专利名称：钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾 (离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当
血钾高达7.5 mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治疗 方案。血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高 钾使心脏停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计 法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、尿 液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为内标 准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主要使用 内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行 测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li的浓度，以 标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大， 血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚， 均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用 电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离 子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行
血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其 他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测
标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极，感应材料
为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属物 质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有C1—电极和F—电极；③液 态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的Ca"电极；④用缬氨霉素膜 制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动
老化，有效期长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂，误 差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法 是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。
酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干扰 性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较好的分 析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分 析项目。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型 烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钾(离 子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钾(离子)诊断/ 测定试剂盒，釆用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得 到切实的推广应用。
本发明钾(离子)浓度测定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/&+ 腺苷三磷酸+
丙酮酸
丙酮酸+辅酶八+氧丙酮酸氧化酶过氧化氢+ 二氧化碳+
乙酰辅酶A
过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶 辅酶+ 2水 这种方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC 2.7丄40) 酶(偶)联丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、 NADH过氧化物酶 (NADH peroxidase; EC 1.11.1.1; EC Lll丄2)酶促反应连续监测/速率比色 法。在钾(离子)的激活下，丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反应产生丙 酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶的作用，最终将 还原型辅酶(在340nrn处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处 吸光度下降的速度，可以测算钾(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾(离子)诊断/测定试剂 盒较为理想
缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸激酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/LNADH过氧化物酶 10000 U/L
腺苷二磷酸 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L
辅酶A 4 mmol/L
本发明的钾(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过 氧化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶。 还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可 以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。 还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾(离子)浓度的方法，其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸激酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L
NADH过氧化物酶 10000 U/L
腺苷二磷酸 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L
辅酶A 4 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度
1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟 左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大
实施例二
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
辅酶A 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 丙酮酸激酶 丙酮酸氧化酶 NADH过氧化物酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 3 mmol/L
3 mmol/L
4 mmol/L
100 mmol/L 500画ol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000 U/L1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试 剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时 间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340rnn吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大 小。
实施例三
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
辅酶A 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸氧化酶 NADH过氧化物酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 丙酮酸激酶
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
簡mmol/L 50 mmol/L 0,25 mmol/L 3 mmol/L
3 mmol/L
4 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定钾(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时
间10分钟，起始吸光度1，8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.016;吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达10mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土 7%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.016 ± 0.008△A/mmol/L—本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
ii
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)浓度测定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸丙酮酸+辅酶A+氧 <u>丙酮酸氧化酶</u> 过氧化氢+二氧化碳+ 乙酰辅酶A过氧化氢+还原型辅酶 <u>NADH过氧化物酶</u> 辅酶+2水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出钾(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种钾(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20-500 mmol/L稳定剂1-4000 mmol/L还原型辅酶0.1-0.35mmol/L丙酮酸激酶1000——80000 U/L丙酮酸氧化酶1000——80000 U/LNADH过氧化物酶1000——80000 U/L腺苷二磷酸1-50 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸1-50 mmol/L 辅酶A1-50 mmol/L 试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧 化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧 化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A组成双剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶 A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH 过氧化物酶组成。还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化 物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧 化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A组成多剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶 A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶组 成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶组成。还原型辅酶、丙酮酸 激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH过氧化物酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464299SQ20071019180
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司