专利名称：5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5，-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为5'-核苷酸酶作用于H3-dlMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5'-核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5'-核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明5'-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下
核苷单磷酸+水 5核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸
+丙酮酸+ —氧化碳二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶异柠檬酸脱氢酶
D-异柠檬酸+辅酶
核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等。
这种方法应用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)联丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1.1丄42)酶促反应连续监测法。5，-核苷酸酶酶解核苷单磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5'-核苷酸酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5，-核苷酸酶诊断试剂较为理想
缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
异柠檬酸脱氢酶 12000 U/L
核苷单磷酸 8 mmol/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L酮戊二酸 12 mmol/L
本发明的5'-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷
酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为单试剂，三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶丙酮酸羧化酶
核苷单磷酸
腺苷二磷酸草酰乙酸
包括
100 mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L6000 U/L10000U/L8 mmol/L6 mmol/L12 mmol/L酮戊二酸 12 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用
前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光
度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'-核苷酸酶样
品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大
约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算山5'-核苷酸酶的
活性浓度大小。
实施例二
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 核苷单磷酸 腺苷二磷酸
草酰乙酸 酮戊二酸 试齐U 2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸羧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'-核苷酸酶样 品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核苷酸酶的 活性浓度大小。 实施例三
本实施例的5，-核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 核苷单磷酸 腺苷二磷酸 草酰乙酸 酮戊二酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
稳定剂
异柠檬酸脱氢酶 试剂3
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
丙酮酸羧化酶
6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定5，-核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:， 反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长 405nm，被测5，-核苷酸酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检 测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核苷酸酶的
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能 达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0010; 吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可 达300U/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±7%;试剂测试的 精密度(重复性)的变异系数(CV)《2 %;试剂的灵敏度可达0.0003 ±0.0001 AA/min/U/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足 以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下核苷单磷酸+水 <u>5核苷酸酶</u> 核苷+磷酸根磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸 +丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> D-异柠檬酸+辅酶核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小结果。
2. -核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L还原型辅酶0.1———0.35 mmol/L丙酮酸羧化酶1000———訓OO U/L异柠檬酸脱氢酶1000—~"80000 U/L核苷单磷酸l一50 mmol/L腺苷二磷酸l一50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L酮戊二酸1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在 此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷一.磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷—磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳'定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种,
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464294SQ20071019149
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司