态梯度或其他有关捕获图像的像素均值的光学参数，以形成一组评价数据。选择素均值的光参数，以形成一组评价数据。选择最小平方拟合曲线的峰值作为最佳聚集处的估值。
另一方面中，高倍率聚焦定位方法围绕低倍率图像分析期间定位的玻片内关注候补对象集中定位关注区。关注区最好是n列宽，n为2的幂。然后，用快速傅里叶变换处理该区的像素，以产生频率分量的频谱，和对应于各频率分量的复合幅值，最好是最大频率分量的25％到75％的频率分量的复合幅值进行平方并求和，从而取得关注区的总功率。对其他Z位置重变此过程，并将对应于关注区最大总功率的Z位置选为最佳聚焦处。此方法可配合许多细胞试样染色和类型使用。
根据又一方面，提供一种自动玻片操作方法。将一玻片和一些其他玻片并排地固定在玻片载体60上(图5)。玻片载体60与其他玻片载体一起位于输入馈斗16中，以便自动分析一批玻片。玻片载体装到光学系统32的X-Y镜台38上，以便分析其上的玻片。随后，在自动图像分析后，将第一玻片载体卸入输出馈斗18中，并自动装上另一载体。
参阅附图，如图1的立体图和图2的框图所示，用参考数10总体表示生物试样细胞图像自动分析装置。装置10包含装在壳体12中的显微镜子系统32。壳体12包含玻片载体输入馈斗16和玻片载体输出馈斗18。壳体12中的门14使显微镜子系统对外界安全。计算机子系统包含计算机22，该计算机具有二个系统处理器23、一个图像处理器25和一个通信调制解调器29。计算机子系统还包含计算机监视器26、图像监视器27和其他外围设备，后者包括存储器21、指点器30、键盘28和彩色打印机35。还示出外部电源24，用于对系统供电。显微镜子系统的观察目镜20从壳体12伸出，以便操作者观察。装置10还包含3芯片CCD摄像机42，用于通过显微镜子系统32摄取图像。计算机直接控制许多显微镜子系统的功能，后文将详述。与X-Y镜台38结合的自动玻片馈给机构37提供装置10中的自动玻片操作处理。照明光源48将光投射在X-Y镜台38上，接着通过显微镜子系统32成像，并由3芯片CCD摄像机42摄取，供图像处理器25进行处理。显微镜控制器31控制下的Z台或聚焦台46提供Z平面上显微镜子系统的位移，以便进行聚集。显微镜子系统32还包含机动化目标转盘44，用于选择目标。
装置10用于对制备的显微镜波片进行无人值守自动扫描，以便对诸如染色细胞候补对象或关注区进行检测和计数。本发明的一实施例中，可用于分析组织。另一实施例中，则用于稀有事件检测，其中每几十万常规细胞仅有一个候补对象受到关注，例如每2平方厘米面积的玻片有1到5个关注的候补对象。装置10根据例如颜色、规模和形状特征自动定位到候补对象和关注区进行计数，并估计细胞试样中存在的常规细胞。可用试剂制备生物试样，以取得带色的不溶解沉淀物。一实施例中，用此装置检测该沉淀物作为候补对象或关注区。
操作装置10时，病理学家或实验室技术员将制备的玻片装在玻片载体上。图5中示出玻片载体60，下文将进一步说明。每一玻片载体保持多达4块玻片。然后，将多达25个的玻片载体装入输入馈斗16。操作者可规定要扫描区域的尺寸、形状和位置，或者该系统能自动对该区域定位。然后，操作者通过图形用户接口命令系统开始对玻片进行自动扫描。随着将第一载体和玻片自动装在机动化X-Y镜台38，无人值守的扫描开始进行。在该装入操作期间，条形码读出器33读出贴在玻片上的条形码标记。然后，按使用者选择的低显微镜倍率(例如10X)对每一玻片进行扫描，以根据颜色、规模和形状特征建立组织重现或识别候补对象。将候补对象或关注区的X-Y位置加以存储，直到完成扫描。
完成低倍率扫描后，如果需要，装置可自动返回各候补对象或关注区，以诸如40X的高倍率重新成像、重新聚集，并进行进一步分析，以确认生物候补对象。该装置存储关注对象或关注区的图像，供以后病理学家观察。可将全部结果和图像存储到诸如可移动硬驱，光盘或DAT带之类的存储装置21，或者可发送到远端现场供观察或存储。可按图像拼合体观看各玻片的存储图像，以便进一步观察。此外，病理学家或操作者也可通过显微镜用其包含的目镜20直接观看或在图像监视器27上观看检测的对象或关注区。
二个系统处理器102还控制照明控制器106，后者用于控制子镜台照明48。从对系统照明的例如卤素灯泡发出的光会由于灯泡老化，光校准变化等因素而随时变化。此外，“过度染色”的玻片会使摄像机曝光减少到不可接受的程度。为了补偿这些影响，备有照明控制器106。此控制器配合光控制软件，用于补偿光的变化。光控制软件在一些时间间隔(诸如装入玻片载体之间)对摄像机的输出取样，并命令控制器把光调节到希望的程度。这样，光控制对用户是自动且透明的，不给系统操作增加额外的时间。
系统处理器23最好由2套并行的Intel公司的400mHz奔腾第六代设备组成，图像处理器25最好是Makrox Gemesis板。一较佳实施例中，计算机按Windows NT工作。会知道结合本发明，在此方法中可用任何数量的处理器和操作系统。
现参阅图3和图4，说明装置10的进一步详况，图3示出去除壳体12的装置10的俯视图。对显微镜子系统32的左面示出自动玻馈片锅给机构37的一部分，该部分包含载体取出装置34和取出平台36，结合玻片载体输出馈斗18，起接收已分析的玻片载体的作用。
提供振动隔离架40(图4中详细示出)，使显微镜子系统32与通常实验室环境中会出现的机械冲击和振动隔离。除外界振动外，X-Y镜台38的高速操作也会在显微镜子系统32引起振动。可使电子-光学子系统隔离该振动源，以免对图像质量产生不好的影响。隔离架40包含弹簧40a和柱塞406，埋在高粘度硅胶中，该硅胶封入与壳体结合的弹性膜片，从而阻尼因数达到约17％到20％。
自动玻片处理子系统每次操作一个玻片载体。图5a图5b示出玻片载体60，分别为俯视图和仰视图。玻片载体60包含用粘带62固定的玻片70(多达4块)。载体60包含挂耳64，用于将载体挂入输出馈斗18。在玻片载体60的上缘形成槽66和节距齿条68，以便机械上操作玻片载体。载体60的一侧形成键槽切口65，便于载体对齐。装在玻片载体60上的所制备的玻片72包含样本区72a和条形码标记区726。
图6提供玻片处理子系统的俯视图，该子系统包含玻片输入组件15、玻片输出组件17和X-Y镜台驱动带50。图6b提供图6a中沿A-A线剖切的局部剖视图。
玻片输入组件15包含玻片载体输入馈斗16、加载平台52和玻片载体加载子装置54。输入馈斗16在加载平台52的堆叠中接收一系列玻片载体60(图5a和图5b)。导键57从输入馈斗16的一侧伸出，与载体的键槽切口65(图5a)配合，以达到正确对准。
输入组件15还包含装在加载平台52的旋转分度凸轮56和开关90，下文进一步说明其操作。载体子装置54包含电动机86驱动的馈入驱动带59。馈入驱动带59包含推进片58，用于带59驱动时将玻片载体水平推进到X-Y镜台38。导引开关95在带59旋转期间感测推进片58。
具体参阅图6a，所示出的X-Y镜台38具有X位置电动机96和y位置电动机97，它们由显微镜控制器31(图9)控制，并且不考虑作为玻片处理子系统的部分。X-Y镜台38还包含孔55，使照明可达玻片载体。开关91装在孔55附近，用于感测与载体接触，从而启动电动机87，以驱动镜台驱动带50(图6b)。驱动带50是双侧定时带，具有与载体60的节距齿条(图5b)啮合的齿。
玻片输出组件17包含玻片载体输出馈斗18、取出平台6和玻片载体取出子装置34。取出子装置34是电动机89，用于取出操作(下文说明)期间使取出平台36围绕轴98旋转。电动机88驱动的馈出齿轮93啮合载体60的节距齿条68(图5b)且可转动，以便将载体传送到对开关92静止的位置。弹簧加载压紧机构将载体按位置保持在取出平台36上。
现在说明玻片处理操作。参阅图7，示出的一系列玻片载体60堆叠在输入馈斗16中，并且其上缘60a对齐。玻片处理操作开始时，电动机85驱动的分度凸轮56前进一圈，使仅有一个玻片载体落到馈斗16的底部，并且落在加载平台52上。
图7a～7b较详细示出凸轮的动作。分度凸轮56包含装有上叶片56b和下叶片56c的壳56b。叶片56a和56c是半圆形部，相互对置并且在垂直方向上隔开。在图8所示的第一位置，上叶片56b在槽部66支持位于底部的载体。在分度凸轮旋转180度的位置(如图7b所示)，上叶片56b不再支持该载体，而代之以该载体略为下落，并由下叶片56c支持。上叶片56b已充分旋转，从而啮合下一玻片载体的槽66，而对置的下叶片56c仍支持该底层载体。在如图7d所示转整个360度后，下叶片56c已对载体堆叠反向转动，不再支持当前已停留在加载平台52上的底层载体。在该位置，上叶片56b支持下一载体，重复进行以上的循环。
再次参阅图6a和图6b，载体跌落到加载平台52时，其接触使启动电动机86和87的开关90闭合。电动机86驱动馈入驱动带59，直到推进片58与载体接触，并将载体推到X-Y镜台驱动带50上，该驱动带50使载体前进，直到与开关91接触，该开关的闭合启动这里进一步说明的玻片扫描过程。完成扫描过程时，X-Y镜台38移到卸载位置，并且启动电动机8和88，用镜台驱动带50将载体输送到取出平台36。电动机88驱动馈出齿轮93，使其啮合载体60的载体节距齿条68(图5b)，直到接触开关92。开关92的闭合启动电动机89，使输出平台36转动。
在输出组件17的端视图(图7a～7d)较详细示出下载操作。图7a中，按支持玻片载体60的水平位置示出输出平台36。压紧机构94在一端固定载体60。图7b示出电动机89使输出平台36转动到垂直位置后的输出组件17，在该位置弹簧加载压紧机构94将玻片载体60释放到输出馈到18。借助挂耳64(图5a和图5b)将载体60支持在输出馈斗18中。图7c示出转回水平位置的输出平台16。平台16向上转动，与存放的载体60接触。向上的移动将载体推到输出馈斗18的前面。图7d示出对输出馈斗18输出一系列玻片载体60后处于原水平位置的输出平台36。
专利申请08/758,436中进一步说明装置10涉及扫描、聚焦和图像处理的诸方面，该专利在此引入。
计算机的实施可在硬件或软件或者二者组合中实现本发明的各方面。然而，本发明的算法和处理过程最好在可编程计算机执行的一个或多个计算机程序中实现，每一计算机包含至少一个处理器、至少一个数据存储系统(包括易失性和非易失性存储器和/或存储单元)、至少一个输入装置和至少一个输出装置。应用程序码输入数据，以执行这里说明的功能，并产生输出信息。以公知方式将该输出信息加到一个或多个输出装置。
各程序可用任何希望的语言(包括机器语言、汇编语言、高级过程评议或面向对象编程语言)实现，以便与计算机系统通信。任何情况下，该语言可以是被编译语言或解释语言。
每一上述计算机程序最好存放在通用或专用可编程计算机可读的存储媒体或器件(例如ROM、CD-ROM、磁带或磁盘)，以便计算机读取存储媒体或存储器件以执行这里说明的程序时，配置并操作计算机。本发明的系统也可考虑作为用计算机程序配置的计算机可读存储媒体实现，这样配置的存储媒体使计算机按专门和预定的方式工作，以执行这里说明的功能。
已经说明本发明的一些实施例。然而，可作各种改进而不脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受具体说明的实施例限制，仅受所附权利要求书的范围约束。
权利要求
1.一种生物试样的图像自动分析方法，其特征在于包含(a)提供要分析的生物样本；(b)在多个坐标自动扫描该样本；(c)在每一所述坐标自动取得图像；(d)从每一个体图像自动重现样本的图像以形成样本的重现图像；(e)处理该重现图像以识别候补对象或关注区。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于还包含(a)自动识别重现图像中候补对象或关注区的坐标；(b)在从重现图像获得的位置坐标上自动捕获关注对象或关注区的图像。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用免疫组织化学检测关注对象或关注区。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用原位混成检测关注对象或关注区。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用染色剂检测关注对象或关注区。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，染色剂是从以下各项构成的组选择的核酸染料苏木精、吉姆沙染色剂、甲基绿、核快红、Hoechst 33342、Hoechst 33258、噻唑橙、DAPI、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓、碘化3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲铵)丙基]-6-苯基菲啶、TOTO、YOYO-1、SYTOX蓝、SYTOX绿、7-氨基放线菌素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、和吖啶均二聚物。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用诸如曙红或Kleihauer Betke细胞化学染色剂或其组合的细胞质染料对关注对象和关注区进行染色。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，关注对象和关注区是细胞特定标记。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用核染色和对比染色检测细胞特定标记。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用免疫组织化学、原位混成、染色或其组合检测细胞特定标记。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重现图像是数字图像。
12.一种组织重现方法，其特征在于包含(a)在一系列玻片上提供生物试样的样本，其中连续样本是(1)由诸如苏木精和曙红(H/E)之类的核染色剂进行染色，或(2)用免疫组织化学(IHC)法以可检测方式进行示踪并进行对比染色，或(3)用原位混成(ISH)法以可检测的方式进行示踪并进行对比染色，或(4)用IHC和ISH法的组合以可检测的方式进行示踪并进行对比染色；(b)从每一样本自动取得图像；(c)自动重现样本图像，使第一样本图像与具有相应图像的连续样本配对；(d)自动执行试样的组织重现。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，第一样本和连续样本具有叠盖的图像。
14.一种计算机程序，驻留在计算机可读媒体上，用于自动分析生物试样，其特征在于，该计算机程序包含使计算机执行以下操作的指令(a)处理样本，其中用核酸染料和对比染色剂对该样本染色；(b)在多个坐标扫描该样本；(c)在每一所述坐标取得图像；(d)从各个体图像重现样本以形成该样本的重现图像；(e)识别重现样本中候补对象或关注区的坐标；(f)在从重现样本取得的位置坐标上捕获关注对象的图像。
15.如权利要求14所述的计算机程序，其特征在于，样本的重现图像是数字图像。
16.一种计算机程序，驻留在计算机可读媒体上，用于组织重现，其特征在于，该计算机程序包含使计算机执行以下操作的指令(a)从一系列玻片上的生物试样产生图像，加以数字化并且存入存储器中，其中连续样本是(1)由诸如苏木精和曙红之类的核染色剂进行染色，或者(2)用免疫组织化学(IHC)法以可检测的方式进行示踪以及进行对比染色，或者(3)用原位混成(ISH)法以可检测的方式示踪以及进行对比染色，或者(4)用IHC和ISH法的组合以可检测的方式进行示踪以及进行对比染色；(b)按一种顺序安排存放的样本图像，使核酸染色和对比染色的样本与连续IHC或ISH样本配对；(c)自动执行试样的组织重现。
全文摘要
所提供的组织重现生物试样图像自动分析方法(图2的42)是一种分析生物试样的自动细胞成像方法,该试样或是用原位混成(ISH)法或免疫组织化学(IHC)法或核酸染色加以连续染色,以及对比染色。该方法以自动方式配合复合图像进行处理和分析,以识别单个视场图像或单一染色技术不能捕获的组织中的结构(图2的44)。所揭示的内容提供一种同时分析许多玻片上的视场(图2的37)的组织重现方法。
文档编号G01N1/30GK1384949SQ00808767
公开日2002年12月11日 申请日期2000年4月10日 优先权日1999年4月13日
发明者B·埃利斯, W·德克尔, G·姆克拉朗 申请人:色品视觉医学体系股份有限公司