专利名称：结核抗体金标测试条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种结核抗体金标测试条及其制备方法。
背景技术：
各种资料显示全球约三分之一人口感染了结核菌。每年约有800万新病例，年死亡人数超过150万。为此结核成为2000-2001年WHO防治传染病的重点控制对象。200年12月20日卫生部公布了第四次全国结核病流行病学抽样调查结果我国结核病情相当严重，在部分地区甚至有蔓延的趋势。据调查全国有1/3以上人口感染了结核菌，其中有10％的人已经发病；如不采取有效措施，在未来十年内，可能有3000万人发生结核。目前我国传染性结核患病率为157.8人/10万，据估算，全国现有传染性肺结核患者200万人，西部12个省、市、自治区的病情尤其严重，在西部地区传染性肺结核患病率高达197人/10万，且呈蔓延趋势，现已有传染性肺结核病人65万人。
控制结核病的重点是监控痰涂片阳性结核病患者，使发病患者及早得到治疗。对结核菌感染者进行早期监控和治疗防止发病。
目前诊断结核的方法主要有痰涂片结核菌检查、结核菌素试验(PPD)、结核杆菌聚合酶链反应(PCR)和结核杆菌抗体检测等方法。在上述方法中痰涂片方法的特异性最高达100％，但敏感性低为22.2％。结核菌素实验(PPD试验)敏感性有所提高，但存在特异性差，易受BCG抗体的影响，而且结果判定时间太长。PCR虽然敏感性高，但同时存在特异性差；而且试验仪器设备昂贵，对操作人员和环境要求高，人为误差较大。结核杆菌抗体检测的敏感性高达60-80％，但也同样存在特异性不高的问题。因此，在结核的诊断中，几种方法可以相互配合。
在上述几种方法中相比，结核抗体检测方法比较简便，快速。有利于结核早期诊断。目前临床已经应用的结核抗体检测方法有酶联免疫吸附试验ELISA，但ELISA法实验过程需要2-3步，结果判定需1-2小时；而且需要专门实验设施和专业操作人员。
本发明的公开本发明的主要目的是为了提供一种结核抗体金标测试条，该测试条具有高度的种特异性和高灵敏度，而且速度快、操作简便，无需专门设施。
本发明的另一目的是为了提供一种结核抗体金标测试条的制备方法，该方法简单、稳定性、重复性好。
本发明的主要目的可通过如下措施来实现一种结核抗体金标测试条，包括衬板和保护层；在衬板的两端分别粘贴有由滤纸制成的手持端吸水层和测试端吸水层；在手持端吸水层和测试端吸水层之间的衬板上设有纤维素膜制成的检测层；在测试端吸水层与检测层之间设有结核抗原金标抗体层；在检测层上设有检测线和控制线。
本发明的另一目的可通过如下措施来实现一种结核抗体金标测试条的制备方法包括金标抗体层和检测层及其上包被检测线和控制线的制备，以及测试条的组装。
所述的金标抗体层的制备包括i胶体金的制备，在浓度为0.01-0.05％的氯金酸中加入其体积的1.2-1.8％、浓度为1％的柠檬酸三钠，煮沸10-20分钟，还原成15-50纳米的胶体金原子液；ii结核抗原的制备，取结核菌标准株TBRV株培养物溶于生理盐水离心分离得沉淀物，再将沉淀物溶于生理盐水后再离心分离，如此反复洗涤4-8次除去培养基成份；然后将沉淀物超声粉碎12-15次，每次30秒，将粉碎物经3.8-4.5万g高速离心，取上清液过凝胶层析柱，收集结核抗原活性峰；iii结核抗原胶体金标记，在100ml胶体金溶液中加入2-10mg上述ii制备的结核抗原；再在上述胶体金溶液中按0.1-0.6g/100ml加入动物血清白蛋白；然后又在上述胶体金溶液中按6-12ml/100ml加入10％的盐液；最后离心去沉淀，取上清再离心得沉淀物，将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02M、PH7.4Tris-HCl含0.1-0.6％动物血清白蛋白、0.02％的叠氮钠得结核抗原胶体金溶液；iv将结核抗原胶体金溶液浸着玻璃纤维或无纺布，浸入量以浸入液体开始向外流出为止，然后在37℃下干燥得金标抗体层。
所述的凝胶层析柱选自Sephardex G100、Sephardex G200、SepharclyS100、Sepharcly S200、Sepharcly S300中的一种。
所述的检测层的制备，在制备的结核抗原和兔、羊抗结核杆菌抗体中加入固定剂，然后喷膜机将结核抗原和兔、羊抗结核杆菌抗体喷在纤维素膜上形成检测线和控制线；再用0.01MPH7.0PBS液含10％小牛血清封闭30分钟漂洗、干燥得检测层。
所述的固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。
本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明的金标试纸条检测结核抗体时采用一步法，具有高度的特异性和高灵敏度，其检测快速，结果判定在3-15分钟内完成，无需专门试验设施、试验条件和专门的操作人员，适合结核感染人群的初筛和流行病学调查。
2、本发明的试纸条的制备方法具有制作简便，稳定性、重复性好。
图面说明
图1是本发明的结构示意图1-衬板2-保护层3-手持端吸水层4-检测层5-检测线6-控制线7-金标抗原层8-测试端吸水层本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一参照图1，一种结核抗体金标测试条，包括衬板1和保护层2；在衬板1的两端分别设有由多层滤纸制成的手持端吸水层3和测试端吸水层8；在手持端吸水层3和测试端吸水层8之间的衬板1上设有检测层4；在测试端吸水层8与检测层4之间设有金标抗体层7；在检测层4上设有检测线5和控制线6。
一种结核抗体金标测试条的制备方法包括金标抗体层7和检测层4及其上包被检测线5和控制线6的制备，以及测试条的组装。
所述的金标抗体层7的制备包括i胶体金的制备，在浓度为0.01-0.03％的氯金酸中加入其体积1.6％的柠檬酸三钠，煮沸10-20分钟，还原成15-50纳米的胶体金原子液；ii结核抗原的制备，取结核菌标准株TBRV株培养物20ml(从固体培养基刮取结核菌落)溶于20ml、0.9％的NaCl溶液，经3000转/分离心10分钟分离得沉淀物，再将沉淀物溶于20ml、0.9％NaCl溶液中，再经3000转/分离心分离，如此反复洗涤6次除去培养基成份；最后将沉淀物溶于20ml、0.9％NaCl溶液中超声粉碎14次，30秒/次，将粉碎物经40000G高速离心1小时，取上清液过Sepharcly S100凝胶层析柱，用0.9％NaCl溶液洗脱、流速0.6ml/分，收集结核抗原活性峰；iii结核抗原胶体金标记，在100ml胶体金溶液中加入6mg上述ii制备的结核抗原；再在上述胶体金溶液中按0.24g/100ml加入牛血清白蛋白；然后又在上述胶体金溶液中按8ml/100ml加入10％的NaCl溶液；最后经2000转/分离心10分钟去沉淀，取上清再经10000转/分离心1小时得沉淀物，将沉淀物按8ml/100ml溶于0.02M、PH7.4Tris-HCl液得结核抗原胶体金溶液；其中含0.25％牛血清白蛋白、0.02％的叠氮钠；iv将结核抗原胶体金溶液浸着玻璃纤维或无纺布，浸入量以浸入液体开始向外流出为止，然后在37℃下干燥得金标抗体层7。
所述的检测层4的制备，在制备的浓度为2mg/ml的结核抗原和兔抗结核杆菌抗体中加入2％固定剂，然后喷膜机将结核抗原和兔抗结核杆菌抗体喷在纤维素膜上形成检测线5和控制线6；再用0.01MPH7.0PBS液含10％小牛血清封闭30分钟漂洗、干燥得检测层4。所述的固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。
最后在塑料衬板1的两端分别粘贴手持端吸水层3和测试端吸水层8的滤纸，并在其中段粘贴纤维素膜制成的检测层4，在测试端吸水层8与检测层4之间夹贴含金标抗原的玻璃纤维的抗原层7，其4/5部分夹在测试端吸水层8，1/5部分压在检测层4上，然后在手持端吸水层3和测试端吸水层8上附上不干胶的保护层2。
实施例二除检测层4的纤维素膜上控制线6为羊抗结核杆菌抗体外，其余条件均与例一同。
权利要求
1.一种结核抗体金标测试条，包括衬板(1)和保护层(2)；其特征在于在衬板(1)的两端分别设有手持端吸水层(3)和测试端吸水层(8)；在手持端吸水层(3)和测试端吸水层(8)之间的衬板(1)上设有检测层(4)；在测试端吸水层(8)与检测层(4)之间设有结核抗原金标抗体层(7)；在检测层(4)上设有检测线(5)和控制线(6)。
2.一种权利要求1所述的结核抗体金标测试条的制备方法，其特征在于包括金标抗体层(7)和检测层(4)及其上包被检测线(5)和控制线(6)的制备，以及测试条的组装。
3.如权利要求2所述的结核抗体金标测试条的制备方法，其特征在于所述的金标抗体层(7)的制备包括i胶体金的制备，采用公知方法制备胶体金；ii结核抗原的制备，取结核菌标准株TBRV株培养物溶于生理盐水离心分离得沉淀物，再将沉淀物溶于生理盐水后再离心分离，如此反复洗涤4-8次除去培养基成份；然后将沉淀物超声粉碎，将粉碎物经高速离心，取上清液过凝胶层析柱，收集结核抗原活性峰；iii结核抗原胶体金标记，在100ml胶体金溶液中加入2-10mg上述ii制备的结核抗原；再在上述胶体金溶液中按0.1-0.6g/100ml加入动物血清白蛋白；然后又在上述胶体金溶液中按6-12ml/100ml加入浓度为10％的盐液；最后离心去沉淀，取上清再离心得沉淀物，将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02M、PH7.4Tris-HCl(PBS)含0.1-0.6％动物血清白蛋白、0.02％的叠氮钠得结核抗原胶体金溶液；iv将结核抗原胶体金溶液浸着玻璃纤维或无纺布，浸入量以浸入液体开始向外流出为止，然后在37℃下干燥得金标抗体层(7)。
4.如权利要求2或3所述的结核抗体金标测试条的制备方法，其特征在于所述的凝胶层析柱选自Sephardex G100、Sephardex G200、SepharclyS100、Sepharcly S200、Sepharcly S300中的一种。
5.如权利要求2所述的结核抗体金标测试条的制备方法，其特征在于所述的检测层(4)的制备，在制备的结核抗原和兔、羊抗结核杆菌抗体中加入固定剂，然后喷膜机将结核抗原和兔、羊抗结核杆菌抗体喷在纤维素膜上形成检测线(5)和控制线(6)；再用0.01MPH7.0PBS液含10％小牛血清封闭30分钟漂洗、干燥得检测层(4)。
6.如权利要求2或5所述的结核抗体金标测试条的制备方法，其特征在于所述的固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种结核抗体金标测试条及其制备方法，包括衬板和保护层；在衬板的两端分别粘贴有由滤纸制成的手持端吸水层和测试端吸水层；在手持端吸水层和测试端吸水层之间的衬板上设有纤维素膜制成的检测层；在测试端吸水层与检测层之间设有金标抗体层；在检测层上设有检测线和控制线；其中检测层上包被有结核抗原和兔、羊抗结核杆菌形成的检测线和控制线；在其金标抗体层上由玻璃纤维或无纺布上浸有胶体金标记的结核抗原；本发明测试条具有高度的种特异性和高灵敏度，而且速度快、操作简便，无需专门设施；其制备方法简单、稳定性、重复性好。
文档编号G01N33/569GK1425775SQ0113183
公开日2003年6月25日 申请日期2001年12月11日 优先权日2001年12月11日
发明者李克生, 杜惠芬 申请人:李克生