专利名称：5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可 见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化 和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升 高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无生理性升高，对于 诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特 异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测 磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法， 方法为5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱 分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于单磷酸腺 苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5'-核苷酸 酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因 此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好， 强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic
5Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的 5'-核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行5，-核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准 确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明5'-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下
核苷单磷酸+水 5核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子
+谷氨酸+腺苷三磷酸 氨离子+酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+
水+辅酶
核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等 这种方法应用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)联谷氨 酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3.1.2)、谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4丄2; EC 1.4丄3)酶促反应连续监测法。5，-核苷酸 酶酶解核苷单磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合谷氨酰胺合成酶、 谷氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成 为辅酶(在340mn处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处 吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5'-核苷酸酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5，-核苷酸酶诊断试剂 较为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶10000 U/L
谷氨酸脱氢酶12000U/L
核苷单磷酸8 mmol/L
谷氨酰胺12 mmol/L
腺苷二磷酸12 mmol/L
酮戊二酸8 mmol/L
本发明的5'-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、 核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二
磷酸、酮戊二酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、 腺苷二磷酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二 磷酸、酮戊二酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。 还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、
腺苷二磷酸、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试 剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5，-核苷酸酶活性浓度的方法， 其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一-
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
谷氨酸脱氢酶 10000 U/L
核苷单磷酸 8 mmol/L
谷氨酰胺 12 mmol/L
腺苷二磷酸 12 mmol/L
酮戊二酸 8 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用
前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光
度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'-核苷酸酶样
品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大
约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，-核苷酸酶的
活性浓度大小。
实施例二
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂
还原型辅酶
核苷单磷酸
谷氨酰胺
腺苷二磷酸
酮戊二酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L
8 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
8 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷氨酰胺合成酶
500 mmol/L
6000 U/L
10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，起始吸光
1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，
>'-核苷酸酶样
品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，-核苷酸酶的
活性浓度: 实施例三
本实施例的5，-核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括: 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
核苷单磷酸
谷氨酰胺
腺苷二磷酸
酮戊二酸
100 mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L8 mmol/L12 mmol/L12 mmol/L8 mmol/L
试剂2
二 ^餘
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷氨酸脱氢酶
500 mmol/L
10000 U/L
试剂3
二 ^餘
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷氨酰胺合成酶
500 mmol/L
6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定5，-核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5，-核苷酸酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，-核苷酸酶的
活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析
仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0010;吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(RX).99)线形范围可达300 U/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.0003 ±0.00015 AA/min/U/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下核苷单磷酸+水 <u>5核苷酸酶</u> 核苷+磷酸根磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 氨离子 +谷氨酸+腺苷三磷酸氨离子+酮戊二酸+还原型辅酶 <u>谷氨酸脱氢酶</u> 谷氨酸+ 水+辅酶核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小结果。
2.一种5'-核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括: 缓冲液20-500 mmol/L稳定剂还原型辅酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸脱氢酶核苷单磷酸谷氨酰胺腺苷二磷酸酮戊二酸 -4000 mmol/L 0.1-0.35 mmol/L 1000——80000 U/L 1000——80000 U/L 50 mmol/L 50 mmol/L 50 mmol/L 50 mmol/L 试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在 此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、核 苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、 酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸 脱氢酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、核苷单磷 酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以 不限。
5. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、核 苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二酸组成多剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、 酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶组成；试剂 3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺 合成酶、谷氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二 酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1—4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、酮戊二酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464293SQ20071019149
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司