专利名称：：液相色谱－离子阱质谱联用检测食用植物油中叔丁基对苯二酚的方法
技术领域：
：本发明涉及食品安全检测，特别是涉及在进出口贸易及食品安全监督管理过程中，运用液相色谱—离子阱质谱联用仪检测食用植物油中的合成酚类抗氧化剂叔丁基对苯二酚(tertiarybutylhydroquinone，TBHQ)的方法。
背景技术：
：食用植物油在生产、加工和储存的过程中，通常会添加合成酚类抗氧化剂如叔丁基羟基茴香醚(ButylatedHydroxyanisole，BHA)、二叔丁基对甲酚(BulylatedHydroxytoluene，BHT)、没食子酸丙酯(PropylGallate，PG)及叔丁基对苯二酚等以阻缓其氧化变质。目前应用最为广泛的是TBHQ(图1)。美国于1972年批准使用TBHQ。FAO/WHO(1995)对其暂定的每日允许摄入量(acceptabledailyintake，ADI)为0～0.7mg/kgbodyweight，允许使用在26种类食品中，最大理论摄入量(theoreticalmaximumdailyintake，TMDI)为200mg/kg。我国于1991年批准使用，国家食品添加剂使用卫生标准规定(GB2760-1996)最大使用限量为200mg/kg，允许在食用油脂、油炸食品、饼干、干果罐头等9种食品中使用。然而，近年来对于TBHQ的毒理学评价结论仍存在很大争议，欧盟、日本等国家认为其毒理试验资料不完善，尚不允许在食品中使用。食用植物油是人类膳食基础营养素的主要来源之一。在从对合成抗氧化剂的逐步认识过程中，人们对其安全性越来越有疑虑，在选择食用植物油时，都希望挑选没有合成抗氧化剂的产品，要求食品监督管理部门加强对市售产品中TBHQ的检测。此外，在对外食品贸易中，由于贸易双方国家食品卫生标准的差异，TBHQ的含量也往往是严格要求进行检测分析的指标。例如，2004年我国对日出口食品有7批因检出TBHQ不合格，如果日本厚生劳动省实施新的检测方法(检出灵敏度1ppm)，将会有更多的不合格批次。然而，我国目前尚没有食用植物油中TBHQ的标准检测方法，现行的检验检疫行业标准SN/T1050-2002“进出口油脂中抗氧化剂的测定—液相色谱法”对TBHQ的检出限为2ppm。因此，在我国建立快速、准确、灵敏度高的TBHQ标准检测方法也迫在眉睫。目前，样品前处理方法主要包括直接的有机溶剂萃取、固相萃取和衍生化。三种样品前处理方法各有利弊。直接的有机溶剂萃取法操作简单，但杂质干扰严重。固相萃取法和衍生化法虽然选择性好，但处理步骤往往较为复杂，耗时长。此外，这些样品前处理方法往往包含浓缩步骤，占去了整个检测分析过程的大部分时间。而进行定量检测的方法，主要包括液相色谱法和气相色谱法。这些分析方法的选择性不够好，为使组分与杂质能很好地分离，分析时间往往超过20min。例如，对于液相色谱来说，通常需要采用耗时的梯度洗脱法；而对于气相色谱来说，则需要通过程序升温来实现组分的分离。此外，这些分析方法的灵敏度不够高，检出限都是ppm级，不能满足目前的检测要求。液相色谱/质谱联用技术的研究开始于20世纪70年代，将针对沸点高、极性强、热不稳定化合物分离的液相色谱和灵敏度高、检出限低、能提供化合物结构信息的质谱串连在一起。离子阱质谱仪(ITMS)是20世纪80年代发展起来的一种新型质谱仪，具有体积小，结构简单，与外部各种离子源兼容性好，离子存储时间长和质量选择存储等特点。目前，液相色谱/离子阱质谱联用已发展成为一种重要的分析技术，在食品药物、环境化学、生物化学等许多研究领域中的应用已逐渐展开，但应用于合成酚类抗氧化剂检测上尚没有文献报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中不足之处，而提供一种简化样品前处理步骤、缩短分析时间和降低检出限的检测食用植物油中TBHQ的方法。本发明目的可以通过如下方法来实现本发明检测食用植物油中的TBHQ的方法，是食用植物油经萃取、离心分层后，移取上层萃取液，重复萃取2～3次，合并的萃取液经离心分层后移取上清液至进样小瓶，在色谱柱为C18柱，流动相为甲醇/水，电喷雾(ESI)离子源，负离子模式的液相色谱—离子阱质谱联用分析条件下，利用二级质谱主要碎片离子m/z149对TBHQ进行定量检测。具体步骤如下首先，移取0.1～0.3mL食用植物油于玻璃离心管内，加入1.5～2.5mL乙醇，于微型混合器上振荡萃取3～5min后经3000～4000r/min离心4～8min，移取上层萃取液至玻璃离心管内，重复萃取2～3次，合并萃取液，经3000～4000r/min离心4～8min后移取上清液至进样小瓶；然后，在色谱柱为C18(2.1mm×150mm，0.5μm)，柱温25～35℃，流动相为甲醇/水，流速0.15～0.40mL/min，进样体积5～20μL，检测波长280nm，电喷雾离子源，负离子模式，雾化气(氮气)30～40psi，干燥气(氮气)8～12L/min，160～280℃，破碎电压1.6～1.8V(破碎截止值m/z80)，质量扫描范围m/z50～300的液相色谱—离子阱质谱联用分析条件下，利用二级质谱主要碎片离子m/z149对TBHQ进行定量检测。可用作萃取剂的有机溶剂文献报道有很多，如乙腈、甲醇，石油醚、乙醇等，由于相对于其他有机溶剂，乙醇无毒、来源广泛、价格低廉，因此，本发明优选乙醇作为萃取剂。能否通过液相色谱—质谱联用技术，实现降低检出限、增强选择性、缩短分析时间的目的，关键在于质谱条件的优化选择，如雾化气压力、干燥气的流速和温度、破碎电压等。雾化气(氮气)经雾化针以一定压力进入样品流中，使经液相色谱分离的组分得以雾化。雾化气的压力是影响雾化效果和样品流稳定的重要因素。雾化气压力太低不能满足样品的雾化要求，过高则造成样品流的不稳定而影响检测效果，适于本发明的雾化气压力是30～40psi。干燥气(氮气)用以实现样品的去溶剂化，干燥气的流速和温度是影响样品去溶剂化效果的主要因素。干燥气流速越大，去溶剂化效果越好，在检测效果较优的情况下，为节省氮气，适于本发明的干燥气流速是8～12L/min。干燥气温度过低，样品的去溶剂化效果不理想；干燥气温度过高，则往往造成样品分子的热分解。适于本发明的干燥气温度是160～280℃。多级反应质谱(MRM)模式下，破碎电压影响二级质谱检测的重要因素。破碎电压值过低，母离子m/z165不能很好地得以破碎，形成的碎片离子丰度低；破碎电压值过高，母离子m/z165完全破碎，但碎片离子m/z149不能稳定驻留在离子阱中，致使检测到的碎片离子丰度不高。适于本发明的破碎电压是1.6～1.8V，此时大部分母离子已破碎，并且形成的碎片离子峰面积最大。本发明经大量实践证明，采用液相色谱—离子阱质谱联用方法，以乙醇为萃取剂，线性范围0～4542.5μg/L，R2＝0.9990，检出限为0.3mg/kg，定量限为1mg/kg，回收率可达81.9％～109.6％，相对标准偏差≤5.3％，与现行的检验检疫行业标准SN/T1050-2002“进出口油脂中抗氧化剂的测定—液相色谱法”(TBHQ的检出限为2mg/kg)相比，该方法完全能够满足检测要求，并且该方法可通过增大进样量的方式进一步降低方法的检出限。本发明与现有技术相比具有如下优点首先，TBHQ离子阱二级质谱检测的选择性好，降低了对于液相色谱组分分离效果的要求，10min内即可完成检测。其次，TBHQ离子阱二级质谱检测的灵敏度高，使得样品的前处理过程省去了耗时的浓缩步骤。这两点保证了TBHQ的整个检测方法拥有液相色谱法和气相色谱法不可比的低检出限、简单的样品前处理和大大缩短的分析时间，这是该方法的特点。第三，以乙醇作为萃取剂回收率高，且乙醇无毒、成本低廉、易于获取。图1-a是TBHQ二级质谱萃取离子流图、图1-b是质谱图及图1-c是质谱裂解方式图2是TBHQ的化学结构式具体实施例方式下面结合附图，列举1个实施例，对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于这个实施例。移取0.2mL食用植物油于10mL玻璃离心管内，加入2mL乙醇，于微型混合器上振荡萃取5min后经4000r/min离心5min，移取上层萃取液至10mL玻璃离心管内，重复萃取3次，合并萃取液，经4000r/min离心5min后移取0.8mL至1.5mL进样小瓶进行液相色谱/离子阱质谱联用分析。TBHQ的液质联用分析条件如下。[色谱条件]色谱柱为ZORBAXEclipseXDB-C18(2.1mm×150mm，0.5μm)；柱温35℃；流动相为甲醇/水(50∶50)，流速0.4mL/min；进样体积5μL；检测波长280nm。[质谱条件]电喷雾(ESI)离子源；负离子模式；母离子m/z165；主要碎片离子m/z149；雾化气(氮气)30.0psi；干燥气(氮气)10.0L/min，160℃；破碎截止值m/z80；破碎电压1.7V；质量扫描范围m/z50～300。TBHQ的含量根据二级质谱主要碎片离子m/z149的标准曲线线性范围(0～4542.5μg/L，R2＝0.9990)求得。食用植物油中TBHQ的浓度按下式计算本发明对10种北京市售食用植物油进行检测分析(表1)，回收率为81.9～109.6％，相对标准偏差(RSD，％)≤5.3，完全可以满足定量分析的要求。表110种食用植物油中TBHQ的检出浓度权利要求1.液相色谱—离子阱质谱联用检测食用植物油中叔丁基对苯二酚的方法，其特征在于食用植物油经萃取、离心分层后，移取上层萃取液，重复萃取2～3次，合并的萃取液经离心分层后移取上清液至进样小瓶，在色谱柱为C18柱，流动相为甲醇/水，电喷雾离子源，负离子模式的液相色谱—离子阱质谱联用分析条件下，利用二级质谱主要碎片离子m/z149对叔丁基对苯二酚进行定量检测。2.根据权利要求1所述的检测食用植物油中叔丁基对苯二酚的方法，其特征在于萃取剂是乙醇。全文摘要液相色谱—离子阱质谱联用检测食用植物油中叔丁基对苯二酚(tertiarybutylhydroquinone，TBHQ)的方法。本发明以乙醇作为萃取剂，食用植物油经萃取后的上清液，在色谱柱为C18柱，流动相为甲醇/水，电喷雾(ESI)离子源，负离子模式的液相色谱—离子阱质谱联用分析条件下，利用二级质谱主要碎片离子m/z149对TBHQ进行定量检测。本发明优点是样品前处理简便、快捷，省去了繁琐耗时的样品浓缩过程，萃取剂无毒，检测的灵敏度高、选择性好、速度快。文档编号G01N30/38GK1815223SQ20061000189公开日2006年8月9日申请日期2006年1月25日优先权日2006年1月25日发明者郝鹏鹏,黄文,倪晋仁申请人:北京大学