专利名称：发色单元的载体装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及发色单元的载体装置，该装置就是通常被称为“生物芯片”的那种装置。
背景技术：
这种装置包括一般由多层基片构成的载体，基片有一个表面载运化学或生物分子的发色单元，或是附于或融合到化学或生物分子的染料，或是诸如固定在该类分子上的量子箱或线等半导体纳米结构，当被适当的光激发时，这类发色单元发射荧光，荧光的波长与它们的性质有关，在载体上，借助这种荧光的检测，可以对已经对给定处理作出反应的分子进行识别并定位。
已经提出一些装置，特别是在以本发明人相同名义提出的申请WO-A-02/516912、FR 01/15140、和FR 02/10285中，为了增加光激发和荧光发射的效率，例如，通过增强激发强度和/或发射荧光强度的竖直结构、通过凭借反射镜产生的干涉效应。无论如何，在被收集器和测量装置拾取的光中，仍然需要把载体反射的任何激发光，从发射的荧光中分离，并为此目的使用二色性的或吸收滤波器，但是，这种分离是困难的，激发光没有完全被剔除。
二色性滤波器对剔除激发光有高的水准，约在50分贝(dB)到90dB的量级，即10-5到10-9分之一。当发射的荧光强度低时，即当它比激发光弱10-5到10-9倍时，被载体反射的激发光成为颇大的背景，阻挠弱信号的检测，并妨碍高信噪比的获得。
空气/玻璃界面上的反射，对入射角离法向达到约20°时，通常是4％。在这个范围之外，它作为角度的函数和作为光偏振的函数增加或减小。当载体是有平行表面的透明薄板时，与载运发色单元表面相对的板表面对激发光的反射，有相当的强度(96％的4％，即3.84％)，因而也是麻烦的。
当在载体相对大的面积上使用直接成像时，两种反射强度同时起作用，使反射总计达8％，这是绝不能忽略的。
当使用在激发波长上有高反射率的载体时，反射率最大，并接近100％。
无论如何，有利的做法是，使载体在发射的荧光波长上是反射的，因为该反射可以使被拾取的荧光发射强度乘以2(在几何光学的情形)或约乘以4(在波动光学的情形)。
发明内容
本发明的一个具体目的，是提供解决该问题的一种方案，该方案是简单的、有效的、和不昂贵的，可以使载体对激发光的反射被消除，或至少缩减，同时保留反射发射的荧光所得到的优点。
为此，本发明提供一种发色单元的载体，这些单元供激发光照射，以便以不同于激发光的波长发射荧光，该载体包括至少一层反射发色单元发射的荧光的内部材料层，和至少一种用于消除或起码显著缩减激发光的反射的装置，所述装置从如下一组中选出·吸收激发光的材料层，所述层的厚度，要使所述厚度与它在激发波长上的吸收系数αe的乘积远大于1，或者是已知的并被控制在约0.1到10范围的值；·至少一层在激发波长上构成抗反射层的透明材料层，形成在载体的至少一个表面，并有接近载体折射率平方根的折射率n′，且其厚度等于λe/4n′cosθ的奇数倍，这里λe是激发波长，而θ是激发光线在所述抗反射层中的角度；和·定义微腔的电介质和/或金属层，借助已定义的该腔的模，消除对激发光的反射。
在本发明的载体中，向着收集发色单元荧光装置反射的激发光，被极大地降低，甚至被消除，并增加荧光的强度，因而使所述荧光的检测及测量容易得多。
按照本发明的另一个特征，是在载体的与载运发色单元表面相对的表面上，形成该吸收层和至少一层上述抗反射层。
当载体在激发波长上是透明时，这样能使载体在载体的与载运发色单元表面相对的表面上，消除所述波长上的反射。
按照本发明的另一个特征，是在载体接受发色单元的表面上，形成该吸收层和至少一层上述抗反射层。因而，当载体是由激发波长上透明的材料制成时，消除了所述波长被载运发色单元的载体表面的反射。
在这样的情况下，该吸收层形成在载体的上表面，而该抗反射层形成在吸收层上。
在本发明的一个实施例中，反射发色单元发射的荧光的内部材料层，位于离载运发色单元的载体表面的距离是d，这里d远大于量值λf.n/2NA2，λf是发射的荧光波长，n是载体的折射率，而NA是收集发射的荧光的光学装置数值孔径，且上述抗反射层，形成在接受发色单元的载体表面上。
这个非常简单的实施例，可以从反射发射的荧光(使能够拾取的强度加倍)所得到的优点获益，同时避免结合在载体中的反射层反射激发光的缺点。
有利的做法是，在载体中的抗反射层与反射发射的荧光的内部层之间，形成上述类型的吸收层。
按照本发明的另一个特征，反射的内部层可以由多层电介质层构成，且能在激发波长上对激发光在载体的入射角，实现基本零的反射率。
为此，反射的内部层，可以由光学厚度等于激发波的四分之一波长的叠层形成，且折射率在高与低之间交替，中央层的厚度加倍或不同。该叠层形成对称的Fabry-Perot腔，亦称微腔。
在该叠层中，使用的反射极小的波长、角度、和偏振，由形成腔的层的厚度确定。
本实施例中，有利的做法是，在载体中反射的内部层和载体的与用于载运发色单元表面相对的表面之间，形成上面指出类型的吸收层。
在本发明的另一个实施例中，反射发射的荧光的材料的内部层，位于离载运发色单元的载体表面的距离，小于量值λf.n/2NA2，而上面指出的吸收层，形成在所述反射的内部层与用于载运发色单元的载体表面之间。
在本实施例中，反射材料的内部层，可以是金属或电介质层，或者，它可以是多层电介质层。
在本发明的另一个实施例中，载体包括两层反射发射的荧光的材料，这两层形成非对称的Fabry-Perot腔，并位于离载运发色单元的载体表面的距离，小于量值λf.n/2NA2，且上述吸收层位于这两层反射层和载体的与载运发色单元表面相对的表面之间。
在本实施例中，发色单元可以由这些反射材料层之一，在Fabry-Perot腔之外载运。
在本发明的另一个实施例中，载体有第一层反射发射的荧光的材料层，位于离用于载运发色单元的载体表面一定距离，这里所述距离小于量值λf.n/2NA2；第二层反射材料层，覆盖用于载运发色单元的载体表面，且位于离第一层反射层的距离，小于量值λf.n/2NA2；以及上面指出的吸收层，位于第一反射材料层和载体的与用于载运发色单元表面相对的表面之间。
在本实施例中，发色单元在两层反射材料层之间，并能借助已知手段如穿过多孔材料，或借助向外开孔进入空的平面腔中的微通道，插入这两层之间，该空的平面腔，是通过对为此目的提供的叠层进行牺牲蚀刻而形成的。
当载体用于载运不同类型的发色单元时，本发明同样可以使用，这些不同类型的发色单元当被合适的不同波长激发时，发射不同波长的荧光。
那么，上面指出的吸收层有不同的与激发波长对应的吸收带，并可以为此目的用单一合适的配料形成，要不然用有不同吸收带的配料混合物形成。同样，上面指出的抗反射层，可以由对各种激发波长给出低反射的叠层形成。同样可能的是，使用单一抗反射层，其折射率接近载体材料折射率的平方根，而其厚度的确定，要使在彼此比较接近的两个激发波长之间的波长上有反射极小，该反射极小的频谱宽度，通常在可见光谱中，大于100纳米(nm)，因此能够确定该层的厚度，例如，当使用532nm和633nm的激发波长时，该层的厚度对应于中心在580nm的反射极小。
一般地说，本发明能够在生物芯片型装置中，对检测和测量发色单元发射的荧光的光传感器，显著增加信噪比和使背景信号降至最小。
在阅读下面作为例子并参照附图所作说明后，将对本发明及本发明的其他特征、细节、和优点，有更深刻的了解，其中图1至3是本发明载体各个实施例的大尺度的示意断面图；图4是曲线，对图3的载体画出光反射如何作为波长函数而变化；和图5、6、和7是示意断面图，画出本发明其他变化的实施例。
具体实施例方式
图1中，参考数字10是本发明载体在整个说明中的参考数字，在本实施例中，本发明的载体基本由折射率n的材料板构成，上表面用于载运如上所述的发色单元12，例如化学的或生物的分子，且这些分子被固定在载体10的上表面的阵列中。
这些发色单元12被激发光14照射，激发光14一般是单色光或窄频谱的光，可能是偏振的(激光)，并有精确定义的入射角，该角常常基本垂直于载体10表面，这些发色单元12作为响应，发射波长与发色单元12的性质有关的荧光16，这些波长比激发光14的波长更长。
发色单元12发射的荧光强度，与激发光14的强度比较，是非常弱的。
实际上，必需照射相对大量的发色单元，以获得可用的光信号16。因此，特别有利的做法是，增强发色单元12发射的荧光16的回收率，和在检测与测量装置拾取的信号中降低噪声及激发信号，该检测与测量装置一般置于发色单元12之上，且光轴垂直于载体10的上表面伸延。
为此目的，本发明提出降低、如有可能则消除载体10对激发光14的反射，在检测与测量装置拾取的信号中，避免任何这种反射光加到发射的荧光16上，当载体10是用折射率为1.5的玻璃制成时，则载体10在基本上是法向的入射角上，反射激发光的强度百分比，每一表面约为4％，当载体10是用折射率为3.5的硅制成时(这里，覆盖载体的媒体的折射率等于1)，每一表面约为25％。
本发明提出向载体10增加至少一种如下装置·吸收层18，由折射率接近载体10的材料制成，该吸收层厚度d的确定，要使所述厚度d与它在激发波长上的吸收系数αe的乘积远大于1，或者是已知的并被控制在约0.1到10范围的值；·一层或多层透明层20，由对激发波长的抗反射层构成，即，层20由折射率n′接近载体10折射率平方根的材料制成，且其厚度等于λe/4n′cosθ或所述厚度的奇数倍，θ是激发光线在层20或每一层20中相对于激发光线法向的角度。
当入射角大于约55°，且激发光有p偏振(电场在入射平面中)时，把入射角i调整到Brewster角，如由关系i＝arctan(n)给出，这里n是载体材料的折射率，能够消除载体对激发光的反射。在这种情况下，吸收层18在载体之内。
如图1所示，可以在载体10的上表面形成一层或多层抗反射层20，又可以在载体10的下表面或在它的附近，形成吸收层18，然后把发色单元12沉积在抗反射层20上。
当载体10是用透明材料制成时，还能够在它的下表面形成一层或多层抗反射层和一层吸收层，消除载体下表面对激发光14的反射。
还能够按相同方式处理载体10的上表面，即把载体10的上表面覆盖在吸收层18内，吸收层本身被覆盖在一层或多层抗反射层20中。
在这种情况下，激发光14被吸收，不通过载体10，从而在发色单元12发射的荧光16波长上，排除任何载体10的杂散发射。
当载体10是由玻璃制成时，抗反射层20可以由氟化镁MgF2制成，它的折射率接近1.38。如果激发光波长是532nm，那么层20的厚度约为100nm。
吸收层18可以是有机分子，可以嵌入溶胶型基质或聚合物基质中，或者由嵌入所述基质中的无机颜料制成，或者实际上例如由CdS或CdSe型量子箱制成，分散在基质内并经过处理，以消除它们自身的发光。
如图2所示，载体10最好还包括由内部层形成的反射镜22，该内部层材料反射发色单元12发射的荧光波长上的光，该反射镜22位于离发色单元12的距离，远大于量值λf.n/2NA2，λf是发射的荧光16的波长，n是载体10的折射率，而NA是检测和测量发射的荧光的光学装置的数值孔径。
对激发光14反射的减少，是借助形成在载体10的上表面的抗反射层20、和插入载体10的抗反射层20与反射镜22之间的吸收层18获得的。
反射镜22与载体10的上表面之间的距离相对较大，具体说，大于5微米(μm)，因此能使吸收层18毫不困难地装入反射镜22与抗反射层20之间。
构成反射镜的反射层22，可以由多层电介质层制成，在使用的入射角上对激发光波长给出零反射，该入射角一般是小的，并小于10°。
如在图3示意画出的，能够在两个反射镜22之间形成对称的Fabry-Perot微腔或腔，两个反射镜22各由有相同反射率的电介质叠层制成。
为此，例如能够制造交替给出高折射率H和低折射率L的材料的叠层，诸如分别为TiO2和SiO2，每一层的光学厚度等于λe/4，叠层例如是HLHLHLHL-X-LHLHLHLH，这里L和H分别表示低和高折射率层，而X表示一层H型的层，形成能够调整腔模波长的腔，使对该波长的反射为零。
当然，激发光在载体10的下表面的反射，能够通过淀积抗反射层20和吸收层18加以限制。
在图3的实施例中，载体10的下表面附近有一吸收层18，而抗反射层20形成在载体10的上表面并载运发色单元12。
在这种情况下，并如图4所示，载体10在激发波长λe上的反射是零，并在发色单元发射的荧光波长λf上的反射非常高，最好接近100％。
在图5的实施例中，载体10是有折射率n的材料板，该板包括高反射率的反射层24，该层是金属或由电介质叠层形成，且位于离载运发色单元12的载体上表面的距离为d，这里d小于量值λf.n/2NA2，这里λf是发色单元12发射的荧光波长，而这里的NA是检测和测量所述荧光的光学装置的数值孔径。
这种结构能够产生干涉效应，按波动光学定律的应用，改进发射的荧光的收集。在上面指出的以本发明人相同名义提出的申请中可知，据此能够通过使激发光和发射的荧光两种波长的电场波腹，在载体10的上表面载运的发色单元12上重合，产生这两种光的双谐振。也能够仅对发射的荧光产生谐振，而发色单元上激发光的干涉状态是任意的。
在本实施例中，凭借形成确定的厚度在反射层24和发色单元12之间的吸收层18，消除或减少激发光的反射，该厚度小于或大于反射层24和发色单元12之间的厚度。
层18的作用是尽量多地吸收激发波长，但不吸收发射的荧光波长。
能够确定乘积αe.d的值，这里αe是层18在λe的吸收系数，而d是所述层的厚度，又，反射层24和载运发色单元的载体表面之间的距离D，要使载体在λe上的全部反射率为零。如果对给定入射角和偏振、在空气载体界面、在λe上的反射率振幅是r1，又如果在层24的λe上的反射率振幅是r2，如果就振幅而言有r2exp(-αe.d)＝r1即αe.d＝Ln(r2/r1)
又如果2n.Dcosθ是λe/2的奇数倍，θ是激发光在层24上的入射角，那么两个反射产生的光线基本有相同振幅和相反的相位，能够使第一反射与第二反射抵消。
这一涉及相位的条件，与保证在发色单元12上加强激发的情况相同，如在上述更早以本发明人相同名义提出的申请所述。因此能够使用较少吸收从而较薄的层18，并降低对层24在λe上反射率的约束，因为能够使用层18来消除激发光在载体10的上表面和在层24两者上反射的组合效应。
在一种变化的，并如在图6画出的情形中，能够用非对称Fabry-Perot腔取代金属反射层24，该非对称Fabry-Perot腔由两层不同的反射层22形成，一层形成载体10的上表面并载运发色单元12，另一层定位在载体10之内，并位于离发色单元12的距离小于上面指出的量值λf.n/2NA2。
然后，在载体10的下表面，或在所述下表面的附近，形成吸收层18，可以与上面指出的抗反射层20组合。
因此，能够在载体内形成微腔，它有用于消除激发光反射的金属反射镜(腔膜对应于在使用的入射角上的激发波长)。
基于微腔(有电介质或金属反射镜)的方案，能够比基于在反射载体上制作抗反射层的方案，获得大得多的激发和发射波长之间反射率的差别，从而减少与波长关联的噪声光。
在一种变化中，可以使用由周期的高、低折射率材料叠层形成的Bragg反射镜，给出相对窄的频带，使在发射的荧光波长上有极高的反射率，而在所述频带外有小的反射率，为保持在波动光学的范畴内，可以向该Bragg反射镜添加上面指出类型的、但厚度非常薄的抗反射层或吸收层。
本发明的两个优选实施例如下·形成Bragg反射镜，以便对λe上的反射率给出准确的振幅和相位，使Bragg反射镜的反射与载体10的上表面反射组合，消除载体在λe上的全部反射；或
·不在反射率、尤其不在振幅方面，精确调整Bragg反射镜，而使Bragg反射镜成为宽带的，所以，如上所述，正是在所述反射镜和载体10的上表面之间插入的吸收层，能通过选择乘积αe.d，消除载体在λe上的全部反射。
能够使用熟知的光学综合方法，例如“双稳态”方法，形成构成Bragg反射镜的叠层。
十分普遍的做法是，可以改变激发光的入射角和偏振，以消除载体的全部反射，同时尽量简化叠层的综合，以遵守为获得良好的荧光信号所加的其他约束。另一方面，可以把本发明的载体，与按规定的入射角及偏振传送激发光的照明装置结合，降低从载体的杂散反射。
在波动光学的条件下，本发明使用反射的多层结构(微腔、Bragg反射镜、...)的实施方案，还能保证发色单元定位在发射场的波腹附近，如同上述以本发明人相同名义提出的国际专利申请所述。
在图7的实施例中，载体10包括折射率为n的材料板，和两个分开的反射镜26、28，发色单元12放在它们之间。
更准确地说，发色单元12由覆盖下反射镜28的透明材料层30载运，而上反射镜26覆盖层30，同时被分隔层32从层30分开，分隔层32例如通过蚀刻形成腔，其中沉积发色单元12。
反射镜26和28在波动光学条件下工作，即，反射镜28离开发色单元12的距离，小于量值λf.n/2NA2，且两个反射镜26和28之间的距离小于量值λf.n/2NA2。
确定反射镜26和28的特征，使下反射镜28透射激发波长，而反射镜28则反射发射的荧光波长，然后通过上反射镜26，供检测和测量装置拾取。
上面指出类型的吸收层18，形成在载体10的下表面或其附近，并如同上述实施例说明的，可任选地与上面指出的抗反射层结合。
权利要求
1.一种发色单元的载体，所述单元被激发光照射，以不同于激发光的波长发射荧光，该载体包括至少一层反射发色单元发射的荧光的反射材料内部层，和至少一种消除或起码显著降低激发光反射的装置，所述装置从如下一组中选出·吸收激发光的吸收材料层；·至少一层在激发波长上构成抗反射层的透明材料层，所述层形成在载体的至少一个表面，并有接近载体折射率平方根的折射率n′，且其厚度等于λe/4n′cosθ的奇数倍，这里θ是在所述抗反射层中激发光线的入射角；和·电介质和/或金属层，这些层定义腔模的微腔，该微腔是为消除激发光的反射而定义的。
2.按照权利要求1的载体，其中的吸收层厚度，要使所述厚度与它在激发波长上的吸收系数αe的乘积远大于1，或者是已知的并被控制在约0.1到10范围的值。
3.按照权利要求1的载体，其中的吸收层和至少一层上述抗反射层，形成在载体的与载运发色单元表面相对的表面上。
4.按照权利要求1的载体，其中的吸收层和至少一层上述抗反射层，形成在载体的接受发色单元的表面上。
5.按照权利要求4的载体，其中的抗反射层形成在吸收层上。
6.按照权利要求1的载体，是为了与有数值孔径NA、收集发射的荧光的光学装置一起使用的，其中反射发色单元发射的荧光的反射材料内部层，位于离载运发色单元的载体表面的距离d，远大于量值λf.n/2NA2，且至少一层上述抗反射层，形成在载体的接受发色单元的表面上。
7.按照权利要求6的载体，还包括形成在抗反射层与内部反射层之间的上述吸收层。
8.按照权利要求6的载体，其中的内部反射层，包括多层电介质层，并在激发波长上，对激发光在载体上的入射角，给出基本零的反射率。
9.按照权利要求8的载体，其中所述内部反射层包括叠层，各有厚度等于λe/4并有高低交替的折射率，定义对称的Fabry-Perot腔。
10.按照权利要求9的载体，其中，确定腔的厚度，使在激发波长上获得零的反射率。
11.按照权利要求8的载体，在内部反射层和载体的与载运发色单元表面相对的表面之间，包括上述吸收层。
12.按照权利要求1的载体，是为了与有数值孔径NA、收集发射的荧光的光学装置一起使用的，其中反射发射的荧光的材料内部层，位于离载运发色单元的表面的距离，小于量值λf.n/2NA2。
13.按照权利要求12的载体，其中上述的吸收层，形成在内部反射层和载运发色单元的载体表面之间。
14.按照权利要求12的载体，其中反射材料的内部层，是金属层或电介质层的叠层。
15.按照权利要求13的载体，其中，确定吸收层的厚度及其在激发波长上的吸收系数，还有反射层和载运发色单元的载体表面之间的距离，凭借已确定的吸收层吸收系数与厚度的乘积，使首先被所述载体表面反射、然后被反射层反射的激发光振幅，基本相等，再凭已确定的所述表面离反射层的距离，使两种反射在所述载体表面有相反的相位，从而消除载体对激发光的全部反射。
16.按照权利要求15的载体，其中反射层和所述载体表面之间的距离D，要使量值2n.Dcosθ等于激发波半波长的奇数倍。
17.按照权利要求12的载体，其中的内部反射层，是由反射激发光的Bragg反射镜形成的，该被反射的激发光具有的振幅和相位，可使与载运发色单元的载体表面反射的激发光组合后，被载体反射的全部激发光，基本为零。
18.按照权利要求1的载体，是为了与有数值孔径NA、收集发射的荧光的光学装置一起使用的，该载体包括两层反射发射的荧光的反射材料层，所述两层形成非对称的Fabry-Perot腔，并位于离载运发色单元的载体表面的距离，小于λf.n/2NA2，且上述吸收层位于所述反射层和载体的与载运发色单元表面相对的表面之间。
19.按照权利要求1的载体，是为了与有数值孔径NA、收集发射的荧光的光学装置一起使用的，该载体包括两层反射发射的荧光的反射材料层，这些层之一位于载体之内，离开载运发色单元表面的距离小于量值λf.n/2NA2，这些层的另一层覆盖载运发色单元的载体表面，并位于离该第一反射层的距离小于量值λf.n/2NA2，且载体中的上述吸收层，形成在该第一反射材料层和载体的与载运发色单元表面相对的表面之间。
20.按照权利要求1的载体，其中，上述吸收层由有机分子制成，光学上嵌入溶胶或聚合物型基质中，或者是嵌入溶胶型基质中的无机颜料，或者是分散在基质内的CdS或CdSe型量子箱但不给出它们自己的发光度。
21.按照权利要求1的载体，是为了被p偏振的激发光，以等于载体材料Brewster角的入射角照射，该载体还包括位于载体内的上述吸收层。
22.按照权利要求1的载体，是为了载运至少两种不同类型的、发射不同波长荧光的发色单元，其中所述抗反射层，对至少两种上述激发波长，给出低的反射率。
23.按照权利要求22的载体，其中所述抗反射层，包括在多种激发波长上给出低反射率的叠层。
24.按照权利要求22的载体，其中所述吸收层，包括吸收不同波长的配料。
全文摘要
本发明涉及发色单元的载体装置，所述单元(12)要接受激发光(14)的照射，以便以不同于激发光的波长发射荧光(16)。本发明的载体(10)包括反射发色单元发射的光的内层(22)；吸收激发波长的材料层(18)和对所述波长抗反射的材料层(20)，以防止激发光被载体反射，并加到发色单元(12)发射的荧光上。
文档编号G01N21/77GK1739021SQ200480002264
公开日2006年2月22日 申请日期2004年1月15日 优先权日2003年1月15日
发明者克劳德·韦斯布奇 申请人:基因波公司