专利名称：圆海链藻的检测探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组藻类检测的寡核苷酸探针，具体地说是针对圆海链藻定性与定量检测的特异性探针。属于核酸检测领域。
背景技术：
圆海链藻(Thalassiosira rotula)是一种温带浮游性的种类，在我国的黄海、东海和南海均有分布，是东海主要的赤潮生物之一，有多次形成大面积赤潮的纪录，给海洋渔业和海水养殖造成一定的影响。因此，及时、准确、快速地检测海洋环境中圆海链藻的种群动态，随时了解其在海洋中的数量变化具有重要意义。传统的利用光学显微镜直接观察和计数的鉴别方法，过程烦琐、费时、费力，并需要有经验的分类专家参与其中。当样品量多，生物多样性丰富，监测范围广时工作量极大，因此主要用于藻的定性和分离，而不适用于藻的定量与大范围监测研究。所以，发展用于快速、准确检测圆海链藻的新方法和新技术极具现实意义。但是，目前国际国内关于这方面的研究进展不大，尚未形成非常有效的对该藻进行定性和定量检测的成熟技术。由于rRNA被认为是与藻类的系统进化密切相关的序列，而且真核生物细胞中rRNA含量非常高，可以达到106～107个拷贝，rRNA是夹心杂交的很好的靶点。
经对现有技术文献的检索发现，Christopher A.Scholin等在《利用rRNA在全细胞和“三明治”杂交中识别南方菱形藻》(美国《藻类学杂志》，1996，35(3)，190～197)一文中将提取的RNA或者藻细胞裂解液在一定条件下与结合在96孔板上的寡核苷酸探针杂交后，再用一标记的信号探针与之杂交，最后进行酶标抗体显色反应，取得了较满意的结果。该技术现在海洋藻类的监测中已经有所应用。但到目前为止，应用该技术能够检测的微藻只限于有限的几种(其中包括了圆海链藻)。其主要缺点是一，因捕获探针的长度仅10～30bp，因此能够有效区别亲缘关系较近的微藻的捕获探针数量极少；二，在整个检测过程中都需要防止RNA降解，然而洗涤、抗体反应等各步骤极易造成RNA降解，因此操作难度大、检测结果波动性大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组针对圆海链藻rRNA的特异性的圆海链藻的检测探针，依据这组探针对该藻进行S1酶保护分析和夹心杂交检测，实现对该藻的快速定性和定量。
本发明用于对该藻进行S1酶保护分析和夹心杂交检测，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针，所述的S1酶保护分析探针，是指与圆海链藻rRNA互补而且用于S1酶保护分析方法的寡核苷酸探针，所述的抓捕探针，是指与S1酶保护分析探针的一端结合，这一端通常为3’端，另外一端标记有生物素，从而将经过S1酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的S1酶保护分析探针捕获下来的探针，所述的信号探针或者连接探针能够在抓捕探针捕获S1酶保护分析探针后，结合于S1酶保护分析探针的另一端的的探针为连接探针，同时该探针标记有可检测信号，或者在一端具有信号探针结合区，能够与通用信号探针互补。
S1酶保护分析探针在进行生物信息学比对分析时，仅与圆海链藻核糖体小亚基1670～1740区域核苷酸互补，而与其它藻核糖体RNA无同源性，长度为59bp，在一定的条件下可特异性结合于圆海链藻的rRNA上，序列为5’-GGACAAGTTCTCGCGGTCAGGCCCCAATGAAGGAGCCAAGCCACAATCCCGAGTCCTCA。通过测定圆海链藻的rRNA序列，进行多序列比较，寻找圆海链藻的特征序列，作为该藻的rRNA特异区域，然后根据该rRNA特异区域序列(特征序列)设计S1酶保护分析探针。寻找生物特异性区域的方法以及根据特异区域设计探针都采用现有技术。已有的实验表明，不同藻rRNA之间若存在2～3个以上核苷酸的连续错配或者缺失就可以作为特异探针设计的靶序列。
抓捕探针特异性结合于S1酶保护分析探针一端，长度为22bp，序列特征为5’-TGAGGACTCGGGATTGTGGCTT，在5’端标记有生物素、磷酸基团，或者氨基基团以及其他任何可以用来标记可以用于固定于固体基质的标记。
信号探针或者连接探针在一端与S1酶保护分析探针互补，而在另一端具有通用信号探针互补区，与通用信号探针互补结合，长度为22bp，序列为5’-GCCTGACCGCGAGAACTTGTCC；该序列上标记各种检测的信号，具体包括荧光素、地高辛、生物素用于信号检测的序列，或者与通用的信号探针互补的一段序列。
通用信号探针与连接探针的一端(不同于与S1酶保护分析探针互补结合的一端)互补。常用的标记物包括(但并不限于)地高辛、荧光素、生物素或者辣根过氧化物酶等。
简而言之，本发明是针对圆海链藻的rRNA特定区域合成以S1酶保护分析探针为核心的一组探针，联合S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对圆海链藻rRNA的定性定量检测。
本发明的这组探针可用于以S1酶保护分析和夹心杂交技术检测样品中是否存在圆海链藻及其数量，所述的检测过程包括下列步骤(a)待检测样品和S1酶保护分析探针的混合在该步骤中，可以将经裂解处理已释放出rRNA的待检测的微藻样品与S1酶保护分析探针混合。也可以将待检测的微藻样品与S1酶保护分析探针直接混合，然后再进行裂解处理，从而释放rRNA。一旦释放出的rRNA包含对应于S1酶保护分析探针的靶序列，经过杂交，则会与S1酶保护分析探针形成双链。
(b)S1酶处理当S1酶保护分析探针与待检测生物的rRNA杂交后，用适当浓度(通常为0.5U～2U/μl，较佳地为1U/μl)的S1酶消化过量游离的探针；当该探针与其他非目标rRNA反应时，由于杂交体存在切口或小缺口，S1酶亦能将该探针切断；最终保留下与完全匹配的S1酶保护分析探针和圆海链藻的rRNA形成的DNA/RNA双链，而且该双链的量代表了样本中相应的rRNA的量。
(c)DNA-RNA杂合体的变性将DNA/RNA双链杂合体变性为DNA单链(即S1酶保护分析探针)和RNA单链。合适的变性方法没有特别限制，可以用本领域常用的各种变性方法，例如热变性等。例如，加入中和溶液后加热，使S1酶保护分析探针和目标生物的rRNA形成的杂合体变性，从而释放出保留下来的S1酶保护分析探针。由于RNA不稳定，解链形成的RNA单链易被内源或外源的RNA酶降解。
(d)捕获S1酶保护分析探针将保留有S1酶保护分析探针的溶液与预先固定于固相载体上的抓捕探针杂交，将S1酶保护分析探针特异地抓捕在固相载体上，并洗涤除去非特异的结合。
(e)结合带可检测信号的探针用连接探针与被捕获的S1酶保护分析探针杂交，并洗涤除去非特异的结合，再用信号探针与连接探针结合，并洗涤除去非特异的结合。
(f)信号检测可用本领域常规方法对可检测信号进行信号检测。例如信号探针上可以标记上荧光信号，这样通过激发荧光来读取数据；也可以在信号探针上标记上地高辛、荧光素或者生物素等，然后通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体或者亲和素与之反应；最后加入发光底物或者显色底物(TMB或者NPP等)，通过探测发光强弱或者吸光度来判读信号。
本发明的主要优点在于(1)探针适用性好夹心杂交特异识别的关键是抓捕探针的特异性，一般情况抓捕探针约长20～30核苷酸，该探针要具有特异性，必须与其他非目标生物的rRNA分子要有较大的差异，尽管不同生物的rRNA在进化上会有差异，但在找到并成功验证亲缘关系较近的生物之间的特异性探针并不是一件容易的事，这可能也是夹心杂交技术发展到现在只有找到很少量抓捕探针的原因之一。本发明中涉及的S1酶保护分析探针，尽管长度在60个核苷酸左右，但并不要求探针全长都要有特异性，而只要求探针的中间区域有几个核苷酸的差异即可，这大大方便了特异探针的寻找和实现。
(2)稳定性高夹心杂交技术成功执行的关键之一在于保证RNA分子在整个过程不被降解，特别要保证抓捕探针与信号探针之间的那段目标RNA分子(可能在几十到几百个核苷酸之间)在整个实验过程的完好无损。但由于实验过程涉及抗原抗体反应和多次洗涤步骤，这为RNA酶对RNA分子降解提供了较多机会，因此要保证目标RNA分子不被降解有非常大的难度。即使最终能够实现定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本发明中直接与rRNA分子相关的过程只有S1酶保护分析探针与rRNA分子杂交这一步，只要杂交裂解液加入适当的RNA酶抑制剂就能保证杂交时rRNA分子不被降解或很少被降解，实验操作的其他步骤都是针对稳定的DNA分子进行的，相对比较容易执行。因此本发明的稳定性远远高于夹心杂交技术。
图1是圆海链藻的检测探针用来探测各种不同藻的示意图。
图2是对不同细胞数的圆海链藻的检测曲线示意图。
具体实施例方式
下面结合附图，在具体实施例进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例应用针对rRNA的S1酶保护分析和夹心杂交技术对圆海链藻定性定量检测。
在本实施例中，将S1酶保护分析技术和夹心杂交技术联合用来实现对海洋赤潮生物圆海链藻(Thalassiosira rotula)的定性和定量检测，步骤如下1.1圆海链藻rRNA特异区域的寻找和S1酶保护分析探针的设计与合成通过测定圆海链藻核糖体小亚基18S rRNA序列并与其它藻类的rRNA序列进行多序列比较，找到其在小亚基rRNA的1670～1740区域与其它藻类不同，确定该区域序列为特征序列；根据特征序列设计和合成S1酶保护分析探针THA_S15’-GGACAAGTTCTCGCGGTCAGGCCCCAATGAAGGAGCCAAGCCACAATCCCGAGTCCTCA(SEQ ID NO.1)。
根据S1酶保护分析探针设计和合成夹心杂交所需的其他探针抓捕探针THA_CAPT5’-Biotin-TGAGGACTCGGGATTGTGGCTT(SEQ ID NO.2)，与S1酶保护分析探针的3’端互补，在5’端有生物素(Biotin)标记；连接探针THA_LINK5’-GCCTGACCGCGAGAACTTGTCCTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG(SEQ IDNO.3)，在5’端的22个核苷酸与S1酶保护分析探针的5’端互补，在3’端的32个核苷酸与通用信号探针的5’端互补。
1.2抓捕探针固定于酶标板抓捕探针的固定方法在预先包被有亲和素的酶标板(Pierce公司)的每一孔中加入100μl溶解于碳酸盐缓冲液CBS(pH7.2)的40nM抓捕探针，37℃静置2小时。用磷酸盐缓冲液PBS洗三次备用。
1.3 S1酶保护分析将用f2培养基培养的海藻样品计数后，离心收集于1.5ml塑料管中，弃去上清，加入浓度为50nM S1酶保护分析探针的1000μl裂解液(0.8％十二烷基磺酸钠SDS，1.2M尿素，20％甲酰胺，0.3M氯化钠，50mM三羟甲基氨基甲烷，pH7.0)。
进行圆海链藻的特异性验证时，将塔玛亚历山大藻、角毛藻、中肋骨条藻、共生藻、新月菱形藻、锥状斯氏藻、棕囊藻、诺氏海链藻、海洋原甲藻、直链藻、微型原甲藻等各约106个细胞分别进行上述处理。
进行圆海链藻的检测曲线分析时，将过滤收集到的圆海链藻样品用含有S1酶保护分析探针的裂解液10倍逐级稀释6次共获得7个样品。
对于海藻样品和S1酶保护分析探针的混合物，超声波处理两分钟，将混合溶液在95℃放置10分钟，然后70℃杂交2小时。自然冷却后加入500μl含有800U S1酶(Promega公司)的S1酶解缓冲液(50mM硫酸锌，500mM醋酸钠，50mM氯化钠pH4.5)，在50℃酶切处理30分钟。
1.4 DNA-RNA杂合体的变性加入250μl变性缓冲液(1.5M氢氧化钠，300mM EDTA)，95℃处理10分钟，自然冷却后用于夹心杂交。此时DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA(即曾结合于靶序列的S1酶保护分析探针)和单链RNA。与此同时，单链RNA被降解，因此溶液中仅含曾结合于靶序列的S1酶保护分析探针。
1.5夹心杂交抓捕将100μl上述变性后的反应混合液分别移入到预固定有抓捕探针的酶标板微孔中，50℃杂交1小时，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤液洗6次。
夹心杂交每孔加入含有100μl 5nM连接探针的杂交缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)，于50℃杂交30分钟，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤液洗6次；每孔加入含有100ul 5nM信号探针的杂交缓冲液(2×SSC，0.5％SDS)于50℃杂交30分钟，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤液洗6次。
1.6信号检测酶标板用磷酸缓冲液(PBS)洗6次；每孔加入含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体(购自Roche公司)，37℃孵育30分钟，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB(购自Pierce公司)显色液100μl，37℃处理15分钟后，每孔加入50μl 2M硫酸终止反应。将酶标板置于读板机上于450nm测定光吸收值。
1.7结果检测结果如图1和图2所示。
图1显示了用针对圆海链藻的探针探测各种不同的藻的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。
对数据用常规统计方法进行拟合，获得如下关系y＝0.0007x-0.0229
R2＝0.9988；x为样品中圆海链藻的细胞数，y为实际测定的OD.450，R2为相关系数。
下表列出了用本实施例方法测定的圆海链藻样品数量与显微计数结果的比较
序列表<110>中国海洋大学<120>圆海链藻的检测探针<160>3<210>1<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>圆海链藻rRNA序列的互补碱基序列。
<400>1ggacaagttc tcgcggtcag gccccaatga aggagccaag ccacaatccc gagtcctca 59<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’端标记有生物素、磷酸基团，或者氨基基团。
<400>2tgaggactcg ggattgtggc tt 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’端可标记地高辛、荧光素、生物素或者辣根过氧化物酶等。
<400>3gcctgaccgc gagaacttgt cc 2权利要求
1.一种圆海链藻的检测探针，其特征在于，用于对该藻进行S1酶保护分析和夹心杂交检测，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针，所述的S1酶保护分析探针，是指与圆海链藻rRNA互补而且用于S1酶保护分析方法的寡核苷酸探针，所述的抓捕探针，是指与S1酶保护分析探针的一端结合，这一端通常为3’端，另外一端标记有生物素，从而将经过S1酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的S1酶保护分析探针捕获下来的探针，所述的信号探针或者连接探针能够在抓捕探针捕获S1酶保护分析探针后，结合于S1酶保护分析探针的另一端的的探针为连接探针，同时该探针标记有可检测信号，或者在一端具有信号探针结合区，能够与通用信号探针互补。
2.根据权利要求1所述的圆海链藻的检测探针，其特征是，所述的圆海链藻rRNA之间若存在2～3个以上核苷酸的连续错配或者缺失可作为特异探针设计的靶序列。
3.根据权利要求1所述的圆海链藻的检测探针，其特征是，所述的S1酶保护分析探针，在进行生物信息学比对分析时，仅与仅与圆海链藻核糖体小亚基1670～1740区域核苷酸互补，而与其它藻核糖体RNA无同源性，长度为59bp，在一定的条件下可特异性结合于圆海链藻的rRNA上，序列为5’-GGACAAGTTCTCGCGGTCAGGCCCCAATGAAGGAGCCAAGCCACAATCCCGAGTCCTCA。
4.根据权利要求1所述的圆海链藻的检测探针，其特征是，所述的抓捕探针特异性结合于S1酶保护分析探针一端，长度为22bp，序列特征为5’-TGAGGACTCGGGATTGTGGCTT，在5’端标记有生物素、磷酸基团，或者氨基基团以及其他任何可用来标记的用于固定于固体基质的标记。
5.根据权利要求1所述的圆海链藻的检测探针，其特征是，所述的信号探针或者连接探针在另一端具有通用信号探针互补区，与通用信号探针互补结合，序列为5’-GCCTGACCGCGAGAACTTGTCC；该序列上标记各种检测的信号，具体包括荧光素、地高辛、生物素用于信号检测的序列，或者与通用的信号探针互补的一段序列。
全文摘要
本发明公开了一种圆海链藻的检测探针，属于核酸检测领域。具体针对圆海链藻的rRNA特定区域合成以S1酶保护分析探针为核心的一组探针，联合S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对圆海链藻rRNA的定性定量检测。所述检测探针包括三条相互关联的寡核苷酸探针S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针。本发明探针适用性好，大大方便了特异探针的寻找和实现。本发明的稳定性远远高于夹心杂交技术。
文档编号G01N33/50GK1624476SQ20041007553
公开日2005年6月8日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者于志刚, 李荣秀, 蔡青松, 米铁柱, 甄毓 申请人:中国海洋大学