专利名称：钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾 (离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当
血钾高达7.5 mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治 疗方案。血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。 高钾使心脏停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计 法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、 尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为 内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主要 使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯 进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li的浓 度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀 释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚， 均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用 电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普通冠醚阴离
子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极,在专用仪器上进行 血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其 他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测 标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极，感应材料 为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属 物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有Cl—电极和F—电极； ③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的Ca"电极；@用缬氨 霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就 会自动老化，有效期长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂， 误差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法 是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。
酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干 扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较好的 分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规 分析项目。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用需要钾离子激活的丙酮酸激
酶的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钾(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出 用以实现该方法的钾(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外 /可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾(离子)浓度测定，而且测 定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明钾(离子)浓度测定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷三磷酸
+丙酮酸
腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳丙酮酸羧化酶腺苷二磷酸
+磷酸根+草酰乙酸 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l,3-双磷酸+还原型辅酶
二氧化碳可以用碳酸氢钠或其他碳酸氢盐取代。
这种方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pymvic kinase; EC 2.7丄40) 酶(偶)联丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)、甘油醛-3-磷酸脱 氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶^f足反应连 续监测法。丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反应产生腺苷三磷酸，再通过 (偶)联合丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在 340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而 得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸 光度上升的速度，可以测算钾(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾(离子)诊断/测定试 剂盒较为理想缓冲液100mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
丙酮酸激酶10000U/L
丙酮酸羧化酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶12000U/L
腺苷二磷酸2 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸5 mmol/L
丙酮酸16 mmol/L
碳酸氢钠12 mmol/L
甘油醛-3-磷酸6 mmol/L
本发明的钾(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油 醛-3-磷酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮
酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮
酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。
辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾(离子)浓度的方法，其辅 酶可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液画mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
丙酮酸激酶10000U/L
丙酮酸羧化酶12000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶12000 U/L
腺苷二磷酸2 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸5 mmol/L
丙酮酸16 mmol/L
碳酸氢钠12 mmol/L
甘油醛-3-磷酸6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分 钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度 大小。 实施例二
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
腺苷二磷酸
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
甘油醛-3-磷！
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L
5 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L
6 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 丙酮酸激酶 丙酮酸羧化酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
50 mmol/L
10000U/L
12000U/L
12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试
剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时
间大约2分钟左右，捡测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
实施例三本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 辅酶
腺苷二磷酸
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
甘油醛-3-磷酸 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸羧化酶
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
试剂3
稳定剂 丙酮酸激酶
50 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L
5 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L
6 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
500 mmol/L
10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定钾(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应 时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， (离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度 大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.018;吸光 度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线形范 围可达12mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士 5%;试剂 测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2 %;试剂的灵敏度可达0.048 ± 0.024 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足 以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的钾(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷三磷酸 +丙酮酸腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷二磷酸 +磷酸根+草酰乙酸磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 <u>甘油醛-3-磷酸脱氢酶</u>甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶二氧化碳可以用碳酸氢钠或其他碳酸氢盐取代。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出钾(离子)的浓度大小测定结果。
2 —种钾(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 辅酶丙酮酸激酶丙酮酸羧化酶甘油醛-3-磷酸脱氢 腺苷二磷酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸 -4000 mmol/L6 mmol/L1000-1000-■00 U/L80000 U/L0-80000 U/L0 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L甘油醛-3-磷酸 1——50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此 范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛 -3-磷酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶 组成。辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷 二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸在试剂 l或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛 -3-磷酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2,由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成；试剂3， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶组成。辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化 酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氢钠、甘油醛-3-磷酸、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464307SQ200710191809
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司