专利名称：一种微囊藻毒素的提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及从微囊藻中提取纯化毒素的方法。
目前，毒素纯品研制的主要途径是采用联用多步纯化技术，涉及色谱技术，制备或半制备型液相色谱、快速色谱，这二项技术可浓缩和分离纯化微囊藻毒素，其不足之处在于，纯度不高，无法满足标准样品的要求；制备或半制备型分子排阻色谱、离子交换色谱，薄层色谱，这三项技术的不足之处在于，其只适于微克级微囊藻毒素的制备，且耗时长，产率低。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，该方案按下列步骤顺序进行A、取微囊藻干粉，加入其重量30-40倍的5％乙酸溶液，搅拌40分钟，6000转/分钟离心10分钟，取上清液；B、滤渣中加入其重量3-5倍的100％甲醇，搅拌40分钟，6000转/分钟离心10分钟，取上清液；C、重复两次步骤B；D、合并步骤B和步骤C三次提取的上清液，蒸发浓缩；E、将步骤D的浓缩液与步骤A的上清液混合，依次过1微米，0.45微米两个微滤器；再将混合液过截留分子量为6000的中空纤维超滤器；F、先、后用100％甲醇和纯水冲洗C18柱，将经过步骤E处理的混合液过C18柱，再用20％甲醇清洗，然后以90％甲醇10毫升洗脱下毒素，蒸发浓缩，得到粗毒素干粉；G、将粗毒素干粉溶于其重量10-20倍的60％甲醇中，取10微升加入制备型高效液相色谱，以标样峰值的保留时间来收集微囊藻毒素；H、两种毒素分别均匀点在薄层层析板的下端，将层析板放入距毒素点滴10-15毫米展开溶剂中进行展开；I、两小时后将层析板取出晾干，用紫外灯照射，取下中间一条色带的硅胶；J、将硅胶放入洗脱液中浸泡、搅拌5-15分钟；K、浸泡液过滤、去残渣，将过滤液用其重量8-12倍的纯水稀释，过PS-II柱，滤去C18；L、先以10-20毫升纯水冲洗PS-II柱，再以8-12毫升100％甲醇洗脱，洗脱液蒸发干燥，即得含量大于90％的微囊藻毒素。
步骤H所述的展开溶剂为体积比是CHCl3∶CH3OH∶H2O＝6∶4∶1的混合液。
步骤J所述的洗脱液为50mM pH＝3.0的磷酸缓冲溶液占洗脱液的20％、甲醇占洗脱液的80％。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果具有效率高，投资少，安全性高，纯度高，对环境无污染等优点，适于毫克级微囊藻毒素的制备，易于工业化生产。
权利要求
1.一种微囊藻毒素的提取纯化方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行A、取微囊藻干粉，加入其重量30-40倍的5％乙酸溶液，搅拌40分钟，用6000转/分钟离心10分钟，取上清液；B、滤渣中加入其重量3-5倍的100％甲醇，搅拌40分钟，用6000转/分钟离心10分钟，取上清液；C、重复两次步骤B；D、合并步骤B和步骤C三次提取的上清液，蒸发浓缩；E、将步骤D的浓缩液与步骤A的上清液混合，依次过1微米，0.45微米两个微滤器；再将混合液过截留分子量为6000的中空纤维超滤器；F、先、后用100％甲醇和纯水冲洗C18柱，将经过步骤E处理的混合液过C18柱，再用20％甲醇清洗，然后以90％甲醇10毫升洗脱下毒素，蒸发浓缩，得到粗毒素干粉；G、将粗毒素干粉溶于粗毒素干粉重量10-20倍的60％甲醇中，取10微升加入制备型高效液相色谱，以标样峰值的保留时间来收集微囊藻毒素；H、两种毒素分别均匀点在薄层层析板的下端，将层析板放入距毒素点滴10-15毫米展开溶剂中进行展开；I、两小时后将层析板取出晾干，用紫外灯照射，取下中间一条色带的硅胶；J、将硅胶放入洗脱液中浸泡、搅拌5-15分钟；K、浸泡液过滤、去残渣，将过滤液用其重量8-12倍的纯水稀释，过PS-II柱，滤去C18；L、先以10-20毫升纯水冲洗PS-II柱，再以8-12毫升100％甲醇洗脱，洗脱液蒸发干燥，即得含量大于90％的微囊藻毒素。
2.根据权利要求1所述的一种微囊藻毒素的提取纯化方法，其特征在于，所述的展开溶剂为体积比是CHCl3∶CH3OH∶H2O＝6∶4∶1的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种微囊藻毒素的提取纯化方法，其特征在于，所述的洗脱液为50mM pH＝3.0的磷酸缓冲溶液占洗脱液的20％、甲醇占洗脱液的80％。
全文摘要
本发明公开了一种微囊藻毒素的提取纯化方法，该方法用乙酸溶液和甲醇浸泡微囊藻，经除杂质、粗毒素的制备、毒素的分离、薄层层析技术等步骤提取和纯化微囊藻毒素。本发明具有效率高，投资少，安全性高，纯度高，对环境无污染等优点，适于毫克级微囊藻毒素的制备，易于工业化生产，所得微囊藻毒素的纯度经HPLC－UV/DAD检测≥90％，可做标准样品。
文档编号G01N1/28GK1401660SQ0213909
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月24日 优先权日2002年9月24日
发明者宋立荣, 沈强, 陈伟, 甘南琴, 何振荣, 刘永定, 雷腊梅 申请人:中国科学院水生生物研究所