定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒及应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒：所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述的试剂组包括：浓缩PBS缓冲液、底物A、底物B、浓缩洗涤液、终止液、亚胺硫磷标准溶液、酶标记的亚胺硫磷抗原溶液、亚胺硫磷半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，还公开了这种试剂盒的使用方法，本试剂盒具有检测速度快，检测准确的特点。
【专利说明】定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒及应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学分析【技术领域】的一种定量检测农药亚胺硫磷含量的试剂盒及其检测方法，涉及到有机化学合成、免疫化学、生物化学等技术，尤其适用于食品和中药中亚胺硫磷残留的快速检测。
【背景技术】
[0002]亚胺硫磷属中等毒性广谱有机磷杀虫剂，适用于果树、蔬菜、水稻、棉花等多种作物上的病虫害的防治。但是亚胺硫磷的广泛使用，已对食品、水果、水源和土壤造成了污染，对人类的健康存在着潜在的威胁，其对作物有一定的渗透力且残效期较长。通过抑制体内胆碱酯酶(ACh)活性，引起体内生理效应部位ACh大量蓄积，使胆碱能神经持续过度兴奋，表现毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统等中毒症状和体征。严重者，常死于呼吸衰竭。所以世界各国均制定了亚胺硫磷的使用限量。美国国家环境保护局已经禁止其在3种作物上的使用并限定其在9种作物上的使用次数。目前针对亚胺硫磷的检测方法，主要是传统的仪器检测方法:高效液相色谱法、气相色谱、质谱等仪器分析方法。仪器检测虽然可靠有效，但是仪器昂贵，对技术人员要求高，并且需要烦琐的前处理技术，从而造成分析时间加长，同时检测样品量有限。
[0003]小分子化合物免疫分析技术为复杂样本中痕量农药残留的快速分析开辟了新的道路，已成为现今国际上农药残留分析很活跃的研究领域之一，尤其酶联免疫分析(ELISA)应用方面取得较大进展。酶联免疫法克服了仪器检测的缺点，方法简便快捷、特异性强、灵敏度高，样品容量大，分析成本低廉。
[0004]酶联免疫法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)是将农药小分子作为半抗原，通过一定途径与生物大分子(如蛋白质等)载体以共价键相偶联制备人工抗原，用制备的人工抗原免疫动物，连接在载体上的农药分子便成为抗原决定簇，被免疫动物产生对该农药分子具有特异性的抗体，在此抗体上连接上标记物(酶、荧光物质、放射性同位素等)，利用抗原抗体特异性反应和抗体上标记物的放大作用，对样本中微量农药残留物进行定性、定量检测。
[0005]专利申请200810153759.8中提到了一种抗农药亚胺硫磷的特异性抗体,公开了这种亚胺硫磷半抗原，酶标抗原，人工抗原，抗体的制备和应用于亚胺硫磷的快速检测，但是并没有公开具体的检测方法。
[0006]食品和中药中农药亚胺硫磷的含量比较低，检测要求要灵敏度高，检测准确，目前还缺少一种可以直接应用的食品中，中药中农药亚胺硫磷的快速检测方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是要克服现有技术的不足，提供一个可以定量检测食品以及中药中的亚胺硫磷含量的试剂盒及检测方法。该检测方法的灵敏度可达yg/kg级别。
[0008]本发明是通过以下技术方案来实现的:[0009]一种定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒由试剂组和包被板及托架组成，所述的试剂组包括:
[0010](I)浓缩PBS缓冲液:40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时用双蒸水5倍稀释；
[0011](2)底物A:含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液；
[0012](3)底物B:3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液；
[0013](4)浓缩洗涤液:含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释；
[0014](5)终止液:1.25M的硫酸；
[0015](6 )亚胺硫磷标准溶液:其亚胺硫磷标准溶液母液为lmg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到100 μ g/mL后，再按1:4稀释6个梯度；25，25/4
[0016](7)酶标记的亚胺硫磷抗原溶液:亚胺硫磷半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍；
[0017]所述酶标记亚胺硫磷抗原是按下述方法制备的:
[0018]①N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的合成:
[0019]称取131mg的氨基己酸，106mg的无水Na2C03于3mL蒸懼水中，加入225mg N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯，室温搅拌至完全溶解，约I小时反应终止；过滤，滤液酸沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，无水Na2S04干燥，得到亚胺硫磷半抗原；
[0020]②亚胺硫磷活化酯的合成:
[0021]称取463mg亚胺硫磷半抗原,254mg N-轻基琥拍酰亚胺溶于无水四氢呋喃中，N2保护下，滴加溶有454mgDCC的无水四氢呋喃溶液，搅拌过夜，过滤除去白色沉淀，旋除有机溶剂，经硅胶柱纯化得到白色固体的亚胺硫磷活化酯；
[0022]③酶标记亚胺硫磷抗原合成
[0023]精确称取0.0Olg亚胺硫磷活化酯，活化酯溶解于200 μ L N，N—二甲基甲酰胺中，IOmg HRP溶于2mL pH值为9.3的K2HP04溶液中，冰浴下，亚胺硫磷活化酯13倍过量缓慢逐滴加入酶溶液中，边滴边摇匀，4°C旋转放置过夜，将反应液装入透析袋，于4°C条件下PBS透析三天，透析液冷冻干燥得到白色粉末，贮于-20°C下备用；
[0024]所述的包被板为96孔或48孔酶标板，是由多克隆亚胺硫磷抗体包被于酶标板上，多克隆亚胺硫磷抗体用pH为9.6的Na2C03——NaHC03包被缓冲溶液稀释到I μ g/100 μ L，然后以每孔100 μ L包被于酶标板中，4°C过夜或者37°C恒温温育3小时，弃去包被溶液后用洗涤液洗板三次，加入200 μ L冻干液封闭I小时，洗涤液洗板四次冻干后真空包装，于4°C保存，冻干液为含BSA的Tris-HCl缓冲溶液。
[0025]进一步，所述的多克隆亚胺硫磷抗体经5次免疫制备，制备方法是:
[0026]免疫:免疫动物采用雄性新西兰大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共进行5次免疫，加强免疫分别在初次免疫后第2周，第4周和第6周进行三次，隔一个月进行第五次，从第3次免疫后开始采血测效价，采血时间为免疫后第10天；
[0027]初次免疫:取Img人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫；
[0028]加强免疫:取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫；
[0029]抗体纯化:定时检测动物抗体效价，当抗体对包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用Sepharose4B-Protein A亲和层析柱对抗血清进行纯化,制备抗体；
[0030]所述人工抗原用半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯与6-氨基己酸，以酰胺基CONH为桥梁，通过活性酯法，分别连接到卵清蛋白(ovalbumin, OVA)或血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin, KLH)上,合成人工抗原；具体做法是:
[0031 ] 取上述亚胺硫磷活化酯溶于DMF配成溶液A，KLH或OVA溶于磷酸缓冲溶液中配成溶液B，活化酯和蛋白的摩尔比13:1~40:1然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4°C下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4°C，pH=7.4的PBS溶液中透析三天，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，_20°C下贮藏。
[0032]本发明还公开了试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
[0033](I)室温下样品的前处理，分别包括食品的前处理和中药的前处理；
[0034](2)检测前，将试剂盒打开，所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时；
[0035](3)酶标抗原用PBS缓冲溶液稀释10万倍，在包被板上对亚胺硫磷标准溶液及待测样品进行双孔平行加样，50 μ L/孔，同时加入稀释后的酶标抗原，50 μ L/孔，空白加100 μ L PBS，摇床上混匀I分钟，37°C温育I小时；
[0036](4)洗板4次后，每孔 中加入体积比为14.6:0.45的底物显色液A液和B液混合液，37 °C显色20分钟；
[0037](5)加终止液，混匀，在双波长方式450_650nm下用酶标仪读取OD值。
[0038]本发明的优点是:
[0039]1.本发明具有高特异性、灵敏、准确、快速、简单、廉价，适用范围广。可适用于大多数谷物、蔬菜、水果以及中药的检测，特别是对于成分复杂的中药，前处理简单，重复性好。并且抗体灵敏度高，制备的抗体和酶标抗原稳定，具有保藏时间长的优点。
[0040]2.本发明提供的快速检测方法简便、高效，完成全部检测工作只需1.5-2小时，而且精确度能达到90%以上，适合目前现场快速检测的要求。由于抗体和酶标的稳定性好，为大规模样品的集中检测提供了极大的方便。
[0041]3.本发明成本低、检测效率高、可信度好、操作简便，具有极大的社会效益和经济效益，是一种新型的具有良好应用前景的食品及中药中亚胺硫磷残留检测的试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为本发明亚胺硫磷标准曲线。
【具体实施方式】
[0043]实施例1
[0044]①N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的合成:
[0045]
【权利要求】
1.定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述的试剂组包括: (1)浓缩PBS缓冲液:40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时用双蒸水5倍稀释； (2)底物A:含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液； (3)底物B:3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液； (4)浓缩洗涤液:含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释； (5)终止液:1.25M的硫酸； (6)亚胺硫磷标准溶液:其亚胺硫磷标准溶液母液为lmg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到100yg/mL后，再按1:4稀释6个梯度； (7)酶标记的亚胺硫磷抗原溶液:亚胺硫磷半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍； 所述酶标记亚胺硫磷抗原是按下述方法制备的: ①N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的合成:
2.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒，其特征在于所述的多克隆亚胺硫磷抗体经5次免疫制备，制备方法是: 免疫:免疫动物采用雄性新西兰大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共进行5次免疫，加强免疫分别在初次免疫后第2周，第4周和第6周进行三次，隔一个月进行第五次，从第3次免疫后开始采血测效价，采血时间为免疫后第10天； 初次免疫:取Img人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 加强免疫:取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 抗体纯化:定时检测动物抗体效价，当抗体对包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用Sepharose4B-Protein A亲和层析柱对抗血清进行纯化,制备抗体； 所述人工抗原用半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯与6-氨基己酸，以酰胺基CONH为桥梁，通过活性酯法，分别连接到卵清蛋白或血蓝蛋白上，合成人工抗原；具体做法是: 取上述亚胺硫磷活化酯溶于DMF配成溶液A，KLH或OVA溶于磷酸缓冲溶液中配成溶液B，活化酯和蛋白的摩尔比13:1~40:1然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4°C下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4°C，pH=7.4的PBS溶液中透析三天，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，_20°C下贮藏。
3.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒，其特征在于:冻干液为含BSA的Tris-HCl缓冲溶液。
4.一种权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤: (1)室温下样品的前处理，分别包括食品的前处理和中药的前处理； (2)检测前，将试剂盒打开，所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时； (3)酶标抗原用PBS缓冲溶液稀释10万倍，在包被板上对亚胺硫磷标准溶液及待测样品进行双孔平行加样，50 μ L/孔，同时加入稀释后的酶标抗原，50 μ L/孔，空白加100 μ LPBS,摇床上混匀I分钟，37°C温育I小时； (4)洗板4次后，每孔中加入的底物A液和底物B液混合液，混合的体积比为.14.6:0.45，37。。显色 20 分钟； (5)加终止液，混匀，在双波长方式450-650nm下用酶标仪读取OD值。
5.根据权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(4)中的底物显色液A液和B液分别为含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)中的终止液为.1.25M的硫酸。
【文档编号】G01N33/543GK103558373SQ201310499518
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】温雷 申请人:天津九鼎医学生物工程有限公司