专利名称：钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当
血钾高达7.5 mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治疗方案。血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离
子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行
血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测
标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极，感应材料
为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属物
质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有C1 —电极和F—电极；③液
态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的Ca"电极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动
老化，有效期长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。
酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较好的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分析项目。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钾(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钾(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明钾(离子)浓度测定方法原理如下
色氨酸+水色氨酸酶丙酮酸+氨离子+吲哚氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l,3-双磷酸+还原型辅酶
这种方法应用需要钾离子激活的色氯酸酶(tryptophanase; EC4丄99.1)酶(偶)联谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶^足反应速率比色法。色氨酸酶酶解色氨酸反应产生氨离子，再通过(偶)联合谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算钾(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾(离子)诊断/测定试剂
盒较为理想
缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
色氨酸酶 10000 U/L
谷氨酰胺合成酶 12000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
色氨酸 9 mmol/L
谷氨酸 16mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 5mmol/L本发明的钾(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-
试剂2
缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-
7磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、色氨酸酶。辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷二磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾(离子)浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
色氨酸酶10000U/L
谷氨酰胺合成酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶12000U/L
色氨酸9 mmol/L
谷氨酸16 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L甘油醛-3-磷酸 5 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，
加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂
的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左
右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大
实施例二
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂
辅酶
腺苷三磷酸甘油醛-3-磷酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
50 mmol/L3 mmol/L9 mmol/L16 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L
100mmol/L50 mmol/L10000 U/L谷氨酰胺合成酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大
实施例三
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
腺苷三磷酸甘油醛-3-磷酸试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
谷氨酰胺合成酶
函mmol/L50 mmol/L3 mmol/L9 mmol/L16 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L
歸mmol/L500 mmol/L12000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶
12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
雨mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
色氨酸酶
10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定钾(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37x:，反应时
间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测钾(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.025;吸光度 时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(ID0.99)线形范围可 达10mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士7 %;试剂测试的 精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.015 ± 0.007 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广 应用。
权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的钾(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下色氨酸+水 <u>色氨酸酶</u> 丙酮酸+氨离子+吲哚氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 <u>甘油醛-3-磷酸脱氢酶</u>甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出钾(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种钾(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L色氨酸酶1000———80000 U/L谷氨酰胺合成酶画0_——80000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶IOOO-——80000 U/L色氨酸1—50 mmol/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L甘油醛-3-磷酸1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱 氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成双剂试剂；试剂1,由缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱 氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成多剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、色氨酸酶组成。辅酶、色氨酸 酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷 酸、甘油醛-3-磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464394SQ20071019218
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司