5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法

文档序号:5909147阅读:180来源:国知局
专利名称:5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种5'-核苷酸酶诊断试剂盒,同时本发明还涉及测定 5'-核苷酸酶活性浓度的方法,属于医学检验测定技术领域。
背景技术
医学研究表明,5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆, 也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁 性肝硬化和慢性肝炎时,5NT升高率高于碱性磷酸酶;肝肿瘤和肝肉 芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无 生理性升高,对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸 酶不但敏感,而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于疾病 的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多,主要有同位素底物法、化学强 酸测磷法(1925年)。据申请人了解,目前国际上普遍采用同位素底 物测试法,方法为5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP,终止反应后,通过 离子交换层析柱分析结果,求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷 酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷,再用化学强酸法分析无机磷含 量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染,而且需要同位素测定仪, 因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法,准确度 不好,强酸污染环境等等,也不适合推广应用
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术,连续
监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化, 得以测定5,-核苷酸酶活性浓度的方法,同时,本发明还将给出用以实 现该方法的5'-核苷酸酶诊断试剂盒,采用该试剂不仅可以在紫外/可见 光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5'-核苷酸酶活性浓度测定, 而且测定速度快、准确度高,因而可以得到切实的推广应用。 本发明5,-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下
核苷单磷酸+水5核苷酸酶核苷+磷酸根 磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶异柠檬酸脱氢酶
异柠檬酸+辅酶
核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等 这种方法应用5,-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)联 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、异柠冲蒙酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC1丄1.41; EC 1丄1.42)酶促反应连续监测法。5,-核苷酸酶酶解核苷单磷酸反应产生 磷酸根,再通过(偶)联合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢 酶的作用,最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶 (在340nm处没有吸收峰),从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸 光度下降的速度,通过测量340nm处吸光度下降的速度,可以测算5'-核苷酸酶的活性浓度大小。
实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是单剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本发明5,-核苷酸酶
诊断试剂较为理想
缓冲液稳定剂还原型辅酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
异柠檬酸脱氢酶
核苷单磷酸
草酰乙酸
酮戊二酸
100匪ol/L500 mmol/L0.25 mmol/L10000U/L12000 U/L8 mmol/L12 mmol/L16 mmol/L
本发明的5'-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂,包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。
试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮
戊二酸。试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶。
还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试
剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮
戊二酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单
磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以
不限。试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配
制成液体试剂,直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂,本发明测定5,-核苷酸酶活性浓度的
方法,其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为单试剂,包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂还原型辅酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶异柠檬酸脱氢酶核苷单磷酸草酰乙酸
酮戊二酸
500 mmol/L0.25 mmol/L6000 U/L10000 U/L8 mmol/L12 mmol/L16 mmol/L
试剂全
ill
〖配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;
使用前,加入纯净水,复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37X:,反应时间10分钟,起始吸光度1.8士0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测5,-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约l分钟左右,检测时间2分钟左右,理论K值一4180。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,从而测算出5,-核苷酸酶的活性浓度大小。实施例二
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为双试剂,包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
核苷单磷酸
:酰乙酸
酮戊二酸
50 mmol/L0.25 mmol/L8 mmol/L12 mraol/L16 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶异柠檬酸脱氢酶
500 mmol/L
6000 U/L
10000U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37t:,反应时间10分钟,起始吸光度1.8士0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测5,-核苷酸酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约l分钟左右,检测时间2分钟左右,理论K值一2170。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,从而测算出5,-核苷酸酶的活性浓度大小。实施例三
本实施例的5,-核苷酸酶诊断试剂为三试剂,包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
核苷单磷酸
草酰乙酸
酮戊二酸
100 mmol/L50 mmol/L
0.25 mmol/L8 mmol/L12 mmol/L16 mmol/L
试剂2
二 f餘
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
异柠檬酸脱氢酶
500 mmol/L10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
500 mmol/L
6000 U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体三试剂,可以直接使用。
测定5,-核苷酸酶活性浓度时,在全自动生化分析仪上设定温度
37°C,反应时间10分钟,起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测5'-核苷酸酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约1分钟左右,检测时间2分钟左右,理论K值一2170。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,从而测算出5'-核苷酸酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证,采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的,鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同,不
另一一例举。
总之,实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化
分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001;吸光度时间反应曲线应呈直线下降;试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达300 U/L;试剂测试的不准确度,其相对偏差不超过士5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;、试剂的灵敏度可达0.0003士 0.00015 AA/min/U/L——本发明灵敏度高、精确度好,线形范围宽广,足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法,其方法原理如下核苷单磷酸+水 <u>5核苷酸酶</u> 核苷+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 <u>酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> 异柠檬酸+辅酶核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小结果。
2. —种5'-核苷酸酶诊断试剂盒,主要成分包括:缓冲液稳定剂20--500 mmol/L4000 mmol/L还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶0.1-0.35mmol/L 试剂成分的浓度不一定只限于上述范围;在此范围内效果较好,在此范围外,试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成双剂试剂;试剂l,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成多剂试剂;试剂l,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成;试剂3,由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶组成。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒,其特征在于还包括稳定剂1一4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶诊断试剂盒,同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分,属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度下降的速度,从而测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464296SQ200710191498
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
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