具有分离固体能力的测试片的制作方法

专利名称：具有分离固体能力的测试片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适于检测血液中的被检物质的测试片，其主要属于生物材料的化学分析领域。
背景技术：
在检测生物样品，如血，尿或脑脊髓液中包含的任何一种成分时，通常需要一系列的分析过程，如样品液的吸收，扩散，反应，检测等。特别是，在使用含血细胞和血浆的血液(在下文中，有时也称其为“全血”)试验中，所要检测的是血浆中的葡萄糖，并将其作为被检物质而量化，但血细胞可对测量结果产生各种影响，并倾向于引起误差。由于这个原因，在使用全血的血液试验中，我们希望能够将血细胞和血浆分离。现在已经进行了很多分离全血中的血细胞和血浆，并检测所分离血浆中的被检物质的试验。
如上所述，已知有一种测试仪，其原理是利用血细胞和血浆之间比重的差异，通过离心分离血细胞。然而，这种测试仪需要离心机，从而使得用来检测被检物质的装置变得复杂了，且较大的规模和所用的试剂也使其变得更加复杂，这是我们所不希望的。
另一方面，如上所述，已知有一种测试片，其可分离全血中的血细胞，并通过使用着色试剂与被检物质显色来检测血浆中的被检物质。该测试片优于上述测试仪，其原因在于它可通过用全血点样来检测被检物质。
已知有这样一种多层测试片，在其光透底层上覆盖有多孔结构的血细胞分离层，该血细胞分离层是由不对称膜，玻璃滤光器，或用有机聚合物固定的聚合物颗粒组成的，光透底层上还覆盖有含着色试剂的试剂层，所述着色试剂可与被检物质显色(例如，JP49-53888 A，JP55-90859A，等)，且由有机粘合剂固定的聚合物颗粒组成的，颗粒间具有适宜空隙并形成含着色试剂的试剂层的测试片可分离血细胞，展开血浆，并检测被检物质(例如，JP57-160063A，等)。
然而，在上述多层测试片中，全血倾向于在血细胞分离层上展开，且血细胞和血浆的分离主要是利用它们各自的重量在垂直方向上分离，从而在血细胞分离层的顶部形成血细胞层。因此，当通过测量透射光来量化被检物质时，如果被检物质通过着色试剂显色，那么上述血细胞层会挡住测量光，从而无法测量透射光。
另外，还可根据被检物质将氧供给于其上，检测并测量被检物质。在这种情况下，上述测试片倾向于在血细胞分离层上形成血细胞层，从而导致对氧较差的渗透性；为了供给氧，还需提供一种氧供给工具，如在试剂层和底层之间提供一种氧渗透膜。给上述层压型测试片提供氧供给工具，如氧渗透膜是比较困难的，且成为制造测试片时成本增加的原因。
在上述层压型测试片中，全血倾向于在血细胞分离层上展开，且所述分离主要发生在垂直方向上，因此为了在试剂层中充分展开被检物质，需将足量的血液点样到血细胞分离层中，从而使得在进行单次测量时，需要较大量的样品。
在上述多层测试片中，血液分离层是通过用有机聚合物固定聚合物颗粒而形成的，所述有机聚合物倾向于吸水且膨胀，血细胞分离层中的颗粒间的空隙太小，以致于血浆难以展开，进而不能在试剂层中展开足量的血浆。
在JP57-160063A中公开的测试片中，颗粒间适当的空隙是在层中形成的，这样由于毛细管作用，血浆不仅在垂直方向上展开，而且还在水平方向上展开，这对于进行上述透射光的测量而言是有利的。然而，因为像上述多层测试片那样，血细胞倾向于在试剂层上扩散，因此在测量透射光时仍然存在下列问题，如与血细胞层形成有关的氧渗透性的降低，及血细胞层对光的遮挡。且，在这些测试片中，当血浆在层中展开时，染料和其它通过与着色试剂反应而产生的物质也进一步展开，从而造成被检物质浓度分布的偏差。
且，因为所述测试片是通过用粘合剂固定聚合物颗粒而产生的，这样可在颗粒间形成适当的空隙，因此它们的产生比较复杂且困难。

发明内容
本发明是在考虑到上述因素的情况下进行的，本发明的目的是提供一种可通过测量透射光来测量被检物质的测试片，其具有较好的氧渗透性，且能更精确地测量被检物质。
本发明具有下列可达到目的的组成部分。
就是说，本发明提供一种具有分离含固体和液体的样品中的固体，从而检测包含在液体中的被检物质能力的测试片，其具有多孔结构的试剂层及支持所述试剂层的底层，其中所述多孔结构的试剂层含有颗粒，无机凝胶，和与被检物质发生可检测反应的试剂，其中所述颗粒与所述无机凝胶彼此粘合，使颗粒之间形成空隙，从而捕获固体。
在本发明中，优选所述样品是含血细胞和血浆的血液(全血)，所述底层的表面具有亲水区域，且该亲水区域支持所述试剂层。
在本发明中，优选所述颗粒的粒径为0.5-10μm，颗粒的终浓度为1-30重量％，且形成无机凝胶的无机胶凝剂的终浓度为0.1-3重量％。
在本发明中，优选所述试剂是一种可通过与被检物质反应而引起光学变化的试剂，且所述底层是由透光物质制成的。
本发明的测试片具有试剂层，和支持该试剂层的底层。
所述试剂层具有多孔结构，其含有颗粒，无机凝胶，和与被检物质产生可检测反应的试剂。在所述试剂层中，所述颗粒与所述无机凝胶彼此粘合，使颗粒之间形成空隙，从而捕获固体。
而所述颗粒可以是任何一种颗粒，只要它们能捕获颗粒间空隙中的固体，在上述粒径范围内具有较窄粒径分布的那些颗粒在分离固体时是优选的。且，可使用具有较宽粒径分布的颗粒或使用具有相对较大粒径的颗粒，优选使用具有10μm或更小粒径的颗粒形成颗粒间的适宜空隙。
颗粒的适宜粒径可根据在颗粒间的空隙中捕获的固体(例如，上述血细胞等)的大小而改变。可使用粒径约为30μm，优选0.5-10μm，更优选3-8μm的颗粒。如果与上述范围相比，所述颗粒的粒径太小，则可能液体的展开不能流畅地进行，而如果与上述范围相比，所述颗粒的粒径太大，则不能充分捕获固体。
虽然试剂层中颗粒的适宜含量可根据所期望的液体展开距离或试剂层的适宜厚度而改变，但优选1-30重量％的终浓度。如果与上述范围相比，颗粒的含量太小，则试剂层的厚度可能不够，而如果与上述范围相比，颗粒的含量太大，则试剂层的厚度会比所希望的还大。
优选上述颗粒具有尽可能接近球形的形状，以便在颗粒间形成良好的空隙。在本发明中，可使用任何种类的颗粒，只要它们能满足上述条件。这种颗粒的例子是，例如，无机颗粒，包括玻璃珠，聚合颗粒如胶乳珠等。在这些之中，更优选使用聚合颗粒，这是因为在生产时，易于控制其粒径，颗粒形状及粒径分布。购买工业品即可得到这种聚合颗粒。也可通过常规方法，如悬浮聚合法或乳液聚合法生产它们。
上述无机凝胶与上述颗粒彼此粘合，使试剂层具有多孔结构。因为与有机凝胶相比，通常无机凝胶吸水时几乎不膨胀，因此当通过测量透射光而测量被检物质时，细胞长度(试剂层的厚度)更有可能保持稳定，且在液体展开的过程中，试剂层中颗粒间的空隙更可能保持稳定。
此外，因为通常用于形成无机凝胶的无机胶凝剂倾向于吸附具有极性取代基的化合物，染料等，它们倾向于吸附上述试剂和试剂与被检物质间的反应产物(染料等)，因此在检测被检物质时，浓度分布的偏差几乎不会发生。
此外，如果所述无机凝胶是一种具有触变性的凝胶，则在形成无机溶胶时，流动性非常好，且可通过持续蒸馏(胶凝)而使之变硬。因此，在上述底层上形成试剂层时，这些是适宜的。且，由于加水而变透明的无机凝胶适于通过光学变化来检测被检物质。
上述试剂层中无机胶凝剂的适宜含量可根据所用颗粒的量和所用无机胶凝剂的性质(胶凝能力等)而改变，优选终浓度为0.1-3重量％。与上述范围相比，如果无机胶凝剂的含量太小，那么颗粒之间不能充分粘合，则不能形成试剂层。与上述范围相比，如果无机胶凝剂的含量太大，那么过量的无机胶凝剂填充在颗粒间的空隙中，对液体的展开产生不利的影响。
通常所用的无机胶凝剂是，例如，Laponite系列(由Nippon SilicaIndustrial Co.，Ltd.生产)，Lucentite SWN，和SWF(由Co-op ChemicalCo.，Ltd.生产)，Thixopy W(由Kyowa Chemical Co.，Ltd.生产)，SmectonSA，和Kunipia(由Kunimine Industries Co.，Ltd.生产)，Multigen(由Hojun Kogyo Co.，Ltd.生产)等。
上述试剂可在各种化合物中找到，如染料前体，其形成光学可检测的物质，如染料和荧光染料，电化学可检测的电子转移物质的氧化形式或还原形式，或通过氧化-还原反应，酸-碱反应，缩合反应，络合物形成反应等形成络合物的化合物。
首先，详细解释形成光学可检测物质的试剂。
可使用上述染料前体，优选具有共轭键系，如芳香环的化合物。例如，通过偶合剂间的氧化缩合形成醌染料的试剂有4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮(在下文中，缩写为“4-AA”)，和一种氢供体；形成氧化着色染料，如邻-二甲基联苯胺和联苯胺的染料前体；被氧化而形成颜色的染料前体，如染料的隐色体形式；被氧化而形成荧光物质的试剂；发光材料，如化学发光材料；被还原而形成染料的试剂，如四唑(鎓)盐；由于pH改变而形成偶氮染料的重氮盐；用于产生荧光物质的试剂；与酶形成染料或荧光物质的酶底物；形成络合物且显色或变色的化合物等。
上述氢供体是一种化合物，如苯酚，其可在氧化剂共存的条件下，通过与4-AA或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮缩合而产生醌染料。氢供体的具体例子包括二氯酚；邻-甲氧基苯酚；1，2，3-三羟基苯；二甲基苯胺；N-乙基-N-磺丙基-间-茴香胺；N-乙基-N-磺丙基苯胺；N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺；N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；N-乙基-N-磺丙基-间-甲苯胺；N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)-间-茴香胺；N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)苯胺；N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺；N-(2-羟-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺；N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)-间-甲苯胺；N-(3-磺丙基)苯胺等。
上述邻-二甲基联苯胺和联苯胺的例子包括邻-二甲基联苯胺；联二茴香胺；3，3’-二氨基联苯胺；3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；N-(3-磺丙基)-3，3’，5，5’-四甲基联苯胺等。
上述隐色体形式是一种无色的染料前体，其可被氧化而变成染料并显色。通过氧化隐色体形式而产生的染料的例子包括2，6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环己二烯-1-酮；2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环己二烯-1-酮；7-(二乙氨基)-3-亚氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪盐；3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鎓(phenazinium)盐；3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(phenothiazin)-5-鎓盐；1-羟-5-甲基吩嗪鎓(phenazinium)盐；7-羟-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等。
隐色体形式的例子包括4，4’-亚苄基双(N，N-二甲基苯胺)；4，4’-双[N-乙基-N-(3-磺丙基氨基)-2，6-二甲苯基]甲烷；1-(乙氨基硫代羰基)-2-(3，5-二甲氧基-4-羟苯基)-4，5-双(4-二乙氨基苯基)咪唑；4，4’-双(二甲氨基)二苯胺；N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯胺盐；10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐等。
被氧化而显色的染料前体的其它例子包括4-甲氧基苯酚；4-乙氧基苯酚；2-乙氧基苯酚；1-(2-羟-5-甲氧苯基)ethanone；2-羟-5-甲氧基苯甲酸；2-羟-5-甲氧基苯甲醛；甲基2-羟-5-甲氧基苯甲酸盐；4-甲氧基-2-硝基苯酚；2-氯-4-甲氧基苯酚；4-羟-3-甲氧基苯甲醛；4-羟-3-甲氧基苯甲酸等。
染料前体的其它例子包括3-(4-羟苯基)-2-丙烯酸；2-羟苯基乙酸；3-羟苯基乙酸；4-羟苯基乙酸；3-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；2-氨基苯甲酸；3-氨基苯甲酸；4-氨基苯甲酸；3，4-二氨基苯甲酸；3，5-二氨基苯甲酸；4-氨基-2-氯苯甲酸；4-氨基-3-甲基苯甲酸；4-氨基-3-甲氧基苯甲酸；4-氨基邻苯二甲酸等。
此外，染料前体的例子包括2，4-二氨基-6-羟嘧啶；4，5-二氨基-6-羟嘧啶；4-氨基-2，6-二羟嘧啶；6-羟基-2，4，5-三氨嘧啶；4，5-二氨基-2，6-二羟嘧啶；4-氨基-6-羟基-2-甲基嘧啶；4-氨基-6-羟基-2-甲氧基嘧啶等。
上述被氧化而形成荧光物质的试剂的例子包括4-羟苯基乙酸；(4-羟-3-甲氧苯基)乙酸；3-(4-羟苯基)丙酸；4-羟-(2-氨乙基)苯酚；4-羟-N，N，N-三甲基benzenemethaminium；-氨基-对-羟基氢化肉桂酸；4-羟基苯乙胺；N-(4-羟苯基)N-乙酰苯胺；2，7-二氯荧光素二乙酸酯等。
在产生上述染料的氧化反应中，优选使用氧化剂如过氧化氢，和氧化酶如过氧化物酶作为氧化剂参与氧化反应。然而，当然，参与上述氧化反应的氧化剂不仅限于此，其可以是各种已知的氧化剂和氧化酶。
上述发光材料如化学发光材料的例子包括萤火虫荧光素，Cypridina荧光素；aequorin；光泽精衍生物；鲁米诺衍生物；吖啶鎓(acridinium)酯；peroxalate等。
四唑(鎓)盐的例子包括2，3，5-三苯基四唑(鎓)盐；2，5-二苯基-3-(1-萘基)-2H-四唑(鎓)盐；3，3-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯基)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝苯基)-5-苯基-2H-四唑(鎓)]盐；3，3-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯基)-4，4’-二基]-双[2，5-二苯基-2H-四唑(鎓)]盐；2-(4-碘苯基)-3-(4-硝苯基)-5-苯基-2H-四唑(鎓)盐；2-(4-碘苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑(鎓)盐；2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑(鎓)盐；3，3’-(1，1’-联苯基-4，4’-二基)-双(2，5-二苯基-2H-四唑(鎓))盐；3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑(鎓)盐等。
被还原而产生染料的化合物的例子包括还原形式，如1，1’-二甲基-4，4’-二吡啶鎓(bipyridilium)盐，和1，1’-二苄基-4，4’-二吡啶鎓(bipyridilium)盐。且，7-羟-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等也可被还原而产生荧光染料。这种产生荧光染料的试剂的例子包括通过还原7-羟-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物，5-氰基-2，3-双(4-甲苯基)-2H-四唑(鎓)盐，2，3-双(4-氰基苯基)-5-氰基-2H-四唑(鎓)盐等而产生的荧光物质。
在产生这种染料的还原反应中，优选使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸等作为还原剂参与还原反应。然而，参与上述还原反应的还原剂不仅限于此，其可以是各种已知的还原剂和还原酶。
上述可通过pH改变而显色或变色的化合物的例子包括磺酞染料如溴甲酚绿，溴酚蓝，酚红，溴代邻苯三酚红，和邻苯三酚红；三苯甲烷染料如孔雀绿，和玫红酸；喹啉染料如喹哪啶红，和N-(对-羟苯基)-2，6-二氯-对-苯醌亚胺；噁嗪酮染料如7-羟-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物；香豆素染料如6，7-二羟-4-甲基香豆素；导电的高分子化合物如苯胺低聚物。
上述重氮盐的例子包括与吲哚酚偶合产生偶氮染料的2-甲氧基-4-吗啉重氮苯盐；与粪胆色素原偶合产生偶氮染料的3，3’-二甲氧联苯基-4，4’-重氮盐。在此类中，还有其它涉及产生重氮盐反应的试剂。这种试剂的例子包括在有亚硝酸盐存在的情况下产生重氮盐的4-氨基苯胂酸；与上述重氮盐偶合产生偶氮染料的N-1-萘基亚乙基二胺。此外，这种试剂的其它例子包括在亚硝酸盐存在的情况下，通过偶合产生偶氮染料的2，4-二氯苯胺；和N，N-二乙基-N’-1-萘基萘基亚乙基二胺草酸盐(Tsuda试剂)。还包括亚硝酸盐。
上述用于显色反应的试剂的例子包括，但不限制于用于检测醛的过氧化氢和1，4-二氨基苯；用于检测醛的2，3-二甲基-2，3-双(羟氨基)丁烷；用于检测醛的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮和一种氧化剂；用于检测仲胺的1OH-吩噻嗪和溴；用于检测硫醇的2，2’-二硫代吡啶等。
上述用于产生荧光物质的试剂的例子包括，但不限制于用于检测胍基化合物的2-羟-1，2-二苯基ethanone；用于检测组胺的邻-苯二醛；用于检测亚精胺的邻-苯二醛；用于检测.-酮酸的1，2-二氨基-4，5-二茴香醚等。
上述通过酶反应形成染料或荧光物质的酶底物的例子包括，但不限制于作为胰凝乳蛋白酶底物的N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸-2-甲基吖啶酮；作为氨肽酶底物的L-丙氨酸-2-甲基吖啶酮；用于测量酯酶的7-乙酰氧基-N-甲基喹啉(鎓)盐；作为酯酶底物的7-乙酰氧基-3H-吩噁嗪-3-酮；作为磷酸酶底物的4-甲基umbeliferil磷酸盐；作为磷酸酶底物的5，10，15，20-四(4-膦酰基羟苯基)卟吩等。此外，所述的酶或酶底物可与，例如抗体或其片段化学结合。
上述形成络合物并显色或变色的化合物包括配体，其通过配价键或离子键与金属离子或阴离子形成络合物，产生染料或荧光物质等。与金属离子形成络合物而显色或变色的化合物的例子包括被认为是金属指示剂或色实电解质(chromoionophores)的化合物，及通过与有色过渡金属离子形成络合物而显色的化合物。这种化合物的具体例子包括乙二胺四乙酸；2，2-双吡啶；1-羟-2-(2-羟苯偶氮基)苯；二苯并-18-冠-6；二环己基并-18-冠-6；环状多元胺；杯状[4]芳烃；3-[N，N-双(羧甲基)氨甲基]-1，2-二羟蒽醌；5’，5”-二溴代邻苯三酚磺酞；2-羟-1-(1-羟-2-萘偶氮基)-6-硝基-4-萘磺酸盐；2，6-二氯-4’-羟-3’，3”-二甲基品红酮-5’，5”-二羧酸盐；3，3’-双[N，N-双(羧甲基)氨甲基]荧光素；8-[N，N-双(羧甲基)氨甲基]-4-甲基伞形酮；2，7-双(2-胂羧基苯偶氮基)-1，8-二羟-3，6-萘二磺酸；5-氯-2-羟-3-(2，4-二羟苯偶氮基)苯磺酸；5-[(六氢化-2，4，6-三氧-5-嘧啶基)亚氨基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮盐；2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯胺盐；1，8-二羟-2-(2-吡啶偶氮基)-3，6-萘二磺酸盐；2-亚硝基-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚等。
特别是，可与一价阳离子形成有色络合物的化合物的例子包括四[3，5-双(三氟甲基)苯基]硼酸盐；四苯基磷盐等。
特别是，可与钙离子形成荧光络合物的化合物的例子包括1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟-3-氧-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸盐；五乙酰氧基甲基1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟-3-氧-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸盐；1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基(benzofuranyloxy)]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸盐；五乙酰氧基甲基1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基(benzofuranyloxy)]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸盐；1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸盐；五乙酰氧基甲基1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸盐；8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N’，N’-四乙酸盐；五乙酰氧基甲基8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N’，N’-四乙酸盐；3，3’-双[N，N-双(羧甲基)氨甲基]荧光素；8-[N，N-双(羧甲基)氨甲基]-4-甲基伞形酮等。
此外，还包括与阴离子形成有色络合物的四苯基鉮盐，与氯离子形成络合物从而减小荧光强度的N-乙氧羰基甲基-6-甲氧基喹啉鎓溴化物，与硼形成络合物的8-羟-1-(亚水杨氨基)-3，6-萘二磺酸盐。
特别是，举例说明了上述试剂可检测的物质被检物质是葡萄糖，葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，4-AA，和N-甲基-N(2-羟-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；被检物质为胆固醇，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，4-AA，和N-甲基-N-(2-羟-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；被检物质为乳酸，乳酸盐脱氢酶，NAD+，黄递酶，和四唑(鎓)紫；被检物质为碱性磷酸梅，磷酸对硝基苯。
然后，对形成电化学可检测物质的试剂进行详细的解释。
所述电化学可检测的试剂包括，例如，电子转移物质的氧化形式和还原形式，与特定离子形成离子键或配价键从而形成络合物的配体等。
所述电子转移物质是化学物质，其用酶等氧化或还原被检物质，它们直接或间接从被检物质接受电子或给被检物质提供电子。当这种电子转移物质的还原形式或氧化形式在电极上被氧化或还原时，可根据电化学反应量化被检物质。
具体地说，电子转移物质包括1，1-二甲基-4，4’-二吡啶鎓盐；1，1’-二苄基-4，4’-二吡啶鎓盐；1，4-二氨基苯；2-甲基-1，4-naphtoquinone；N-甲基phenadinium盐；1-羟-5-甲基phenadinium盐；1-甲氧基-5-甲基phenadinium盐；9-二甲基氨基苯并-.-吩噁嗪-7-鎓(ium)盐；二茂铁衍生物；六氰基离子(II)盐；7-羟-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物；3，7-二氨基-5-苯基phenadinium盐；3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基phenadinium盐；1，4-苯二醇；1，4-二羟-2，3，5-三甲苯；N，N，N’，N’-四甲基-1，4-苯二胺；.2，2’-联-1，3-二硫醇；2，6-二甲基苯醌；2，5-二甲基苯醌；2，3，5，6-四甲基-2，5-环己二烯-1，4-二酮；2，6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环己二烯-1酮；2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环己二烯-1酮；7-(二乙氨基)-3-亚氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪盐；3，7-双(二甲氨基)吩噁嗪-5-鎓盐等。
配体，特别是与阳离子形成络合物的配体的例子包括四[3，5-双(三氟甲基)苯基]硼酸盐；四苯基磷盐；缬氨霉素；环(N，N’-二辛基-D-门冬酰-L-脯氨酰-L-丙氨酰)2；双(苯并-15-冠-5)；双[(苯并-15-冠-5)-4-甲基]庚二酸盐；双(12-冠-4)；双[(12-冠-4)甲基]-2-月桂基-2-甲基丙二酸盐；14-冠-4；月桂基-甲基-14-冠-4；6，6-二苄基-1，4，8，11-四氧杂环十四烷；二苯并-18-冠-6；二环己基-18-冠-6；4，16-二-N-十八基氨基甲酰基-3-氧杂丁酰基-1，7，10，13，19-五氧杂-4，16-二氮杂环二十一烷等。
与阴离子形成络合物的配体包括四苯基鉮盐，6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉(鎓)盐等。
除了上述颗粒，无机凝胶和试剂外，还详细说明了包含在试剂层中的试剂，所述试剂层还可包括通常所用的添加剂等，只要它们不会抑制试剂层分离固体的能力和被检物质与试剂间的反应。
例如，上述样品是人的血液，固体是血细胞，液体是血浆。既然这样，在等渗的情况下，血细胞中红细胞的较长直径为6-9μm，随着试剂的pH值和盐浓度的改变，红细胞的大小和状态也发生改变，如果试剂层的pH值和盐浓度不合适，则红细胞不能被捕获在试剂层颗粒间的空隙中。适用于这种情况的添加剂是，例如，缓冲液如bis-tris缓冲液(由双(2-羟乙基)亚氨基-Tris(羟甲基)甲烷和盐酸制备的缓冲液)，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，和N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸盐缓冲液；和中性盐，如氯化钠等。
此外，在利用光学变化通过测量反射光检测被检物质时，可将透光物质作为底层，且可使用三氧化钛的粉末等作为添加剂，其可通过反射或散射测量光来增加测量光的反射率。
此外，可使用表面活性剂作为添加剂来改善液体的展开。这种表面活性剂的例子包括糖-烷基醚如正-辛基-.-D-喃葡萄糖；糖-烷基硫醚如正-辛基-.-D-硫代喃葡萄糖和正-庚基-.-D-硫代喃葡萄糖；糖酰胺如正-辛酰基-N-甲葡糖酰胺和正-壬酰基-N-甲葡糖酰胺；糖酯如.-D-吡比喃果糖基-.-D-喃葡萄糖一癸酸盐；N，N-双(3-D-葡糖酰氨丙基)脱氧胆酰胺(deoxycholamide)。
试剂层的厚度可影响液体的展开距离，即厚度较大则液体展开距离较大，厚度较小则液体展开距离较小。因此，试剂层的适宜厚度可根据所希望的液体展开距离而变化，优选5-130μm，更优选30-100μm，更优选50-90μm。如果与上述范围相比，试剂层的厚度太小，则液体的展开不能充分进行，进而妨碍了被检物质的准确检测或测量，而如果与上述范围相比，试剂层的厚度太大，则需使用大量样品检测被检物质。
对上述底层的形状或材料没有特殊的限制，只要它能够支持上述试剂层。然而，优选所述底层的表面具有亲水区域，并在此亲水区域上支持试剂层。由于这个原因，在将样品点样到试剂层后，上述亲水区域会对液体的展开产生较大的影响。
所述液体由于其自身的重量而在试剂层的垂直方向展开，且由于毛细管作用而在试剂层的垂直方向和水平方向展开。另一方面，上述亲水区域对水具有良好的亲和性，可减弱液体的表面张力，其是水溶性的。因此，所述亲水区域作用于试剂层中的液体，使它在水平方向流动，亲水区域的这一作用可以向下倾斜的方向展开液体。亲水区域对水平方向的作用具有较大的应用区域，且仅在水平方向进行，因此其对液体在水平方向展开的帮助大于毛细管作用对液体在水平方向展开的帮助。因此，在通过测量透射光来测量全血中的被检物质时，可在试剂层的水平方向上，距离血细胞附着位置较远的位置检测被检物质，这是因为血细胞可能会干扰被检物质的检测；优选测量透射光。
优选所述底层具有一个亲水区域和一个疏水区域。所述亲水区域，当它以适宜的大小和形状(例如，多边形，方形，圆形，椭圆形，其组合的形状等)形成时，可制成大小适宜的试剂层，因此它是优选的。且，具有亲水区域和疏水区域的底层可通过对亲水材料进行疏水处理，例如用疏水物质如硅氧烷或油涂覆亲水材料或通过对疏水材料进行亲水处理而制成。
优选由透光物质制成的底层，这是因为它可通过测量透射光时发生的光学变化来检测被检物质。上述透光物质包括，例如，无机化合物如玻璃，有机聚合物如透明塑料等。
有机聚合物如透明的塑料，即使它们是疏水聚合物，也可通过紫外线辐射，用甲硅烷醇处理等，而对它们的表面进行亲水处理。通过进行这种亲水处理，透明塑料可被用作底层。这种有机聚合物的例子是，例如聚烯烃树脂如聚乙烯，聚丙烯和聚氟乙烯；聚苯乙烯；聚对一酸乙二酯等。
本发明的测试片可通过在上述底层上涂覆一种无机溶胶(一种无机胶凝剂分散在其中的胶体溶液)来制造，其具有均匀分散或溶解在其中的上述试剂，并具有以层形式均匀分散在其中的上述颗粒。上述颗粒可分散在无机溶胶中，或通过预先将无机胶凝剂的粉末与颗粒混合，并将水或水基分散介质加入到混合粉末中而分散在无机溶胶中，其中上述试剂是均匀分散或溶解的。且，可将上述试剂均匀分散或溶解在上述无机溶胶中，或在加入无机胶凝剂之前，将上述试剂预先均匀分散或溶解在水基分散介质中。
此外，还可通过通常所用的方法在底层上形成上述无机溶胶层。例如，可通过均匀涂敷并使用刮片等达到预定的厚度来成层。然而，优选在底层上提供一种预定形状的亲水区域，并根据亲水区域的面积，给亲水区域提供适量的无机溶胶，这是因为无机溶胶可在亲水区域上扩散，从而在底层上形成厚度均匀的试剂层。
所述试剂层可通过除去上述底层上的无机溶胶中的一部分水而形成，从而使无机凝胶粘合颗粒的性质不至变差。从无机溶胶中除去水的过程可通过在一定条件下干燥来完成，其可防止试剂变性，且不会妨碍被检物质的检测结果；干燥条件可根据试剂的种类而改变，例如，在25℃干燥，在40-50℃干燥，在减压条件下干燥，在低温条件下干燥(例如，5℃左右)，或在这些相结合的条件下干燥。在所用试剂易变性的条件下，通常优选在低温条件下干燥无机溶胶，从而抑制试剂变性。
本发明的测试片可通过将至少液体中含被检物质的样品点样在试剂层的适当位置上，并检测在试剂层中显色的被检物质与试剂间的反应，来检测被检物质。
所述样品，其是本发明测试片的测试对象，可以是仅由液体组成，不包括固体的样品，但更优选本发明的测试片用于分析既包括固体又包括液体的样品，这是因为它具有分离固体的能力，其可分离样品中的固体并检测液体中的被检物质。这种样品的例子是，血细胞作为固体，血浆作为液体的血液(全血)。且，除全血之外，本发明的测试片还可用于分析生物材料(生物样品)如尿，食品，药物，天然存在的痕量物质，工业化学物质，消耗的痕量物质等。
在这里，样品的其中一个实施例是全血，并说明了分析样品时，本发明测试片的状况。
因为本发明测试片的试剂层是由上述颗粒，上述无机凝胶，和上述试剂形成的一种多孔结构，因此将全血点在试剂层上时，可使血细胞保留在试剂层上，而血浆从点样的位置，在试剂层的水平方向上展开。在这种情况下，因为所述试剂层含有无机凝胶，因此点样在试剂层上的全血在试剂层上几乎不展开，且试剂层上的血细胞几乎不扩散。因此，可在展开至一定程度的位置上检测血浆中的被检物质，其中所述展开是从血细胞附着位置开始，在试剂层的水平方向上展开的，从而使测量光不会被血细胞遮挡，因此可通过测量透射光来测量被检物质。且，因为血细胞在试剂层上几乎不扩散，因此在试剂层上几乎不能形成血细胞层，且因为它是一种多孔结构，因此所述试剂层的氧渗透性非常好。因为血细胞在试剂层上几乎不扩散，且因为血浆在试剂层的水平方向上展开，因此所述试剂层在检测被检物质时所需的样品量小于上述多层测试片所需的样品量。
此外，因为在试剂层中，所述颗粒与无机凝胶粘合形成一种多孔结构，试剂层中的试剂，试剂和被检物质间的反应产物，倾向于被无机凝胶吸附，从而抑制试剂和反应产物进一步展开，因此可很容易地长久维持试剂层中它们的分布浓度。因此，可更准确地测量被检物质。
对本发明的被检物质没有特殊的限制，只要它是存在于上述液体中的，且能被上述试剂检测的物质；例如，上述样品中的被检物质可以是一种生物样品葡萄糖，胆固醇，乳酸，碱性磷酸酶等。所述液体可以是水溶性的或水不溶性的；通常，在很多情况下它是水溶性的，且在本发明中优选是水溶性的。
对检测上述被检物质的方法没有特殊的限制，只要它能检测上述试剂和被检物质之间的反应；例如，通过上述试剂与被检物质间的反应而产生的光学变化来检测被检物质的方法，通过上述试剂与被检物质间的反应而产生的电化学变化来检测被检物质的方法等。在检测被检物质的这些方法中，使用与被检物质定量反应的试剂不仅能检测被检物质，而且能通过测量光学变化，电化学变化等来量化被检物质。
在通过光学变化检测被检物质的方法中，可通过用由透光物质制成的底层，并通过测量透射光，反射光等来测量上述光学变化而检测被检物质。光学变化通常是指被检物质与上述试剂间的着色反应，不仅是着色，还可以是脱色，发荧光，发光等。且，在量化被检物质，例如，测量上述光学变化时，可利用通常所用的吸光计或荧光计或应用拉曼分光光度测定法。
通过上述电化学变化检测被检物质的方法包括一种利用氧化-还原反应的方法，一种当被检物质是离子时，利用从所述离子产生络合物的方法。
利用上述氧化-还原反应的方法包括，例如，使用通常所用的电极如碳电极，在上述电极能够进行测量的电位范围(在碳电极中，通常为-1.2V-+1.0V)内，还原或氧化通过氧化-还原反应产生的上述试剂的氧化形式或还原形式及被检物质，并在这种情况下测量电位，从而量化被检物质。上述氧化-还原反应可以是一种被检物质和试剂直接提供和接受电子的反应，或它们间接提供和接受电子的反应。
利用上述络合物的方法包括，例如，使用电极表面具有多孔聚合物层的液膜电极，用上述试剂浸渗液膜电极从而通过配价键或离子键选择性地将所述试剂与被检物质结合，使生成物迁移到聚合物层中，并测量产生的膜电位，然后量化被检物质。
附图简述

图1是表示按照本发明实施例1制造的测试片的图；图2是表示图1所示测试片的状态的图，其中将1μl全血点样在试剂层上；图3是表示图1所示测试片的状态的图，其中将0.5μl全血点样在试剂层上；图4是表示图1所示测试片的状态的图，其中将0.1μl全血点样在试剂层上。
优选实施方案的详述以下，提出本发明的实施例，从而更详细地说明本发明。在本发明的实施例中，将使用血液(全血)作为样品，使用血液中的葡萄糖(Glc)作为被检物质的测试片作为本发明的其中一个实施例进行说明。
<实施例1>
首先，对底层进行说明。在本发明的实施例中，使用了Milli-Q水，其是在Milli-Q Labo(由Nippon Millipore Co.，Ltd.生产)中通过处理蒸馏水而得到的。所述蒸馏水是通过使用纯净水生产设备Autostill WG 220型(由Yamato Scientific Co.，Ltd.生产)产生的。
首先，在用乙醇-Milli-Q水清洗透明的聚苯乙烯板并干燥后，在紫外线照射装置(PL16-110，光源低压水银灯110W，均由Sen Lights Co.生产)中，用紫外线照射1-30分钟(优选3分钟)，然后使上述透明的聚苯乙烯板的表面经过亲水处理，制成底层1。将底层1的亲水区域的形状制成葫芦形，其是通过将两个直径5mm的圆联结起来形成的。
接下来，说明试剂层的制造。
将无机胶凝剂Laponite XLG，Bis-Tris缓冲溶液(pH6.5)，POD(过氧化物酶)，GOD(葡萄糖氧化酶)，4-AA(4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮))，和TOOS(N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)，和胶乳颗粒OTG-2(平均粒径4.5μm)在Mili-Q水中混合，达到下列表1所述的那些终浓度，从而得到Laponite XLG的胶体溶液(溶胶)。
下列表1中的“U”是一种单位(U单位)，表示在30℃时，每分钟将1μmol底物转换成产物的酶活性的量。
表1(试剂配方A)试剂制造商 终浓度Raponite XLG Nippon Silica Industrial Co.，Ltd.0.5(重量％)Bis-Tris Dojindo Laboratories Co.，Ltd.0.5mmol/LPOD Toyobo Co.，Ltd. 7.5×103U/LGOD Toyobo Co.，Ltd. 25×103U/L4-AA Dojindo Laboratories Co.，Ltd.7.5μmol/LTOOS Dojindo Laboratories Co.，Ltd.7.5μmol/LOTG-2(4.5μm)Nippon Paint Co.，Ltd.12.5(重量％)将通过上述操作获得的无机溶胶点样在通过上述操作获得的底层1的亲水区域上，4℃时干燥1小时，从而制造出图1所示的试剂层2。
接下来，对用上述操作获得的测试片检测血液中的葡萄糖进行说明。
在各测试片的试剂层2的葫芦形的顶端分别点样1，0.5或0.1μl的新鲜全血(指尖血)。图2-4表示将全血点样后，测试片的状态。
首先，讨论所得血浆的量，在点样1μl和0.5μl时，如图2和3所示，在5秒钟内，血浆的量足以湿润直径5mm的试剂层2。在点样0.1μl时，如图4所示，血浆的量可湿润大约2/3的，直径5mm的试剂层2。在点样1μl时，可观察到，有很多血细胞和血浆仍然停留在全血的点样位置上。
然后，讨论对葡萄糖的反应，血浆湿润的部分显淡红色，这足以通过目测法加以证实。这主要是TOOS的颜色(λmax＝555nm)。
从上所述可知，本发明的测试片可通过点样极小量的全血来检测血浆中的葡萄糖。且，本发明的测试片可按照上面所述很简单地制造。
<实施例2>
接下来，除了固定raponite XLG和其它试剂的量，并按照下列表2改变所用颗粒的量外，按照与实施例1相同的方式制造具有不同试剂层厚度的测试片，并测量预期的试剂层厚度。预期的厚度是通过在SEM上观察试剂层的截面并计算而得到的膜厚度(μm)。
在具有不同试剂层厚度的各个测试片上点样全血，并测量血浆的迁移距离。所述迁移距离是在点样全血5秒内，所分离的血浆从点样位置到顶部的迁移距离(mm)。
表2

由表2可知，试剂层的厚度根据所用颗粒的量而变化，且在具有较大厚度的试剂层中，血浆的迁移距离更大。
<实施例3>
接下来，除使用下列表3所述终浓度的各试剂外，按照与实施例1相同的方式制造测试片。按照与上述实施例2相同的方式，测量各测试片中试剂层的预期厚度，并将全血点样在试剂层上，接着测量血浆在这种情况下的迁移距离。表3表示各测试片的试剂配方，表4表示预期的迁移距离和厚度的测量结果。
表3(试剂配方B，C)

表4

由表3和4可知，如果pH保持不变，血浆的迁移距离取决于所用颗粒的量，即试剂层的厚度，即使试剂的使用量变得更大或更小。
<实施例4>
接下来，除了使用下列表5所述终浓度的各试剂外，按照与上述实施例1相同的方式制造测试片。在本实施例中，使用了具有不同粒径(4.5μm和6.6μm)的颗粒。按照与上述实施例2相同的方式，将全血点样在各测试片的试剂层上，接着测量血浆在这种情况下的迁移距离。表5表示各测试片的试剂配方，表6表示预期的迁移距离和厚度的测量结果。
表5(试剂配方D，E)

表6

由表5和6可知，如果pH保持不变，即使颗粒的粒径变大或变小，血浆的迁移距离也不会改变。由于pH改变所造成的血浆迁移距离的改变证实了所分离血细胞状态的改变与pH的改变有关；例如，由于血细胞收缩，血细胞迁移至试剂层更里的部分，从而使血浆在试剂层中的流动性降低。
<对照实施例>
除了用HPC-M(羟乙基丙基纤维素由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd生产)，其是一种有机胶凝剂，使用时的终浓度为2重量％，代替rapomteXLG外，按照与实施例1相同的方式制造试剂层和测试片。将新鲜的全血(指尖血)点样在所得测试片的试剂层上，但血浆没有渗透到试剂层中，且所点的全血没有分离。
工业实用性按照本发明，有一种测试片，其可通过在底层上形成的试剂层来检测样品中的被检物质，其中所述样品包含固体和液体，而被检物质则包含在液体中，且所述试剂层是由颗粒和无机凝胶形成的，所述试剂层可捕获固体从而分离固体和液体，且该试剂层还包括一种试剂，该试剂可引起液体中被检物质的可检测反应，按照本发明，该测试片是通过测量透射光来测量被检物质的，其具有良好的氧渗透性，能够非常准确地测量被检物质。
权利要求
1.一种测试片，其具有分离含固体和液体的样品中的固体，从而检测包含在液体中的被检物质的能力，该测试片具有多孔结构的试剂层及支持该试剂层的底层，其中该多孔结构的试剂层含有颗粒，无机凝胶，和与被检物质发生可检测反应的试剂，其中所述颗粒与所述无机凝胶彼此粘合，使颗粒之间形成空隙，从而捕获固体成分。
2.根据权利要求1所述的测试片，其中所述样品是包含血细胞和血浆的血液。
3.根据权利要求1所述的测试片，其中所述底层的表面具有亲水区域，且所述亲水区域支持所述试剂层。
4.根据权利要求1所述的测试片，其中所述颗粒的粒径为0.5-10μm，颗粒的终浓度为1-30重量％。
5.根据权利要求1所述的测试片，其中形成无机凝胶的无机胶凝剂的终浓度为0.1-3重量％。
6.根据权利要求1所述的测试片，其中所述试剂是一种通过与被检物质反应而引起光学变化的试剂。
7.根据权利要求1所述的测试片，其中所述底层是由透光物质制成的。
全文摘要
一种具有分离固体成分能力的试片，其特征在于它包括多孔试剂层及该试剂层的支持物，所述多孔试剂层含有颗粒，无机凝胶，和与被检物质发生可检测反应的试剂，其中所述颗粒通过所述无机凝胶彼此粘合，使颗粒之间形成空隙从而捕获固体成分。因此，该试片可用于分离全血中的血细胞成分，其中所述全血含有血细胞成分和血浆成分，该试片还可用于检测被检物质，如包含在血浆成分中的葡萄糖。使用所述试片，利用透射光，可测量被检物质，且该试片显示出良好的氧渗透性，因而可更准确地测量被检物质。
文档编号G01N33/52GK1429339SQ01809552
公开日2003年7月9日 申请日期2001年3月15日 优先权日2000年3月15日
发明者平井香, 米原聪 申请人:阿克雷株式会社