专利名称：测量电离辐射的曝射剂量的方法
技术领域：
本发明涉及测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中通过利用生物化学反 应能够直接得知照射电离辐射或电;兹波对于活体的生物学影响。
背景技术：
对于电离辐射的曝射剂量的测量，通常使用由电离辐射引起的物理反应，
具体而言使用的是胶片辐射剂量计(film badge)、热致发光剂量计 (thermoluminescence dosimeter)、 携带式齐'J量计(pocket dosimeter)等(Actual Radiation Control for Chief, revised 2nd edition, p. 140, 1992， Japan Radioisotope Association)。
胶片辐射剂量计包含容纳以照相乳剂(photographic emulsion)涂覆的树脂 胶片(resin film)的箱(case),其中当照相乳剂曝露于电离辐射后，连同照相乳 剂的感光作用一起，显示与辐射剂量成比例的黑化作用(blackening action), 并且将这种感光作用用于测定电离辐射的曝射剂量。另一方面，热致发光剂 量计是利用以辐射照射的结晶材料加热后引起的发光(荧光)的剂量计，其中当 用电子辐射照射之后，结晶内的电子和电子空穴彼此分离，而在通过热刺激 相互再组合时，它们产生发光；通过这种发光原理测定电离辐射的曝射剂量。 此外，携带式剂量计是一种计量器，其中电离室内封入的气体根据施加于其 上的电离辐射剂量而电离，并且由电离引起的电流(electricity)测定电离辐射的 曝射剂量。
这些物理测量方法具有高可靠性和稳定性，操作花费低廉并且易于任何 人操作，但是存在以下问题
首先，在上述物理测量方法中，测量吸收入各种测量仪器内的辐射剂量 作为使用的电离辐射的剂量。然而，这种剂量与吸收入活体以直接影响活体 健康的辐射剂量是否一致是值得怀疑的，特别在低剂量范围内。
此外，与这个问题有关，上述物理测量方法仅用于测量施加于活体表面 的辐射剂量，因而无法测量已到达活体内部的照射剂量。例如，胶片辐射剂
量计对曝露于低透过性的"P伽玛射线有反应，然而这样施加的照射大部分会 因屏蔽材料如衣物而减弱。因此，通过上述物理方法测量的曝射剂量并不总 是反映活体实际受到曝射的辐射剂量。
更进一步而言，物理测量方法不能准确地反映在RBE (radiation biological effectiveness;辐射生物学效力)方面不同的辐射对于活体的影响。例如，对于 1 Gy的中子辐射和1 Gy的X射线，已知尽管对二者均指定1 Gy的相同剂量， 但是前者的生物学效力是后者的2至10倍。然而在上述物理方法中，二者显 示具有1 Gy的相同剂量。
众所周知，"有效辐射剂量"的概念存在于物理方法中并且是法律上采用 的。然而，为了校准"有效辐射剂量'，，应该在计算辐射的曝射剂量之前鉴定 辐射质(radiationquality)和曝露于辐射的组织。例如，为了检测辐射对于一个 人的影响，曝射剂量应该表示为根据器官的"组织加权因子"通过测定各组 织的曝射剂量得到的各组织曝射剂量的总和。然而，各器官权重和"组织加 权因子"中存在微妙的个体差异，因而由此测定的有效辐射剂量是否准确反
映辐射对于每个人的影响是存在疑问的。
此外，物理测量方法不能用于测量之前未装备测量i殳备如胶片辐射剂量 计的受试者。因此，在一般人偶然曝露于辐射的情况中，例如，在原子能事 故中的剂量不能直接测量，因而不可避免进行间接估计。
因此，在物理测量方法中，曝露在活体上的电离辐射的影响通过计算来 间接且不可靠地估计，而当存在曝露的可能性时，应该提前给受试者装备测 量设备如胶片辐射剂量计。
适当地参考附图，本发明的其它和更多的特征和优势将由以下的描述更 加充分地显示。
发明内容
根据本发明，提供以下方法
(1) 测量电离辐射的曝射剂量的方法，其包括如下步骤
(a) 从收集自活体的组织或血液提取蛋白质，和
(b) 测定提取的蛋白质中由胱天蛋白酶-l和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI 蛋白的至少一种产物的含量；
(2) 根据上述(l)项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中测定由胱天蛋
白酶-1降解的LyGDI蛋白的产物的含量和由胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋 白的产物的含量；
(3) 根据上述(1)或(2)项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中通过免疫 印迹方法测定由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白的产物的含 量；
(4) 根据上述(1)至(3)项中任一项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中 蛋白质提取自收集的胸腺(thymus)组织、骨髓(bonemarrow)组织、脾脏(spleen) 纟且织、肠上皮纟且织(intestinal epithelium tissue)或血)夜；
(5) 根据上述(1)至(3)项中任一项测量电离辐射的曝射别量的方法，其中 蛋白质提取自收集的胸腺；
(6) 根据上述(1)至(3)项中任一项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中 蛋白质提取自收集的血液；和
(7) 用于测量电离辐射的曝射剂量的试剂盒，其包含抗体，所述抗体用于 通过免疫印迹方法测定蛋白质中由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的 LyGDI蛋白的至少一种产物的含量，所述蛋白质从收集自活体的组织或血液 中提取。
电离辐射对于活体的影响之一是凋亡(apoptosis)，并且从很久以前已在胸 腺组织和其它组织中观察到由电离辐射照射引起的凋亡。已知肿瘤抑制基因 产物p53的功能涉及这种凋亡，并且在凋亡的诱导中，还涉及线粒体介导的 信号系统、其下游因子即胱天蛋白酶组(caspase gro叩)的蛋白酶及其伴随的 DNA分解酶的活化，并且细胞内多种分子的断裂和活化是由凋亡引起的。
就此而论，作为由上述胱天蛋白酶组切割的蛋白质之一，已知LyGDI蛋 白(因子，其为也称为GDI-D4、 RhoGDI2或RhoGDI(3的分子，并通过从Rho 家族的G蛋白释放GDP来抑制活化过程)在血细胞中以高水平表达。已知由 SEQ ID NO: 1代表的人LyGDI蛋白在位置19 (或由SEQ ID NO: 2代表的小 鼠LyGDI蛋白的位置18 )的天冬氨酸C末端侧的肽4定处具有胱天蛋白酶-3切 割位点，并且在位置55 (或小鼠LyGDI蛋白的位置54)的天冬氨酸C末端侧 的肽键处具有胱天蛋白酶-1切割位点，如
图1和图2所示。
本发明人广泛研究了 LyGDI蛋白和电离辐射之间的关系，结果他们发现 胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3由电离辐射的照射活化(参见Radiation Research. 162, pp. 287-295， 2004; Molecular Carcinogenesis, 39， pp. 206-220, 2004等)。
胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白产物的含量显示取决于电离 辐射照射剂量的特有变化，并且发现它们的降解模式(degraded pattern)依赖于 组织和血液而改变。基于这些发现完成了本发明。
根据本发明，辐射的曝射剂量能够基于从活体收集的蛋白质的结构改变
来测量。
具体而言，通过根据本发明的电离辐射曝射剂量的测量方法，可直接测 量电离辐射对于活体的影响，而无需预先具有测量设备。此外，胶片辐射剂 量计等在照射时不是必需的，所以即使在不太可能发生的将活体曝露于电离 辐射情况中，如在核燃料制造事故中，在原子能工厂的事故中，或核原料自 核武器等意外泄露的情况下，能够更准确地得知电离辐射对于活体的影响。
此外，相较于以白细胞变形数为基础的常规测量曝射剂量的方法，根据 本发明能够更准确地测量电离辐射的曝射剂量。另外，不能由白细胞的改变 来确定的非常低的曝射剂量同样能够根据本发明通过血液检查来测量。
附图简述
图1是显示人LyGDI蛋白结构的示意图。
图2是显示人LyGDI蛋白和小鼠LyGDI蛋白的氨基酸序列和胱天蛋白酶
-1和胱天蛋白酶-3切割位点的示意图。
图3显示从小鼠胸腺组织提取的蛋白质的免疫印迹结果。
图4示意性地显示小鼠胸腺组织曝露于照射的剂量，和由胱天蛋白酶-1
和胱天蛋白酶-3降解的产物含量的变化。
图5显示从小鼠骨髓组织提取的蛋白质的免疫印迹结果。 图6显示从小鼠脾脏组织提取的蛋白质的免疫印迹结果。 图7显示从小鼠肠上皮组织提取的蛋白质的免疫印迹结果。 图8显示从小鼠血液提取的蛋白质的免疫印迹结果。 图9显示从人外周血白细胞提取的蛋白质的免疫印迹结果。 图IO显示从人外周血白细胞提取的蛋白质的免疫印迹结果。
发明最佳实施方式
当将活体曝露于电离辐射时，由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的
LyGDI产物的模式依赖于曝射剂量而改变。基于此发现，本发明的特征在于 测量活体曝露于电离辐射的剂量。
具体而言，根据本发明测量电离辐射曝射剂量的方法包括如下步骤(a) 从收集自活体的组织或血液提取蛋白质，和(b)测定所提取的蛋白质中由胱天 蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白的至少一种产物的含量。以下将 详细描述相关事项。
(测量对象)
通过此方法测量电离辐射曝射剂量的对象不具体限定在以组成性表达 LyGDI蛋白的组织或血液为对象的范围。然而，考虑到容易发生胱天蛋白酶 分解反应，对象优选胸腺组织、骨髓组织、脾脏组织、肠上皮组织或血液， 其中胸腺组织是优选的，并且血液也可令人满意地用于测量。血液包括含有 胸腺衍生细胞(T细胞)的外周血。此外，待从中收集这些组织或血液的活体包 括哺乳动物活体例如小鼠、犬、猫、猪或牛，血液可收集自人，并且组织可 以收集自人死体。在血液之中，外周血能够容易地收集。因此，将外周血优 选用作待用于根据本发明测量电离辐射曝射剂量的血液。
(组织或血液的收集和蛋白质的提取)
从活体收集组织或血液能够通过常规方法进行；具体而言，组织能够通 过外科方法使用外科刀收集，而血液能够通过注射器的吸取收集并且随后通 过离心分离血细胞。蛋白质的提取也能够通过常规方法进行，具体而言通过 在緩沖液中悬浮组织或血细胞，并且用匀浆器或弗氏压碎器(French press)石皮 坏组织或细胞。就此而论，如有必要可将变性剂、抗氧化剂等添加至缓沖液； 并且可将破坏的细胞分散体(dismpted cellular dispersion)中的核酸例如DNA 和细胞膜中的脂肪去除。
(测定方法)
测定由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物(在本说明书中也分别 称作A55-LyGDI和A19-LyGDI)含量的方法可在能够特异性测定某种蛋白质的 含量的范围内不带任何具体限制地使用，并且所述测定方法具体而言是通过 使用抗原/抗体反应的方法，具体能够使用免疫印迹方法(Western印迹方法) 和ELISA方法。作为抗体，可使用对于LyGDI蛋白的抗LyGDI抗体和对于 由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的抗体。
现在，对LyGDI蛋白和由胱天蛋白酶降解的产物进行描述。
通过实例的方式描述人和小鼠来源的LyGDI蛋白。这些蛋白质的氨基酸 序列示于图2并且通过SEQ ID NOS: l和2表示。
LyGDI蛋白中的胱天蛋白酶-3切割位点在人的情况下是位置19天冬氨酸 C末端侧的肽键，或在小鼠的情况下是位置18天冬氨酸C末端侧的肽键。另 一方面，LyGDI蛋白中的胱天蛋白酶-1切割位点在人的情况下是位置55天冬 氨酸C末端侧的肽键，或在小鼠的情况下是位置54天冬氨酸C末端侧的肽 键。
因此，由胱天蛋白酶-3降解的人LyGDI蛋白产物的氨基酸序列通过SEQ IDNO:3表示；由胱天蛋白酶-3降解的小鼠LyGDI蛋白产物的氨基酸序列通 过SEQ ID NO: 4表示；由胱天蛋白酶-1降解的人LyGDI蛋白产物的氨基酸 序列通过SEQ ID NO: 5表示；并且由胱天蛋白酶-1降解的小鼠LyGDI蛋白 产物的氨基酸序列通过SEQ IDNO: 6表示。
在本文的说明书中，由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物包括具 有SEQ ID NOS: 3至6所示氨基酸序列的蛋白质，其中在SEQ ID NOS: 3至6 中将一个或几个氨基酸缺失、取代和/或添加，并且所述序列被胱天蛋白酶-l 或胱天蛋白酶-3降解。
当通过免疫印迹方法测定由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降解的产物的 含量时，可使用本领域已知的免疫印迹方法。具体而言，用含有变性剂例如 十二烷基硫酸钠(SDS)的緩沖溶液提取蛋白质，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳。在电泳完成之后，将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜、硝化纤维膜等上， 然后用抗LyGDI蛋白抗体等显现(visualize)，由此测定由胱天蛋白酶-1或胱天 蛋白酶-3降解的产物的含量。
当通过ELISA方法测定由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降解的产物的含 量时，可使用本领域已知的ELISA方法。具体而言，将抗LyGDI蛋白抗体等 结合至固相聚苯乙烯等，将蛋白提取溶液添加至其上，然后通过与酶标记的 抗体的反应来显现，由此测定结合至固相的由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3 降解的产物的含量。
就此而论，从降解LyGDI蛋白的观点看，将依赖于电离辐射照射剂量的 生物学反应分类为以下两个阶段(phase)。
一个阶段是在1 Gy或更高的剂量范围中观察到的阶段，胱天蛋白酶-3活 化伴有细胞内凋亡诱导信号的开启以产生A19-LyGDI。另 一个阶段是在更低
剂量范围观察到的阶段，其中检测不到凋亡诱导信号的开启，取而代之，不
存在A55-LyGDI。
如上所述，由胱天蛋白酶-1降解的产物的模式不同于由胱天蛋白酶-3降 解的产物的模式，所以在非常低剂量的电离辐射照射后，优选测定两种指标， 即由胱天蛋白酶-1降解的LyGDI蛋白产物的含量和由胱天蛋白酶-3降解的 LyGDI蛋白产物的含量，以准确地测量曝射剂量。
如实施例1-4和1-5所示，依赖于组织和血液的类型，存在由胱天蛋白酶 -1和胱天蛋白酶-3降解的任一种产物不存在的情况。此外，如实施例l-4所 示，存在以下情况，其中随着电离辐射的曝射剂量增加，在提取的蛋白质中 观察到全长LyGDI和A19-LyGDI的含量减少，而无A19-LyGDI含量的增加。
因此，为了更准确地测量电离辐射的曝射剂量，视情况而定，除了测定 提取的蛋白质中由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降解的产物的含量之外，优 选测定全长LyGDI的含量。
在本发明的说明书中，全长LyGDI包括，例如，包含SEQ ID NO: 1或2 所示的氨基酸序列的蛋白质，其中在SEQIDNO: 1或2中缺失、取代和/或添 加一个或几个氨基酸，并且所述序列含有胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3切割 位点。
在本发明中，可根据以下方法测定电离辐射的曝射剂量。
首先，制作示意图，所述示意图显示由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降 解的产物含量响应于电离辐射的曝射剂量的改变，如图4所示。然后，基于 所述示意图，通过Western印迹等测定收集自活体的组织或血液中由胱天蛋 白酶-1或胱天蛋白酶-3降解的产物的含量，并且测定电离辐射的曝射剂量。
在本发明的优选实施方案中，存在以下方法，其中当存在待用于测量电 离辐射曝射剂量的大量样品时，通过ELISA进行初步筛选，并且通过Western 印迹仅检测疑似曝露于电离辐射的样品中由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降 解的产物含量，由此测量电离辐射曝射剂量。
在本发明中，优选测定未曝露于电离辐射时和曝露于电离辐射之后两种 情况下，所提取蛋白质中由胱天蛋白酶-l或胱天蛋白酶-3降解的产物的含量。 然而，即使在未曝露于电离辐射时由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降解的产 物含量不能测定的情况下，仅仅通过测定曝露于电离辐射之后的降解产物的 含量，当含量的改变显著时，其样品也可为疑似受到电离辐射照射。
用于根据本发明测量电离辐射的曝射剂量的试剂盒包含抗体，该抗体用
于通过免疫印迹方法测定由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白 至少一种产物的含量。对抗体不作具体限定，只要其是用于免疫印迹方法中 并且相对于由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白至少一种产物
而产生。
将基于以下给出的实施例进行更详细的描述本发明，但不意味以这些实 施例限制本发明。
实施例
实施例1在个体小鼠水平的测试
实施例1-1
(X射线全身照射)
将七周龄的雄性小鼠(C57BL/6NCrj (商品名)，Japan Charles River)飼养在 常规环境下至8-9周龄，并用来自X射线发生器(Shin-ai Go (商品名)，200 kVp, 25 mA,由Shimadzu Corporation制造)的X射线(电离辐射)以0.6 Gy的照射剂 量率(exposure dose ratio)进行全身照射。通过改变照射时间来调节照射的量 (曝射剂量)。
(组织的收集和胸腺蛋白的提取)
用辐射照射之后，将各个小鼠解剖以收集胸腺组织，将收集的组织通过 外科刀切碎并用SDS样品緩沖液溶解以制备溶解的样品。SDS样品緩沖液由 5%甘油、25 mM Tris-HCl (pH 6.8)和1% SDS组成。
(电泳)
制备12%聚丙烯酰胺凝胶(分离胶>，并且将4%聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶) 铺于其上，将上述溶解的样品以每泳道20 jag的量上样，然后进行电泳(电泳 条件如下浓缩胶中的迁移电流是20 mA;分离胶中的迁移电流是40 mA; 所用电泳緩沖液(running buffer)是Tris-甘氨酸缓冲液)。电泳结束之后，将浓 缩胶切下，并且将分离胶使用转移緩沖液平衡5分钟(两次)。
就此而论，通过如下方法制备分离胶混合3 mL的40%丙烯酰胺储液 (stock solution)、 2.5 mL的Lower凝胶纟爰冲液(1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)、 0.4% SDS)、 4.5 mL的灭菌milli Q水、50 |iL的10%过硫酸铵水溶液和10 |_iL的 N,N，N，，N，-四甲基乙二胺。
通过如下方法制备浓缩胶混合0.5 mL的40%丙烯酰胺储液、1.25 mL 的Upper凝胶緩沖液(0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)、 0.4% SDS)、 3.25 mL的灭菌 milli Q水、30 |aL的10%过硫酸铵水溶液和8 的N,N,N，，N，-四甲基乙二胺。
Tris-甘氨酸緩冲液由25 mM Tris、 192 mM甘氨酸和0.1% SDS组成，而 转移緩沖液由25 mM Tris、 192 mM甘氨酸和10%曱醇组成。
(免疫印迹)
将已平衡的胶通过半干方法(semidry method)转移到转移緩冲液中的聚偏 二氟乙烯(poyvinylidene difluoride)月莫(PVDF,由Nippon Eidoh Co., Ltd.制造) 上(100mA, 3小时)。在转移之后，将PVDF膜用含有5o/。脱脂乳的PBST进 行封闭1小时。
在封闭结束之后，将识别LyGDI蛋白C末端的抗体(目录号Sc-604，由 Santa Cmz制造)结合至其上一小时，并且用PBST进4亍两次5分钟的洗涤。 然后，将碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG (H+L)(由Promega制造)结合至膜上
小时，然后用PBST进行3次5分钟的洗涤。将膜用0.1 M Tris水溶液(pH 9.5) 冲洗5分钟，然后在室温与CDP-Star (注册商标)Western Blot Chemiluminescen Reagent (由NEN Life Science Products, Inc.制造)一起温育5分钟。温育之后， 将其暴露在薄月莫(由Amersham Bioscience制造)上。
(结果)
结果示于图3。如图3(a)所示，发现由胱天蛋白酶-1降解的产物(17kDa) 不存在于低范围的曝射剂量(至多0.1 Gy)中，但是在0.5 Gy或更多的曝射剂 量时再次出现。此外，还发现当全身照射为5Gy或更多时，存在由胱天蛋白 酶-3降解的大量产物(21 kDa)。另外，如图3(b)所示，即^^通过用4 mGy的 低剂量照射，也观察到由胱天蛋白酶-1降解的产物(17kDa)含量的减少。
从以上的结果，由胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-3降解的产物含量相对于 曝射剂量的改变示意性地示于图4。从这些图中显而易见的是，曝射剂量和 由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的模式之间存在预定的关联，并 且将由胱天蛋白酶降解的这些产物的含量量化(quantify),由此能够估计施加 于个体受试者的电离辐射量。
就此而论，通过用识别胱天蛋白酶-3切割位点的抗体(在切割之后识别长 链N末端侧的抗体、KLH偶联物，其中所述抗体是相对于由氨基酸序列 SKLNYKPPPQKC (SEQ ID NO: 7)组成的寡肽作为抗原产生的单克隆抗体)的 相同PVDF膜的免疫印迹，将薄膜上的21-kDa条带确认为源自由胱天蛋白酶 -3降解的产物(数据未显示)。此外，用各胱天蛋白酶切割之后预计将存在的 LyGDI蛋白N末端侧片段同样通过使用抗体(目录号66456E,由Phamingen 制造)的相同PVDF膜的免疫印迹来确认，所述抗体识别LyGDI蛋白的N末 端(数据未显示)。基于这些信息，确认了 17-kDa条带源自由胱天蛋白酶-1降 解的产物，而21-kDa条带源自由胱天蛋白酶-3降解的产物。 实施例1-2
(使用骨髓组织的测量)
除使用骨髓组织以外，通过与实施例1-1中相同的方法检测由胱天蛋白 酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的含量。结果示于图5。如该图中所示，由 胱天蛋白酶-1降解的非常小量的产物(17 kDa)恒定存在于未经照射的受试者 中，但是所述产物不存在于1 Gy或更多的剂量范围内。此外，在0.5Gy或更 多的剂量范围内，全长LyGDI蛋白的量趋于减少，而在13kDA附近观察到 与识别LyGDI蛋白C末端的小鼠抗体特异性反应的蛋白，其相对于全长 LyGDI蛋白的减少以反比增加。
实S&例1-3
(使用脾脏组织测量)
除使用脾脏组织以外，通过与实施例1-1中相同的方法检测由胱天蛋白 酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的含量。结果示于图6。如该图中所示，在 脾脏组织的情况下恒定观察到由胱天蛋白酶-1降解的产物(17kDa)。此外，在 1 Gy或更多的剂量范围观察到由胱天蛋白酶-3降解的非常小量的产物(21 kDa)。
实施例1-4
(使用肠上皮组织测量)
除使用肠上皮组织以外，通过与实施例1-1中相同的方法检测由胱天蛋 白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的含量。结果示于图7。如该图中所示， 在肠上皮组织的情况下由胱天蛋白酶-3降解的产物(21 kDa)恒定存在于未照 射状态(OGy)。另一方面，在5Gy或更多的范围未观察到全长LyGDI蛋白， 并且在12Gy或更多的范围内也观察不到由胱天蛋白酶-3降解的产物。此外， 由胱天蛋白酶-1降解的产物几乎不存在。这可能是由于用辐射照射使肠上皮 细胞脱落。
实施例1-5 (使用血液测量)
除使用血液以外，通过与实施例1-1中几乎相同的方法检测由胱天蛋白
酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的含量。结果示于图8。如该图中所示，在 12Gy或更多的高剂量范围内观察到由胱天蛋白酶-1降解的产物(17kDa)。另 一方面，由胱天蛋白酶-3降解的产物几乎不存在。
从实施例1-1至1-5的结果，能够确认在收集自小鼠的组织和血液中由胱 天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的产物的模式依赖于电离辐射的曝射剂量而 改变；即，能够确定电离辐射的曝射剂量能够通过检测由胱天蛋白酶-1和月光 天蛋白酶-3降解的产物的模式来测量。
实施例2在人水平的试验 实施例2-1 (使用电离辐射照射)
对受试者(成年男性，49岁)用牙全景放射照相仪器(商品名autol000ex, 由Asahi Roentgen Co., Ltd.制造)以常规方式在颌部(顎咅D进行一次牙全景放 射照相术(dental panoramic radiography)(辐射剂量约20 mGy)。在照相期间， 受试者穿着铅防护板(lead apron)。
(血液的收集和样品的制备)
在辐射之前和辐射6小时之后，收集血液(夕卜周血)，/人中分离白细胞并且 用SDS样品緩冲液溶解以确定它们的蛋白质量。 (电;水和Western印迹)
通过SDS-PAGE分离蛋白质，然后使用以下4种抗体进行Western印-迹
抗体1: sc-6047G (商品名，羊多克隆抗体，其表位是LyGDI的C末端 区域，由Santa Cruz制造)。
抗体2: 66586E (商品名，兔多克隆抗体，其相对于全长LyGDI作为抗 原产生，并且未进行表位作图，由Pharmingen制造)
抗体3: 71-6300 (商品名，兔多克隆抗体，其表位是LyGDI的中央部， 由Zymed制造)
抗体4: 97A1015 (商品名，小鼠单克隆抗体，其识别M9-LyGDI的N末
端，由Active Motif制造) (结果)
结果示于图9。如图9(a)、 (b)和(c)所示，照射后A55-LyGDI的含量较未 照射时减少。而另一方面，未照射时A19-LyGDI的含量与照射后无区别。 实施例2-2 (电离辐射的照射)
通过用于癌症治疗的超高压(liniac)照射装置(商品名Mebatron 67-6300, 由Siemens AG制造)，对受试者(携带癌症的患者，成年男性，67岁)在腹部 用电离辐射(放射剂量约2 Gy)进行照射。
(血液的收集和样品的制备)
在射线照相术之前和射线照相术6小时之后，收集血液(外周血)，从中分 离白细胞并且用SDS样品緩冲液溶解，以确定它们的蛋白质量。 (电泳和Western印迹)
通过SDS-PAGE分离蛋白质然后用以下3中抗体进行Western印迹
抗体1: sc-6047G (商品名，由Santa Cruz制造)
抗体2: 66586E (商品名，由Pharmingen制造)
抗体4: 97A1015 (商品名，由Active Motif制造)
(结果)
结果示于图10。如图10(a)、(b)和(c)所示，照射后A55-LyGDI和A19-LyGDI 二者的含量与未照射状态的情况相比均增加。
在前述结果中，揭示了在用低剂量范围的辐射照射的情况下如在全景射 线照相术中，在电离辐射照射之后6小时观察到A55-LyGDI含量的减少。此 外，与小鼠的情况不同，A19-LyGDI恒定存在于人外周血的白细胞中，并且 其含量不因全景射线照相术而改变。
另一方面，在用相对高剂量范围的辐射照射的情况下，例如在用于癌症 治疗的辐射的照射中，照射后6小时A19-LyGDI的含量与A55-LyGDI的含量 一起增力口。
这些结果显示，不仅在小鼠中，而且在人中，都能够将LyGDI衍生片段 例如A55-LyGDI和A19-LyGDI作为生物学标记指示电离辐射的曝射，以及用 于考察电离辐射的曝射剂量。
工业适用性
通过根据本发明的测量电离辐射的曝射剂量的方法，能够直接测量电离 辐射对于活体的影响而不用提前携带测量设备。此外，胶片辐射剂量计等在 照射时并非必需的，所以即使在不太可能发生的将活体曝露于电离辐射的情 况下，例如在核燃料制造的事故中，在原子能工厂的事故中，或核原料自核 武器等意外泄露的情况下，能够更准确地得知电离辐射对于活体的影响。
虽然通过涉及本发明的实施方案已对本发明进行了描述，但除非特定指 出，我们的意图不在于通过描述的任何细节来限制本发明，而是在不违背所 附权利要求中所述的精神和范围的前提下对本发明作宽泛的解释。
权利要求
1.一种测量电离辐射的曝射剂量的方法，其包括如下步骤(a)从收集自活体的组织或血液提取蛋白质，和(b)测定提取的蛋白质中由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白的至少一种产物的含量。
2. 根据权利要求1测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中测定由胱天蛋 白酶-1降解的LyGDI蛋白的产物的含量和由胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋 白的产物的含量。
3. 根据权利要求1或2测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中通过免疫 印迹方法来测定由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的LyGDI蛋白的产物的含量。
4. 根据权利要求1至3任一项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中蛋 白质提取自收集的胸腺组织、骨髓组织、脾脏组织、肠上皮组织或血液。
5. 根据权利要求1至3任一项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中蛋 白质提取自收集的胸腺。
6. 根据权利要求1至3任一项测量电离辐射的曝射剂量的方法，其中蛋 白质提取自收集的血液。
7. 用于测量电离辐射的曝射剂量的试剂盒，其包含抗体，所述抗体用于 通过免疫印迹方法测定蛋白质中由胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3降解的 LyGDI蛋白的至少一种产物的含量，所述蛋白质从收集自活体的组织或血液 中提取。
全文摘要
一种测量电离辐射的曝射剂量的方法，其包括(a)从收集自活体的组织或血液提取蛋白质；和(b)测定提取的蛋白质中包含的LyGDI蛋白的1型和3型胱天蛋白酶分解产物中至少一种的表达量。
文档编号G01N33/68GK101184998SQ200680013920
公开日2008年5月21日 申请日期2006年2月24日 优先权日2005年2月25日
发明者达家雅明 申请人:国立大学法人广岛大学;智再如股份有限公司