减轻微阵列测定中的非特异性结合的制作方法

专利名称：减轻微阵列测定中的非特异性结合的制作方法
本申请涉及测定未知样品中靶分子的方法，更具体说涉及用微阵列测定靶分子(如蛋白质或细胞溶解产物)的方法，该方法采取步骤能使靶分子或其它物质与微阵列基材非特异性结合和干扰该微阵列测量信号的背景噪声最小化。
背景技术：
蛋白质、碳水化合物、细胞溶解产物等与微阵列(其表面带有含蛋白质捕获剂等的微斑点)所用玻璃或其它基材的背景结合造成的问题已多年未得到解决。当对微阵列摄像或阅读微斑点上产生的信号时，蛋白质与微阵列基材的非特异性结合增加了这种背景噪声。由于这种背景噪声会干扰和阻止获得精确读数，因此难以检测和区分获自标记物质特定斑点特异性结合所产生的信号，尤其是当信号相对较弱时。
迄今，用于减轻或缓解该问题的两种较常用方法涉及众多微斑点各自周围基材表面区域的封闭方法。一种封闭方法是化学涂布基材表面，例如，通过与用琥珀酸酐处理的玻璃表面产生的氨基发生化学反应。第二种方法是使小分子附着于玻璃表面，例如，BSA、tRNA、脱脂乳粉、酪蛋白等。各种封闭方法的描述可见于美国专利公开No.2003/0044823，该文献提议使用“扩散增强剂溶液”，推测在采用核酸探针的测定中有效。美国专利No.5,248,595涉及采用抗体的测定方法，它提议用pH 9或更高含有特定阴离子表面活性剂的水性缓冲洗液除去未复合的蛋白质材料。美国专利No.5,656,504涉及采用抗体的测定方法，公开了用羧化葡聚糖层涂布玻璃支持物以防止不需要蛋白质的结合。美国专利No.5,017,559提议用牛奶蛋白质加特定比例的有机酸来阻止抗体等非特异性吸附于基材。
尽管提出的解决该问题的各种方法已显示获得某些成功，但它们都没有被广泛接受作为该问题的通用解决办法。因此，仍在继续寻找克服阅读微阵列，尤其是采用三维(3D)水凝胶微斑点微阵列时背景噪声的更好解决方法。
发明概述已发现可利用特殊的孵育后处理来有效除去结合测定中可能与微阵列基材非特异性结合的靶分子，如蛋白质/蛋白质复合物或其它带有标记的分子。孵育后用含有消化剂如消化酶(蛋白酶)或溶酶体的液体进行一步洗涤，这类消化酶能有效去除这种标记，除去靶分子的荧光标记部分和/或从靶分子非特异性结合的基材上除去靶分子本身。使这些蛋白酶结合或涂布在大分子或固体颗粒上，颗粒的大小阻止它们进入3D水凝胶微斑点的多孔表面；因此，它们将不能抵达和消化沉积在这种多孔水凝胶微斑点内的标记的靶-探针复合物。根据具体试验要求可采用一种或多种蛋白酶或其它消化剂。一旦蛋白质含有标记的特定节段(或者基本上全部蛋白质)被切断即被这种洗涤液带走。此时，例如当试验是采用多种抗体的夹心测定时，可能需要采用多种蛋白酶或用不同蛋白酶进行多次洗涤。
在一具体方面，本发明提供了一种测定待分析样品中一种或多种靶分子存在的方法，所述方法包括提供具有上表面的基材；在所述表面附加多个三维多孔水凝胶微斑点；在所述多个微斑点的各孔内提供不同捕获剂而在所述表面形成微阵列；使所述微阵列接触含有靶分子的溶液，靶分子的大小为能结合所述多孔水凝胶微斑点内的所述捕获剂；所述接触后用含有消化剂的液体洗涤所述微阵列，除去所述表面上的非特异性结合靶分子或者至少靶分子的标记部分，而不影响与所述多孔水凝胶微斑点内捕获剂特异性结合的靶分子；如果在所述结合时所述靶分子不含标记，则在所述洗涤之前或之后使标记与所述靶分子连接；和测定所述洗涤后的微阵列以检测结合在特定微斑点内的标记的靶分子产生的信号。
在另一具体方面，本发明提供了一种测定待分析样品中一种或多种靶分子存在的方法，所述方法包括提供具有上表面的固体基材；在所述表面附加多个三维多孔异氰酸酯官能化水凝胶微斑点；将结合物质(entity)固定在所述多孔水凝胶微斑点中；在所述多个微斑点的各孔内提供不同的蛋白质性质的捕获剂形成微阵列；这种捕获剂的水溶液扩散进入所述多孔水凝胶微斑点内而使捕获剂附着于所述结合物质；使所述微阵列接触含有靶分子的溶液，靶分子的大小能结合所述多孔水凝胶微斑点内的所述捕获剂；所述接触之后用含有消化剂的液体洗涤所述微阵列，去除所述表面上的非特异性结合的靶分子或者至少靶分子的标记部分而不影响与所述多孔水凝胶微斑点内捕获剂特异性结合的靶分子；和测定所述洗涤后的微阵列以检测结合在特定微斑点内的标记的靶分子产生的信号。
优选实施方案详述近年来，医学诊断领域的免疫测定采用固相基材例如板(如显微镜玻璃载玻片和硅制成的载玻片)以及纤维素膜等来支持某些分子的特异性探针或捕获剂，以检测未知样品中是否存在特定配体。因此，用于制备测定用微阵列的基材包括支持薄膜或微孔膜、具有多个微孔的固相平板和板(可以是多孔或不可渗透的)。玻璃载玻片如标准显微镜载玻片常用作这种微阵列的基材，这种玻璃表面通常用氨基硅烷、醛、聚赖氨酸等处理以提供能接受结合探针或探针附着材料的反应性表面。为提供这种基材常用氨基硅烷处理玻璃载玻片。
本发明涉及具有多个3D微斑点的微阵列的应用；微阵列有时称为生物芯片。这种生物芯片的例子描述见于美国专利No.6,174,683和题为“三维形式生物芯片(ThreeDimensional Format Biochips)”的公开的国际申请WO 02/059372。
在这种三维阵列中，探针不是与板孔的固体表面、或玻璃载玻片或一些其它平板、或者微孔膜或薄膜相连；而是，它们通过附着于多孔聚合水凝胶微斑点内部而存在于三维阵列中。这种安排使探针与固体基材分离并扩大了呈递探针和最终捕获标记分子等的表面面积。通常在一张玻璃载玻片上或微孔板的一个微孔内可提供多个这种3D微斑点。
生物芯片基材可用各种材料制成，所述材料的模式通常有助于在结合测定中自动操作和后续检测结合于各微斑点的靶分子。虽然固体平板如玻璃载玻片是合适和优选采用的，但也可采用其中含有各微斑点的凹陷或孔的板。也可采用一些微孔膜，如硝酸纤维素膜或尼龙膜，只要它们能让消化剂接触可能发生非特异性结合的表面即可。透光的基材如玻璃或透明聚苯乙烯能让检测光穿过微斑点，而便于用荧光或光吸收检测。由于三维水凝胶微斑点的结合容量高，反射光法也可用于不透明基材。使用刚性基材能够在生物芯片分析的检测阶段精确排列，但如果已经将微斑点适当排列而便于检测就不需要了。例如，柔性材料如磁带、微孔膜或细丝能够以类似于使用磁带的扫描方式精确检测。虽有光学方法和合适的基材由于其简便性而是优选的，但也采用其它生化检测方法，例如检测放射性标记。通常可在生物芯片上提供任何数量的微斑点，例如1-10,000个。为有助于自动操作通常采用96的倍数；例如，可在3英寸(7.6厘米)×5英寸(12.7厘米)板上的阵列中提供384个微斑点。
水凝胶是一类能提供凝胶基质的聚合物，它具有以下所需属性适当孔径和高含水量以允许分子扩散到基质中和基质外，能够结合不可渗透的或表面有微孔的玻璃表面，完全聚合状态时光学透明以使荧光标签的光学干扰最小，完全具有时有良好的结合完整性，以及具有适合正常研究和临床应用的合适保存期。水凝胶是亲水网络聚合物，它在脱水状态下像玻璃而在存在水时溶胀形成弹性凝胶。异氰酸酯官能化水凝胶具有许多有助于固定捕获剂(如核酸杂交探针、蛋白质、碳水化合物、细胞等)的特征。异氰酸酯官能化水凝胶是指用异氰酸酯基加帽的有机聚合物，该基团能进行所需的进一步聚合也能共价结合蛋白质或者进而通过中间体结合蛋白质，例如，本领域熟知可通过二异氰酸酯与聚醚或聚酯多元醇之间的反应形成的聚氨基甲酸酯(polyurethane)聚合物可提供用于此目的的合适的水凝胶。
常用前聚合物(prepolymer)作为起始材料，利用这种异氰酸酯官能化水凝胶形成生物芯片，可配制这种前聚合物以提供水合聚氨基甲酸酯、聚脲-氨基甲酸酯(urethane)和/或聚脲酸聚合凝胶。水凝胶聚合物通常在一定条件下聚合亲水单体的水溶液而形成，在该条件下，轻微交联的前聚合物先形成三维聚合网络，该网络再胶凝成为浓缩凝胶。可通过形成脲键和氨基甲酸酯键使异氰酸酯末端加帽的前聚合物聚合而形成聚氨基甲酸酯水凝胶。
合适的异氰酸酯官能化前聚合物常用能与双官能或多官能异氰酸酯化合物反应的聚氧化烯二醇或多元醇制备。优选的用于制造生物芯片的前聚合物是用聚氧化烯二醇或多元醇制备的，包括环氧乙烷单元的均聚物或含有环氧乙烷单元和环氧丙烷或环氧丁烷单元的混合物的嵌段或随机共聚物。若是这种嵌段或随机共聚物，至少75％的单元应优选环氧乙烷单元。或可采用聚氧化丙烯的均聚物。聚氧化烯二醇或多元醇的分子量优选约1,000-10,000，更优选约2,000-6,000。合适的前聚合物可通过所选聚氧化烯二醇或多元醇与聚异氰酸酯反应制备，异氰酸酯与羟基的比例约为1.2-2.2，这样可使几乎所有的羟基都被聚异氰酸酯加帽。这种异氰酸酯官能化前聚合物优选含有一定量的活性异氰酸酯，所述含量约为0.2-0.8meq/g。该前聚合物应在形成微斑点时不会过快聚合，就此而言，通常优选含有较低含量异氰酸酯的高分子量前聚合物。
这种高分子量前聚合物常用两种通用方法之一制备(1)使分子量至少2,000道尔顿的多元醇(三元醇或更高)与聚异氰酸酯如异氟尔酮二异氰酸酯反应，或(2)使分子量至少2,000道尔顿的二元醇与聚异氰酸酯和交联剂反应，所述交联剂诸如甘油、三羟甲基丙烷、三羟甲基乙烷、三乙醇胺或有机三胺反应。
可采用芳族、脂族或环脂族聚异氰酸酯。高分子量脂族异氰酸酯加帽的前聚合物通常能在约20-90分钟内胶凝成为水合聚合物状态，而用芳族聚异氰酸酯加帽的前聚合物胶凝快得多。合适的双官能或多官能异氰酸酯的例子如下甲苯-2，4-二异氰酸酯、甲苯-2，6-二异氰酸酯、异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)、乙烯基二异氰酸酯、亚乙基二异氰酸酯、丙烯-1，2-二异氰酸酯、亚环己基(cyclobexylene)-1，2-二异氰酸酯、亚环己基-1，4-二异氰酸酯、苯二异氰酸酯、3，3”-二苯基-4，4”-二苯二异氰酸酯、1，6-六亚甲基二异氰酸酯、1，4-四亚甲基二异氰酸酯、1，10-十亚甲基二异氰酸酯、枯烯-2，4-二异氰酸酯、1，5-萘二异氰酸酯、亚甲基二环己基二异氰酸酯、1，4-亚环己基二异氰酸酯、对-四甲基苯二甲基二异氰酸酯、对-苯二异氰酸酯、4-甲氧基-1，3-苯二异氰酸酯、4-氯-1，3-苯二异氰酸酯、4-溴-1，3-苯二异氰酸酯、4-乙氧基-1，3-苯二异氰酸酯、2，4-二甲基-1，3-苯二异氰酸酯、2，4-二甲基-1，3-苯二异氰酸酯、5，6-二甲基-1，3-苯二异氰酸酯、1，4-二异氰酸根合二苯基醚、4，4’-二异氰酸根合二-苯基醚、联苯胺二异氰酸酯、4，6-二甲基-1，3-苯二异氰酸酯、9，10-蒽二异氰酸酯、4，4’-二异氰酸根合二-苯基、3，3’-二甲基-4，4’-二异氰酸根合二苯基甲烷、1，6-二甲基-4，4’-二异氰酸根合二苯基、2，4-二异氰酸根合芪(stibene)、3，3’-二甲氧基-4，4’-二异氰酸根合二苯基、1，4-蒽(antracene)二异氰酸酯、2，5-荧光酮二异氰酸酯、1，8-萘二异氰酸酯、2，6-二异氰酸根合苯并呋喃(benzluran)、2，4，6-甲苯三异氰酸酯、p，p’，p”-三苯基甲烷三异氰酸酯、异氟尔酮二异氰酸酯的三官能三聚体(异氰脲酸酯)、六亚甲基二异氰酸酯的三官能缩二脲、六亚甲基二异氰酸酯的三官能三聚体(异氰脲酸酯)、聚合4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯、苯二甲基二异氰酸酯和间-四甲基苯二甲基二异氰酸酯。
采用化学计量量的反应物可有效地使聚异氰酸酯加帽的所选二醇或多元醇形成前聚合物。如本领域所知，异氰酸酯与羟基的比例可变化，优选约为1.2-2.2。加帽反应可采用合适条件进行，例如约60-100℃在干燥氮气下反应约2小时至约14天，优选不用催化剂。当异氰酸酯浓度接近理论值时终止反应。
优选的前聚合物包括末端用甲苯二异氰酸酯加帽的聚乙二醇；环氧乙烷和氧化丙烯(任选含有三羟甲基丙烷)以及甲苯二异氰酸酯的共聚物；甲苯二异氰酸酯-聚乙二醇-三羟甲基丙烷(trimethylopropane)，亚甲基二异氰酸酯-亚甲基均聚物；聚合的亚甲基二异氰酸酯-聚乙二醇；环氧乙烷-氧化丙烯-三羟甲基丙烷和异氟尔酮二异氰酸酯的聚合物，以及聚乙二醇三乳酸盐和甲苯二异氰酸酯。合适的上述类型的前聚合物购自Dow Chemical Company，名为HYPOL PreMAG-50、HYPOL2000、HYPOL3000、HYPOL4000和HYPOL5000；这些制剂通常包括聚氧化乙烯和少量分子量约6,000道尔顿的聚氧化丙烯的共聚物。购自其它制造商的类似产品，和可从市售原料配制类似前聚合物。
总的看来，水凝胶聚合物的主链优选由聚乙二醇、聚丙二醇或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物构成。认为聚乙二醇和聚丙二醇水凝胶的非离子亲水特性能够降低分析物与水凝胶非特异性结合的水平，要固定的生物分子有良好的相容性，从而可维持其天然构象和生物反应性。异氰酸酯官能化水凝胶的优点是能以相对均匀方式迅速吸收大量液体从而可维持凝胶材料的整体基本形状。此外，这些材料吸收的水分即使在施加压力时也能保持在吸收材料中。这种通用类型的基于聚氨基甲酸酯的异氰酸酯官能化水凝胶的描述见于美国专利Nos.3,939,123(Mathews等)、4,110,286(Vandegaer等)和4,098,645(Hartdegan等)。
优选的生物芯片可用异氰酸酯官能化水凝胶制造，所述水凝胶基于高分子量聚氧化乙烯、聚氧化丙烯或者聚氧化乙烯和聚氧化丙烯共聚物的二元醇或三元醇，用水活化的二异氰酸酯加帽，并任选用合适的交联接头轻微交联。前聚合物中存在的活性异氰酸酯的量优选不大于约0.8meq/g。通常优选的二异氰酸酯包括芳族二异氰酸酯如甲苯二异氰酸酯(TDI)和亚甲基二苯基-异氰酸酯(MDI)，以及脂族二异氰酸酯如异氟尔酮二异氰酸酯。优选采用含约0.5-15％反应性异氰酸酯的前聚合物来提供固定捕获剂的位点。形成生物芯片的前聚合物(可用能与水混溶的有机溶剂预先配制)的聚合可通过简单地加入水形成脲键而发生。
术语“捕获剂”用来指能够以特定方式与一种或多种靶分子相互作用而与靶分子杂交，或通过杂交之外的机制与靶分子相互反应而物理上螯合(sequester)。捕获剂可包括核酸，如通过杂交结合的DNA、RNA和PNA，以及生物材料形式的非杂交物质，如蛋白质类，包括蛋白质、受体、肽、酶、酶抑制剂、酶底物、免疫球蛋白(如抗体)、抗原、凝集素、修饰的蛋白质、修饰的肽，双链DNA、源于生物的胺类和复杂碳水化合物。捕获剂也可包括合成分子，例如经设计而具有这种类型特异性结合活性的药物和合成配体。“修饰的”蛋白质或多肽指那些其分子内的一个或多个氨基酸用加入了新的化学残基、除去了已有的化学残基或除去和添加残基的某些组合而改变的蛋白质或肽。这种改变可包括天然修饰和合成修饰。天然修饰包括但不限于磷酸化、硫酸化、糖基化、核苷酸加入和脂质化。合成修饰包括但不限于有助于与水凝胶结合的化学接头，以及加入荧光染料、微米结构、纳米结构如量子点(quantumdot)或其它合成材料。此外，修饰可包括除去已有官能基团，如羟基、巯基或苯基，或者除去或改变天然侧链或多肽的酰胺骨架。复杂碳水化合物的例子包括但不限于天然和合成的直链和支链寡糖，修饰的多糖如糖脂、肽聚糖、葡糖胺聚糖或乙酰化寡糖，以及异质性寡糖，如N-乙酰胺基葡萄糖或硫化糖。天然产生的复杂碳水化合物的具体例子包括壳多糖、透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素(chondroitan sulfate)、肝素、纤维素和见于修饰的蛋白质如白蛋白和IgG中的糖部分。在微芯片阵列的一些位置可固定两种或多种捕获剂的组合，可作为两种物质的混合物加入该组合或者可依次加入。
捕获剂可在水凝胶材料聚合之前、期间或之后直接或间接固定在各微斑点内。间接固定考虑采用中间试剂先连接于水凝胶和可用第二中间试剂再与其连接。例如，包裹在水凝胶基质中的第一或主要中间试剂可以是抗钙调蛋白的抗体。一旦钙调蛋白结合于该抗体，该钙调蛋白即起着第二中间试剂的作用进而螯合钙调蛋白的结合蛋白，如钙/钙调蛋白依赖性激酶II。这种将CaM激酶II(如通常提到的)附加到水凝胶的方法提供了一种通过天然形成的结合基序(即通过钙调蛋白)来锚定蛋白质的温和方法。例如，为检测对CaM激酶II的调节(磷酸化、去磷酸化)或者为寻找可能存在的停靠蛋白或其它胞内运输蛋白，现在可免费得到CaM激酶II以探测分析物溶液。
将固定的捕获剂和靶分子之间的相互作用称成螯合或非杂交结合时，指两个或多个分子以特异和选择方式粘合或结合在一起，这通常是通过共价键或非共价键(例如，通过范德华力和/或离子相互作用)。特定的靶分子可以是存在于生物或合成材料的复杂混合物中的简单分子。螯合(sequestering)或结合可以长期性，例如共价修饰或或抗体-抗原相互作用，或者可以是瞬时性，例如磷酸化时。非杂交DNA结合物质包括，但不限于，合成的或天然的双链脱氧核糖核苷酸聚合物，合成的或天然的聚核糖核苷酸，适体，以及具有一个或多个修饰的或非天然产生的化学残基的合成的多核苷酸。使用DNA作为结合剂/螯合剂的另一种方法与通常使用单链DNA(寡核苷酸或cDNA)与靶DNA杂交的常规核苷酸杂交阵列相反。可用双链DNA与合适的生物分子(如有DNA结合蛋白、转录因子如雌激素受体、或者合成药物或分子)相互作用(不同于杂交)以结合或螯合该生物分子。一个例子是，通用转录因子如TBP或SPl或者基因特异性转录因子(如核激素受体)可被双链螺旋DNA吸引并螯合。适体描述于美国专利No.5,840,867，它们在其中的功能更像单克隆抗体。
最初的捕获剂可通过物理方法共聚在胶体基质内，例如选择性抗体或其它选择性结合剂，如适体；阵列的各个微斑点内可固定一种或多种不同抗体。随后在该阵列上施加生物材料的复杂混合物，利用各微斑点内这种固定抗体的独特结合属性来“白分选”这种复杂混合物并形成“自装配”的新的阵列；这种新的阵列将与最初的结合(捕获剂)互补。例如，可在聚合过程中将抗特定抗原的抗体固定在各凝胶微斑点内；之后可提供特异性蛋白质或肽抗原，使这种蛋白质或肽抗原的混合物接触该阵列从而结合各自的同源抗体。这种中间抗体阵列的用途的一个例子是能自分选细胞提取物中的复杂蛋白质混合物而无需单独分离各蛋白质。然后用如此形成的阵列来评估接触加入的蛋白激酶或其它蛋白质修饰剂对各个位点的功效。这一概念可扩大到检测药物或其它添加的化合物是否会影响这种修饰活性。
另外，通过使用一开始固定的中间试剂聚合之后将其它捕获剂安置或锚定到生物芯片阵列的微斑点内。例如，可在聚合过程中固定合适的中间试剂如A蛋白，；之后通过受控接触溶液中的免疫球蛋白使所需的免疫球蛋白捕获剂结合于固定的A蛋白。
随后也可修饰一开始用于固定的捕获剂。这种修饰可包括(a)生物修饰，例如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化、脂质修饰和ADP-核糖基化，或(b)非生物修饰，例如荧光染料修饰、生物素化、烷基化和掺入异常残基以及与其它蛋白质或酶偶联以形成最终形式的改性阵列。此外，可在聚合过程中固定双链核酸寡核苷酸(或聚合物)；之后可通过核酸序列-特定蛋白质相互作用使所需蛋白质结合到这种核酸，从而产生自装配的蛋白质-核酸复合阵列。
此外，优选在非质子溶剂中使前聚合物与捕获剂反应，将捕获剂有效固定到前聚合物上，该过程有助于随后产生前聚合物的均匀水溶液并能够减慢聚合步骤中二氧化碳的生成。如果在高粘度混合物中聚合过于迅速，产生的二氧化碳气体无法逃逸而被截留在凝胶中。这可导致产生不连续的泡沫基质，从而可能对凝胶基质的连续性产生问题并可能妨碍光学透明性。在生物芯片设计中，光学透明性越高，检测表明与靶分子成功结合的信号(如荧光)的准确度越高。
靶分子或其它第二结合物质在多孔水凝胶中扩散与固定在凝胶基质中的中间或第一捕获剂相互作用的难易程度部分由所采用溶液中的水凝胶前聚合物百分比所决定。尽管用5％的前聚合物溶液配制水凝胶小滴足以形成其中将固定核酸探针的微斑点，但较大分子如蛋白质在5％水平形成的聚合水凝胶中扩散将比需要的慢。因此，通常优选使用较低百分比，例如3.5％的前聚合物，以便于较大生物分子进入多孔水凝胶。因此，对于许多应用，例如那些采用抗体作为可视化工具的应用，优选的聚合物范围约为3-5％。对于其它应用和用途，例如那些检测大小小于典型抗体如IgG的分子的应用，可相应地采用较高或较低百分比的聚合物溶液。如下文的解释，应调节孔径大小防止某些大小的微球进入。
尽管水凝胶可先用蛋白质捕获剂(或者能结合捕获剂的中间体)衍生，然后在聚合开始后但在聚合完成前将其沉积到固体基材上，但这种方法并不优选。通常，运送水凝胶前聚合物微滴可用本领域熟知的任何常规方法完成的；例如，可采用常规的沉积凝胶以形成微斑点阵列的微打点(mocrospotting)机。虽然这种凝胶本身可非共价附着于某些基材，但在加入水凝胶之前通常会衍生基材表面以凝胶确保牢固附着于基材。例如，当将玻璃用作基材时，在沉积聚合的水凝胶之前可用胺衍生玻璃。已经例如用蛋白质衍生的聚合的水凝胶当被沉积到衍生的玻璃基材上时通过其保留的一些活性异氰酸酯基用与玻璃表面的氨基反应而强烈结合于该基材。这样使得水凝胶微斑点共价附着于基材，优选最初存在于前聚合物中的约5％或更少的异氰酸酯基被用于该功能。
某些实施方案中，可能优选开始时部分封闭捕获剂以最大提高其固定效果。例如，通过异氰酸酯前聚合物与特定捕获剂中含有的某些化学基团(如伯氨基)反应使捕获剂与聚合物之间过度交联，这可能导致捕获剂变性或者可能降低它与其靶化合物的结合亲合力。通过在聚合过程中保护至少一些这些基团可避免或限制这种情况；聚合后通过去保护将恢复阵列中捕获剂的功能和效用，即，聚合后去封闭能使捕获剂采取其天然构象。这种封闭/去封闭有共价或非共价方式。例如，当使用抗体作为捕获剂时，可将能与聚合物交联的抗原识别位点与不能交联的肽(或其它表位模拟分子)一起培育，然后再与前聚合物混合。这种肽或表位模拟分子将在聚合过程中保护抗原识别位点使其不与反应性异氰酸酯基偶联。聚合后，通过例如简单接触pH 3.0的酸，这种肽即可从抗体释放下来，从而再次接触抗体的抗原识别位点。类似的机制可用来保护捕获剂上选择性的巯基或氨基；可采用熟知的这些机制可逆性化学衍生在聚合过程中保护这些官能团。
这种水凝胶聚合物适合固定除上述捕获剂之外的多种其它捕获剂，其中包括但不限于诸如合成分子的材料、药物、非肽类受体配体、有机/无机混合物如金属卟啉、以及无机材料如沸石。例如，可根据捕获剂与分析物之间的特异性相互作用，使用这种捕获剂螯合溶液中的化合物。
非生物化合物如三价或四价金属螯合剂，例如亚氨基二乙酸或次氮基三乙酸，具有合适的氨基衍生的C4-C8接头，也可作为中间捕获剂在聚合之前或聚合期间固定在水凝胶中。理想的捕获剂(例如蛋白质)优选是合成的或经修饰使其含有多个组氨酸的序列，该序列可位于蛋白质尾部或头部的末端，然后通过与二价或三价金属离子如Cu++或Fe+++，金属离子与这种末端残基螯合从而使蛋白质连接到固定的螯合剂而物理固定在水凝胶内，接触而固定于生物芯片的各微斑点上。通过使各微斑点接触特定捕获剂(例如不同的蛋白质捕获剂)，可形成用于分析的稳定的蛋白质芯片。在制造这种聚合物微斑点时采用中间试剂的一个好处是能更好地确保避免特别敏感的蛋白质可能的变性，从而保持最终捕获剂蛋白质的构象和构型不改变。同时，使用同一螯合剂来产生特定蛋白质微阵列中的各个微斑点或小室，然后在其上连接捕获剂能简化制造工艺。
该系统的所有反应优选包括形成强脲键或氨基甲酸酯(caramate)键，即(1)用蛋白质探针直接衍生或用中间试剂衍生水凝胶前聚合物，(2)使水凝胶聚合，和(3)将衍生的水凝胶结合到基材表面。这些键使微斑点阵列具有机械完整性并显著提高了生物芯片的半衰期。
通常优选在水凝胶微斑点聚合之后将捕获剂加载到水凝胶上，有时，简单扩散对实现该目的可能无效。迅速扩散入水凝胶的小分子随后易于扩散逸出水凝胶，造成这些结合物质的损失。因此，当使用这种易扩散的试剂如小分子和肽时，优选在该试剂扩散入基质后将其共价偶联到聚合基质。一种实现该目的的优选方法是利用适合进行交联的物质，例如光激活交联剂或化学交联剂，它们含在聚合物中作为其组成的一部分或者与扩散入聚合物的小分子连接。
相反，较大的捕获剂如蛋白质或DNA的较大节段不能通过被动扩散有效迁移入水凝胶基质中。为促进较大物质扩散入基质，可以施加电场以控制蛋白质等带净电荷的物质在pH值不同于该蛋白质等电点的溶液中迁移；该过程称为“电泳”。如果水凝胶微斑点位于荷电物质的迁移途径中，荷电物质将承受除被动扩散力之外由所施加电场提供的额外作用力，加速其插入水凝胶微斑点中。这种电场辅助扩散的一个优点是，这些较大的捕获剂在随后的测定步骤中不易被动扩散逸出水凝胶基质。
因此，可用试剂处理水凝胶微斑点没占据的基材表面以降低随后测定试剂、靶分子或其它此类材料与基材表面的不需要的非特异性附着。当测定试剂有可能非特异性结合表面因此增加从表面观察到的背景信号量、从而降低水凝胶微斑点对于这种测定目的的效率时这种处理被认为是重要的。处理暴露的表面区域包括施加激活的聚乙二醇聚合物、牛血清白蛋白和其它此类封闭剂。本发明不需要该步骤；然而，如果需要的话也可使用该步骤。
聚合到基材并保持水合的水凝胶微斑点优选至少约20μm厚，更优选至少约30μm厚，最优选至少约50-100μm厚。当缓慢发生脱水时在所有方向上皱缩；然而当再水合时将基本返回原始体积。水凝胶形成的微斑点的形状通常为椭圆形，不同于之前用于某些系统的方形凝胶小室。这种总体较大的尺寸使得显著量的捕获剂可固定到凝胶微斑点内，从而降低生物芯片的检测下限并有利于其使用。通过降低聚合物溶液的粘度并对之前用来在生物芯片基材上微打点的分散机制进行适当改进，可制造较小的各微斑点从而得到密度非常高的生物芯片阵列。如果采用具孔基材，则将微斑点沉积在孔底之上。
形成3D微点生物芯片后，为将不同捕获剂固定在聚合水凝胶微斑点的孔内，使微阵列接触溶液，通常是含有大小为能够结合固定在多孔水凝胶材料内的捕获剂的靶物质水溶液。在发生结合所需温度下维持与含有分析物的溶液接触足够长时间；所述时间可称为孵育期。根据所述测定，发现许多试剂(如夹心测定中的第二抗体)可以是“粘性蛋白质品种(sticky protein variety)”，即能够粘到或结合到基材自身(如玻璃)的蛋白质。一旦发生粘附即可提供可检测信号，例如当引入Cy3标记的TSA(tyramide信号扩增)时，TSA不仅与多孔水凝胶中(与探针结合)的靶分子的第二抗体结合，而且与粘到玻璃的第二抗体结合。当这种情况发生时，当用激光扫描仪对荧光标记成像来测量微阵列产生的信号时玻璃就会产生高背景噪声。当分析物溶液含有可被捕获剂螯合同样倾向非特异性附着于玻璃或其它基材的标记蛋白时也会发生类似情况。
已经发现直到已经通过孵育步骤完成测定过程实质上可以忽视这种将干扰阅读微阵列的产生背景噪声的趋势，所述孵育步骤采用含有溶解的和/或悬浮的分析物的溶液。孵育和/或标记之后并在阅读之前对微阵列进行一步洗涤操作，该操作包括用合适的消化剂有效除去微阵列表面各微斑点外的非特异性结合靶分子或者至少除去靶分子的标记部分。所用消化剂应不影响已特异性结合于多孔水凝胶微斑点内的捕获剂。
消化剂可作为涂层结合到微球或微小固体颗粒等，微球或微小固体颗粒的尺寸足够大以阻止它们进入多孔水凝胶微斑点，这将在下文更加详细地描述。基于分析物液体中的物质组成，尤其基于那些具有最大非特异性结合于或粘于基材表面的趋势的组分选择要使用的消化剂。例如，当分析物是蛋白质时可用消化酶(即蛋白酶)作为消化剂；当分析物是细胞裂解液(即细胞膜碎片)时消化剂可以是溶酶体酶。蛋白酶可以是内肽酶，如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，或者可以是外肽酶，如羧肽酶。
当使用蛋白酶时通常基于以下两个特征进行选择1)能否消化分析物溶液中的抗体，和2)它们的最佳工作温度和pH范围。基于这些有三种蛋白酶通常是优选的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，它们切割抗体的重链且对任何类型的蛋白质无特异性，以及蛋白酶K，该酶用于全面消化蛋白质，它切割肽键并催化肽酰胺水解。这些蛋白酶的工作温度范围约为25-37℃，最佳pH约为2-8；更具体地木瓜蛋白酶，RT和pH＝6；胃蛋白酶，RT和pH＝2；蛋白酶K，37℃和pH＝7.5。这些温度和pH值与许多蛋白质的工作环境非常相容且不会造成它们变性。
消化剂附于大分子或固体颗粒；例如，金颗粒、有机微球、枝状聚合体(dendrimer)或者甚至可使用大的蛋白质复合物，只要其大小能够阻止进入多孔水凝胶微斑点内部。优选颗粒的大小至少为1微米，且优选颗粒的大小不超过约50微米，以便充分有效地消化基材表面的非特异性结合物质。可购得这种大小范围的由琼脂糖制得的微球而方便地使用。可用木瓜蛋白酶或用胃蛋白酶或用蛋白酶K涂布这种微球，上文提及了这三种优选的蛋白酶。如果测定中可能有可能非特异性附着于基材表面或者可能导致抗体和其它蛋白质结合于基材的完全不同的抗体，则可用不同消化剂进行随后的第二次洗涤；然而，预计一次一步洗涤步骤通常就足够了。或者，用不同蛋白酶涂布的微球也是作为一步洗涤的一部分。
洗涤优选搅拌适当时间，以使蛋白酶接触和消化蛋白质性物质。通常洗涤约1-90分钟，常洗涤约30分钟。
洗涤完成之后任选地用洗涤缓冲液冲洗微阵列；然而，在多数情况下这种冲洗不是必需的。消化的蛋白质性物质被洗涤液携带出来，同时微颗粒也被从微阵列表面除去。洗涤和任选的冲洗完成之后，如果分析物液体中的潜在靶分子上已不存在将提供可检测信号的尾基团(tag)，则用这种尾基团标记此微阵列。
标记(或尾基团)用来指可连接于靶分子或分析物以使其能被检测和/或量化的取代基。其例子包括放射性标记，如32P、33P和35S；显色指示剂，如荧光化合物、化学发光化合物或有色化合物；配体，如生物素；以及可通过质谱或其它光谱特征区分的化学基团。更加具体的合适标记的例子包括黄嘌呤染料、罗丹明染料、萘胺(naphythylamine)、苯并二唑(benzoxadiazole)、芪、芘、吖啶、花青3(Cy-3)和花青5(Cy-5)。标记优选可作为分析物的一部分引入，例如作为引物的一部分直接掺入核酸，或者可通过化学反应或酶反应加入蛋白质或其它分析物。这种标记可包含可检测信号或者可包含提供可检测标记的底物随后将与其杂交或退火的中间配体。可在这种洗涤步骤之前或之后加入将提供可检测信号的物质。
洗涤和任选地用合适的含有缓冲剂的溶液冲洗之后阅读微阵列。如果所含可检测信号具有荧光性质，则用激光扫描仪或一些类似装置对微阵列进行荧光成像。如果使用不同类型的比色标记或者如果使用放射性标记或一些其它已知类型中的一种，则用合适的扫描仪/检测仪来测量微斑点的信号。
以下实施例提供了目前已知的执行本发明的最佳模式；然而，这些实施例只是为了阐述而不是要以任何方式限制本发明的范围，本发明的范围由说明书随后出现的权利要求书限定。
实施例1.生物芯片上的蛋白质-DNA相互作用该实施方案中，先使单链DNA连接于水凝胶微斑点，然后通过杂交形成有效螯合靶蛋白的双链捕获剂。
将含130μM浓度的5’氨基修饰的单链细菌λ阻抑物结合序列OR2OR1(wt)及其在结合位点携带单个碱基突变的变体(mut)3.75％HYPOLTM PreMA G-50聚氨基甲酸酯前聚合物中印刷到氨基硅烷化(aminosilanated)的载玻片上。为验证本发明系统的除去能力，使四种不同类型的蛋白质系统血纤蛋白原、细胞裂解物、IL-5和NFkB，四种蛋白质系统各自的匹配第一抗体和第二抗体分别结合到玻璃表面。将玻璃的印刷侧放入各密封杂交室内与它们相应的互补序列(1μM，用3x SSC，0.1％TritonX-100，5mM MgCl2配)45℃杂交18小时。然后在水溶液中孵育所得双链DNA和用结合缓冲液(50mM Tris.HCl(pH 7.6)、100mM NaC1、1mM CaCl2、0.1mM EDTA、0.1mg/ml BSA、2.5μg/ml聚(dA-dT)、0.05％Tween 20、1mM DTT)配的1.5μg/ml Cy3标记的噬菌体λ阻抑物λCI，所述水溶液中含有分别结合到玻璃表面的蛋白质系统血纤蛋白原、细胞裂解物、IL-5和NFkB，以及与四种蛋白质系统各自匹配的第一抗体和第二抗体；室温孵育2小时。在孵育结束时除去Cy3标记的λCI，这种载玻片样品分别用含有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K包裹的1微米琼脂糖微球的液体洗涤。在约27℃，pH约7时洗涤30分钟。各载玻片然后用结合缓冲液简单冲洗，再用DI H2O冲洗。各载玻片然后加入Cy3标记的TSA如果存在第二抗体将与之结合；然后通过GSI激光扫描仪成像。不同载玻片上的双链DNA用SYBR金(MolecularProbe)按照制造商方法染色，并通过GSI激光扫描仪观察其总DNA含量。
在相应的微斑点中得到荧光信号显示了Cy3标记的λ阻抑物与其天然操纵子dsDNA序列的结合。某些突变体斑点中不存在强荧光说明这种相互作用是序列特异性的。将印刷载玻片的SYBR金(双链DNA链)染色的荧光与λ阻抑物的Cy3荧光比较证实这是一种序列特异性的λ阻抑物-λ操纵子相互作用，任何非特异性蛋白质结合到不均匀印刷的DNA不会得到与野生型OR2OR1序列相关的Cy3信号。结合到野生型序列与结合到突变体序列之间的信号强度相差百倍，这证实了与固定在水凝胶基质内的双链DNA反应的特异性。微斑点周围的载玻片区域不存在显著信号显示了蛋白酶包裹的微球在不影响微斑点内的复合物时除去非特异性结合的蛋白质的功效。
实施例2.抗原-生物芯片该实验采用水凝胶基质平台作为捕获剂来固定抗原。抗体-抗原相互作用通常被用于各种生物测定，该测定的必需特征是要固定其中一组分(抗体或抗原)。
采用实施例1所述的方法，将蛋白质抗原，即人运铁蛋白(0.2mg/ml)以在含有5％海藻糖、2mg/ml BSA的3.3％的水凝胶中的不同稀释度直接固定于在胺涂布的玻璃载玻片上。为测试本发明，将IL-5吸引到玻璃表面从而使其结合到载玻片上。
将载玻片与含不同浓度抗-人运铁蛋白的小鼠腹水液一起培育1小时。培育之后，载玻片先用含有木瓜蛋白酶涂布琼脂糖微球的液体在25℃，pH 6洗涤30分钟，然后用PBST洗涤3次，每次10分钟。通过将载玻片与Cy3标记的驴抗小鼠IgG和Cy3标记的IL-5抗体一起培育然后通过激光扫描仪成像来显现结合的小鼠抗-运铁蛋白抗体。在三个数量级稀释度即0.1-0.001观察到呈线性剂量反应，这种剂量反应关系表明固定在水凝胶基质内的抗原具有功能，和水凝胶基质的渗透性能支持抗体连续扩散入该基质(这是整个测定方法的一部分)。微斑点周围的载玻片区域不存在显著信号显示了蛋白酶涂布的微球在不影响微斑点内的复合物时除去非特异性结合的蛋白质的功效。
实施例3.抗体-生物芯片在该实施例中，与固定抗原不同，而是将抗体固定在水凝胶基质内。
按照实施例1的方法，在存在5％海藻糖、2mg/ml牛IgG和0.5％甘油时将抗-人运铁蛋白、抗-BSA和抗-PSA抗体(0.4-0.8mg/ml)固定在氨基硅烷化玻璃载玻片上的3.3％水凝胶中。使载玻片接触血纤蛋白原水溶液中以使其非特异性结合到玻璃基材，然后与Cy3标记的各种抗原(浓度为1mg/ml，在含有1％BSA的PBST中)和Cy3标记的血纤蛋白原抗体室温孵育过夜。先用含有木瓜蛋白酶涂布的琼脂糖微球的液体在25℃，pH 6洗涤30分钟，然后用PBST冲洗，之后通过激光扫描仪成像可视化结合的蛋白质。微阵列的相应抗体位置上存在标记的靶蛋白表明水凝胶基质中保留有抗体功能性。微斑点周围的载玻片区域不存在显著信号显示了蛋白酶涂布的微球在不影响微斑点内的复合物时除去非特异性结合的蛋白质的功效。
实施例4.多层ELISA测定支持更复杂的结合相互作用的能力也是水凝胶基质的一个所需特征，在该实施例中，水凝胶微斑点中固定的抗体为第一结合物质。随后加入其抗原显示特异性定位。
NFkB单克隆捕获抗体被直接固定在含有5％海藻糖、2mg/ml牛IgG的3.3％水凝胶中以在氨基硅烷化的玻璃载玻片上形成微斑点。将载玻片与小鼠NFkB抗体在水溶液中适当混合室温孵育1小时。用PBST冲洗两次(每次15分钟)后将载玻片与生物素化的大鼠单克隆抗-小鼠IgG抗体(BD，Pharmingen)室温孵育1小时。用PBST洗涤15分钟除去游离抗体。载玻片然后用含有胃蛋白酶涂布的1微米琼脂糖微球的液体在室温(RT)和pH 2时洗涤30分钟，然后用PBST冲洗两次。随后在载玻片上加入辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素，再在室温孵育1小时。按照推荐方法用链霉亲和素-HRP充分洗涤后在载玻片上加入TSA试剂系统的Cy3-tyramide基材以使载玻片完全覆盖所有印刷的斑点。洗去未反应的基材后，通过激光扫描仪成像分析载玻片。荧光信号提高8倍说明存在被水凝胶内的锚定抗体结合的抗原。微斑点周围的载玻片区域不存在显著信号显示了蛋白酶涂布的微球在不影响微斑点内的复合物时除去非特异性结合的蛋白质的功效。
实施例5.多层小分子介导的(CaM/神经钙蛋白)相互作用以下实施例证实了由小分子介导的多蛋白相互作用。按照实施例1的方法，分别将小鼠抗牛脑神经钙蛋白单克隆抗体(0.4mg/ml，Sigma)、羊抗牛钙调蛋白抗体(0.2mg/ml，Chemicon)和对照牛IgG(0.4mg/ml)直接固定在胺涂布玻璃载玻片上的含有5％海藻糖和2mg/ml牛IgG的3.3％水凝胶中。载玻片随后与0.1mg/ml牛神经钙蛋白在20mM HEPES(pH 7.6)、130μM KCl、0.1％Triton X-100、10μg/ml聚谷氨酸(配制)水溶液中孵育过夜。在存在1mM CaCl2或5mM EDTA(用PBST，1％BSA配制)时使Cy3标记的鸡钙调蛋白与神经钙蛋白处理的载玻片室温结合1小时。载玻片然后用含有胃蛋白酶涂布的1微米琼脂糖微球的液体在室温(RT)和pH 2时洗涤30分钟，然后用PBST冲洗两次。结合的钙调蛋白通过激光扫描仪成像在Cy3激发和发射波长光显像。抗神经钙蛋白抗体位置的信号强度在存在钙时比不存在钙时高6倍，说明水凝胶基质支持复杂生物分子相互作用的能力涉及蛋白质和小分子，并进一步说明这种能力不受蛋白酶处理的影响。微斑点周围的载玻片区域不存在显著信号显示了蛋白酶涂布的微球在不影响微斑点内的复合物时除去非特异性结合的蛋白质的功效。
实施例6.生物芯片上α-2-巨球蛋白-胰蛋白酶的相互作用(基于电场加载)α-2-巨球蛋白是一种特异性结合和中和蛋白酶的循环血液中的大血浆蛋白质(mw800,000)；这是保护身体免遭过量蛋白酶活性的机制，实质上可以防止身体自我“消化”。α-2-巨球蛋白和蛋白酶(如胰蛋白酶)之间的结合非常强，已经利用固定到琼脂糖珠的α-2-巨球蛋白来亲合纯化胰蛋白酶和其它蛋白酶。
在胺衍生的玻璃上点上三组水凝胶微滴；未采取任何努力来封闭荧光素标记的蛋白质的其它非特异性结合。水凝胶微斑点各自包含异氰酸酯官能化HYPOLTMPreMAG-50聚氨基甲酸酯前聚合物，通过加入水溶液引发聚合，并通过pH和温度控制聚合动力学。第一组水凝胶微斑点加载有α-2-巨球蛋白，采用50μL浓度为5mg/mL的PBS水溶液。α-2-巨球蛋白的高分子量限制其迅速扩散入水凝胶微斑点，采用小电极系统提供的温和电流(2.5-5mV)提高扩散速率。一旦α-2-巨球蛋白扩散入水凝胶微斑点，它的大分子量随后能防止它从微斑点显著扩散逸出。用铁蛋白来提供阴性对照蛋白质，已知铁蛋白不结合胰蛋白酶。采用相同电极系统和相同条件的温和电流以类似方式将铁蛋白扩散入第二组水凝胶微斑点。第三组微滴不含任何蛋白质，作为另一阴性对照。
然后使所有三组微斑点接触FITC标记的胰蛋白酶约15分钟，并用1％BSA-PBS，pH 7.4冲洗约5分钟。载玻片然后用含有胃蛋白酶涂布的1微米琼脂糖微球的液体在室温(RT)和pH 2时洗涤30分钟，然后用PBST冲洗两次。用CCD照相机测量荧光强度。微斑点周围的载玻片区域不存在显著信号显示了蛋白酶涂布的微球在不影响微斑点内的复合物时除去非特异性结合的蛋白质的功效。
结果说明，FITC标记的胰蛋白酶特异性结合水凝胶微斑点内的它的天然配体α-2-巨球蛋白，而对阴性对照蛋白铁蛋白和水凝胶自身或者对玻璃基材都几乎没有可检测的结合活性。
尽管已经参照不同实施方案描述了本发明，其中包括发明者目前预期的最佳方式，但应理解，精通本领域的技术人员显然可作出各种变化和改进而不超出本发明的范围，本发明的范围在附带的权利要求中列出。例如，尽管使用了特定的荧光团如FITC和Cy3，但也可使用其它荧光团或其它报告分子或可检测信号。尽管使用具有多个携带不同捕获剂的微斑点的生物芯片有诸多优点，但在某些情况下也可能需要使用仅携带一种捕获剂的生物芯片。
权利要求
1.一种测定待分析样品中一种或多种靶分子的存在的方法，所述方法包括提供具有上表面的基材，在所述表面附加多个三维多孔水凝胶微斑点，在所述多个微斑点的各孔内提供不同捕获剂而在所述表面形成微阵列，使所述微阵列接触含有靶分子的溶液，靶分子的大小能结合所述多孔水凝胶微斑点内的所述捕获剂，所述接触后用含有消化剂的液体洗涤所述微阵列，除去所述表面上的非特异性结合靶分子或至少其标记部分，而不影响与所述多孔水凝胶微斑点内捕获剂特异性结合的靶分子，如果在所述结合时所述靶分子不含标记，则在所述洗涤之前或之后使标记与所述靶分子连接，和测定所述洗涤后的微阵列以检测结合在特定微斑点内的标记靶分子产生的信号。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶分子是蛋白质。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶分子是抗体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶分子是抗原。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化剂作为涂层结合于微球或微小固体颗粒。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化剂作为涂层结合于枝状聚合体，该聚合体的大小阻止其进入所述多孔水凝胶中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化剂作为涂层结合于大小超过1微米的蛋白质复合物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上表面是固体表面。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获剂是蛋白质。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获剂是抗体。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提供所述捕获剂的方法是通过将结合物质固定在所述多孔水凝胶微斑点内，然后使所述不同捕获剂的水溶液扩散进入所述多孔水凝胶微斑点内而使捕获剂附着于所述结合物质。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述结合物质是NFkB转录因子。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该方法中使第一抗体与所述NFkB结合，然后使第二抗体与所述第一抗体结合。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该方法中使提供荧光信号的标记与所述第二抗体结合。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，如果在所述结合时所述靶分子不含标记，则在所述洗涤之前或之后使提供可检测信号的标记与所述靶分子连接。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述消化剂是外肽酶。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述消化剂是内肽酶。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述消化剂是蛋白酶K。
全文摘要
采用一种孵育后处理方法能有效除去结合测定中可能与微阵列基材非特异性结合的靶分子(如蛋白质/蛋白质复合物)或其它带有标记的分子。孵育后用含有消化剂如消化酶(蛋白酶)或溶酶体的液体进行一步洗涤，所述消化剂能有效除去基材上的非特异性结合靶分子或至少该靶分子的标记部分。使蛋白酶结合或涂布在大分子或固体颗粒，颗粒的大小阻止它们进入3D水凝胶微斑点的多孔表面，因此不能到达和消化沉积在这种多孔水凝胶微斑点内的标记的靶分子－探针复合物。蛋白质被消化的含有标记的节段(或基本上全部蛋白质)被洗涤液带走因此在摄像时不产生背景噪声。
文档编号G01N33/543GK101027559SQ200580028345
公开日2007年8月29日 申请日期2005年8月11日 优先权日2004年8月19日
发明者Y·法尔科维茨格拉斯, P·钦伯格 申请人:生物概念股份有限公司