专利名称：定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法
定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法技术领域 本发明涉及定量测定中草药提取成分中生化成分的方法，具体地说是一种定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法。
背景技术：
沙棘叶中含有总黄酮，目前据相关文献报道，对于沙棘叶中总黄 酮的方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法及荧光分析法。经发明人的研究得知，沙棘叶中具有较高含量的雌二醇，这对应用沙棘叶 的提取物制作补充雌激素的药品与保健品具有重大意义。那么，研究分析不同 产地、不同采摘季节、不同批次等沙棘叶的雌二醇含量，对沙棘叶的开发利用 具有重要意义。沙棘叶中含有较高量的雌二醇，是发明人的发现，目前，尚处于未公知状 态，人们对沙棘叶的分析还处在对总黄酮的分析阶段，没有深入到分析沙棘叶 中雌二醇的含量阶段。雌二醇定量测定试剂盒(磁分离酶联免疫法)，用于定量测定人血清和血浆 中雌二醇的含量。磁分离酶联免疫法是酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结 合的一种测定法，并使用一种高亲和力的多克隆抗体。标本、质控品和标准品中的E2与限量的荧光素标多克隆抗体结合，随后加入定量的酶标E2衍生物与E2竞争结合；直接测定总E2的含量。雌二醇定量测定试剂盒的批准文号为国药准字S20060022。截止目前，还没有发现将磁分离酶联免疫法用于测量中草药中的雌二醇含量的相关报导。发明人成功地应用雌二醇定量测定试剂盒说明书所提供的方法，将磁分离 酶联免疫法用于测量中草药中的雌二醇含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测量数据准确、操作简便易行的定量 测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法。定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法，应用雌二醇定量测定 试剂盒所提供的试剂，使用该试剂盒的使用说明书所提供磁分离酶联免疫法，4其特征是将植物中草药提取液作为标本，按该试剂盒的使用说明书的步骤进 行操作。具体按下述三步骤a、第一次孵育一免疫反应，b、第二次孵育一酶反应， C、读取吸光值；a、 第一次孵育一免疫反应a. 1、吸取45ul各浓度标准品、质控品、标本，加之标记好的相应试管的底部；a.2、加60ulE2抗试剂至各试管，混匀；a.3、试管连架置37。C水浴20分钟；a.4、加60ul E2衍生物至各试管，混匀；a.5、试管连架置37。C水浴20分钟；a.6、加60ul磁分离试剂至各试管，混匀；a.7、试管连架置37'C水浴5分钟；a.8、试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟，确保每支试管底部都与分离 器表面接触；a.9、用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管放在滤 纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； a. 10、放正分离器，加150ul稀释后的清洗液至各试管； a. 11、放至涡旋机，激烈振荡，彻底混匀；a. 12、试管连架放人磁分离器，磁场中沉淀2分钟；确保每支试管底部都与分 离器表面接触；a.13、用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管放在 滤纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a. 14、重复a. lO — a. 13步骤两次；b、 第二次孵育一酶反应b. 1、为磁分离免疫测定仪校零，准备l支空白试管，做好标记，放置试管架上; b.2、从分离器取出试管架，加90ul基质至各试管，包括空白管；彻底混匀； b.3、试管连架置37。C水浴30分钟；b.4、加300ul终止液至各试管，包括空白管，其顺序与加基质顺序相同；b.5、把试管架放人磁分离器，沉淀时间不少于10分钟； C、读取吸光值用空白管在550nm校零；在550nm、 492nm读取标准品、质控品、标本的吸 光值。本发明是将现有的用于定量测定人血清和血浆中雌二醇含量的雌二醇定量 测定试剂盒用于定量测定植物中草药提取成分中的雌二醇含量，只要将植物中 草药提取成分作为被测标本即可，操作步骤中所应用的E2抗试剂、E2衍生物、 E2标准品、磁分离试剂、稀释清洗液、基质、终止液、质控品、标准品由雌二 醇定量测定试剂盒提供，其中稀释清洗液由使用者将雌二醇定量测定试剂盒提 供的浓縮清洗液稀释，得稀释清洗液。依据各被测中草药中所含有的雌二醇量的不同，被测标本是用水提法或是 其它提取方法所提取的中草药汁液、或浓縮汁、或浓縮汁制作400倍稀释液、 200倍稀释液、IOO倍等稀释液。本发明用于测取植物中草药提取成分中的雌二醇含量，对指导植物中草药 的开发利用具有重要意义。目前已知葛根提取物中含有较高量的雌二醇，发明 人发现沙棘叶提取物中含有高量的雌二醇。所以本发明尤其适用于测取沙棘叶 提取物、葛根提取物中的雌二醇含量，对研究分析不同产地、不同采摘季节、 不同批次等沙棘叶、葛根的雌二醇含量，指导沙棘叶、葛根作为补充雌激素产 品的开发利用具有重要意义。
具体实施方式
各实施例所使用的雌二醇定量测定试剂盒通过商业途径得到、由北京倍爱康生物技术有限公司生产。实施例l1、 准备沙棘叶提取物将8月中旬采集的沙棘叶阴晾干，加水清洗干净去除粉尘，烘干，粉碎80目，称取10克用水提法提取汁液，浓縮至20ml得沙棘 叶提取物，备用。2、 将上述沙棘叶提取物制作400倍稀释液、200倍稀释液、IOO倍稀释液。3、 应用雌二醇定量测定试剂盒所提供的试剂，将沙棘叶提取物的400倍稀 释液、200倍稀释液、IOO倍稀释液作为标本，按该试剂盒的使用说明书的步进行操作；a、 第一次孵育一免疫反应a. 1、吸取45ul各浓度标准品、质控品、标本，加之标记好的相应试管的底部；a. 2、加60ulE2抗试剂至各试管，混匀；a.3、试管连架置37。C水浴20分钟；a.4、加60ul E2衍生物至各试管，混匀；a.5、试管连架置37。C水浴20分钟；a.6、加60ul磁分离试剂至各试管，混匀；a. 7、试管连架置37。C水浴5分钟；a.8、试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟，确保每支试管底部都与分离 器表面接触；a.9、用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管放在滤 纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； a. 10、放正分离器，加150ul稀释后的清洗液至各试管； a. 11、放至涡旋机，激烈振荡，彻底混匀；a. 12、试管连架放人磁分离器，磁场中沉淀2分钟；确保每支试管底部都与分 离器表面接触；a. 13、用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管放在 滤纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a. 14、重复a. 10—a. 13步骤两次；b、 第二次孵育一酶反应b. 1、为磁分离免疫测定仪校零，准备l支空白试管，做好标记，放置试管架上； b.2、从分离器取出试管架，加90ul基质至各试管，包括空白管；彻底混匀； b.3、试管连架置37。C水浴30分钟；b.4、加300ul终止液至各试管，包括空白管，其顺序与加基质顺序相同；b.5、把试管架放人磁分离器，沉淀时间不少于10分钟；c、 读取吸光值用空白管在550nm校零；在550nm、 492nm读取标准品、质控品、标本的吸光值。沙棘叶提取物的400倍稀释液、200倍稀释液、IOO倍稀释液的雌二醇含 量见表l。表1沙棘叶提取物的400倍稀释液、200倍稀释液、100倍稀释液的雌二醇含量沙棘叶提取物稀释倍数测定值(雌二醇pg/ml)100倍392.5200倍127.8400倍87. 47实施例21、 准备葛根提取物葛根加水清洗干净去除粉尘，烘干，粉碎80目，称取10克用水提法提取汁液，浓縮至20ml得葛根提取物，备用。2、 将上述葛根提取物制作400倍稀释液、200倍稀释液、IOO倍稀释液。3、 标本是葛根提取物的400倍稀释液、200倍稀释液、100倍稀释液，其它同实施例1。表2葛根提取物的400倍稀释液、200倍稀释液、100倍稀释液的雌二醇含量沙棘叶提取物稀释倍数测定值(雌二醇pg/ml)10061.8420047. 5840038.51实施例31、 准备益木草提取物加水清洗干净去除粉尘，烘干，粉碎80目，称取IO克用水提法提取汁液，浓縮至20ml ，得益木草提取物，备用。2、 应用雌二醇定量测定试剂盒所提供的试剂，将益木草提取物作为标本， 按该试剂盒的使用说明书的步骤进行操作；检测雌二醇，结果56 Pg/ml。 实施例41、准备甘草提取物加水清洗干净去除粉尘，烘干，粉碎80目，称取IO8克用水提法提取汁液，浓縮至20ml ，得甘草提取物，备用。2、应用雌二醇定量测定试剂盒所提供的试剂，将甘草提取物作为标本，按 该试剂盒的使用说明书的步骤进行操作；检测雌二醇，结果2. 1 Pg/ml 实施例51、准备虎杖提取物加水清洗干净去除粉尘，烘干，粉碎80目，称取IO克用水提法提取汁液，浓縮至20ml ，得虎杖提取物，备用。2、应用雌二醇定量测定试剂盒所提供的试剂，将虎杖提取物作为标本，按该试剂盒的使用说明书的步骤进行操作；检测雌二醇，结果0.46Pg/ml
权利要求
1、定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法，应用雌二醇定量测定试剂盒所提供的试剂，使用该试剂盒的使用说明书所提供磁分离酶联免疫法，其特征是将植物中草药提取液作为标本，按该试剂盒的使用说明书的步骤进行操作；具体按下述三步骤a、第一次孵育-免疫反应，b、第二次孵育-酶反应，c、读取吸光值；a、第一次孵育-免疫反应a.1、吸取45ul各浓度标准品、质控品、标本，加之标记好的相应试管的底部；a.2、加60ulE2抗试剂至各试管，混匀；a.3、试管连架置37℃水浴20分钟；a.4、加60ul E2衍生物至各试管，混匀；a.5、试管连架置37℃水浴20分钟；a.6、加60ul磁分离试剂至各试管，混匀；a.7、试管连架置37℃水浴5分钟；a.8、试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟，确保每支试管底部都与分离器表面接触；a.9、用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a.10、放正分离器，加150ul稀释后的清洗液至各试管；a.11、放至涡旋机，激烈振荡，彻底混匀；a.12、试管连架放人磁分离器，磁场中沉淀2分钟；确保每支试管底部都与分离器表面接触；a.13、用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a.14、重复a.10-a.13步骤两次；b、第二次孵育-酶反应b.1、为磁分离免疫测定仪校零，准备1支空白试管，做好标记，放置试管架上；b.2、从分离器取出试管架，加90ul基质至各试管，包括空白管；彻底混匀；b.3、试管连架置37℃水浴30分钟；b.4、加300ul终止液至各试管，包括空白管，其顺序与加基质顺序相同；b.5、把试管架放人磁分离器，沉淀时间不少于10分钟；c、读取吸光值用空白管在550nm校零；在550nm、492nm读取标准品、质控品、标本的吸光值。
2、 根据权利要求1所述的定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法，其特征是植物中草药提取液是沙棘叶提取物。
3、 根据权利要求1所述的定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法，其特征是植物中草药提取液是葛根提取物。
全文摘要
本发明涉及定量测定中草药提取成分中生化成分的方法，具体地说是一种定量测定植物中草药提取成分中雌二醇含量的方法。该方法应用雌二醇定量测定试剂盒所提供的试剂，使用该试剂盒的使用说明书所提供磁分离酶联免疫法，其特征是将植物中草药提取液作为标本，按该试剂盒的使用说明书的步骤进行操作。本发明尤其适用于测取沙棘叶提取物、葛根提取物中的雌二醇含量，对研究分析不同产地、不同采摘季节、不同批次等沙棘叶、葛根的雌二醇含量，指导沙棘叶、葛根作为补充雌激素产品的开发利用具有重要意义。
文档编号G01N21/25GK101592668SQ200810110028
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月31日 优先权日2008年5月31日
发明者刘秀梅 申请人:刘秀梅