专利名称：：一种增强纳米金稳定性的方法及应用其的生物检测的方法
技术领域：
：本发明涉及一种增强纳米金稳定性的方法及应用其的生物检测的方法，属于纳米生物
技术领域：
。
背景技术：
：纳米金颗粒具有独特的物理性能，尤其是光学性能，比如纳米金具有很高的消光系数。而且这些特性随着纳米颗粒的尺寸，形状和表面的修饰的变化而变化。因此纳米材料，尤其是纳米金颗粒，非常适合在生物检测和环境检测中作为信号来标志检测物的存在与否。纳米金最近几年被用于检测各种各样的物质，比如DNA，蛋白质和金属离子等。在现有技术中，为了利用纳米金进行生物检测和环境检测，必须利用纳米金独特的表面等离子共振的光学性能，独立存在的纳米金是红色的，而聚集在一起的纳米金是蓝灰色或紫色的。也就是说，现有技术在进行生物检测和环境检测时必须直接或间接地引起纳米金聚集，或者将聚集的纳米金重新分散，从而引起纳米金颜色的变化，可见光的吸收波长产生高达300nm的移动。这种颜色变化可以直接用肉眼观察，无需任何复杂设备，也可以使用光谱仪进行定量检测。现有的引起纳米金的聚集的方法可以分为两大类。第一类方法是检测物作为交联剂将纳米颗粒联结在一起，从而引起聚集。比如DNA诱导的通过颗粒间交联造成的聚集方法。这类方法需要将单链DNA，DNA酶，RNA酶或核酸适配体连接到纳米材料的表面。实验步骤相对繁琐，DNA，DNA酶，RNA酶或核酸适配体的用量大。第二类方法是非交联的纳米颗粒聚集方法，这种方法利用纳米颗粒在加入检测物后稳定性的降低。这种稳定性的降低或者是由于纳米颗粒表面用于提高纳米金稳定性的DNA分子或ATP的破坏，取代或消耗；或者由于与未修饰纳米颗粒相互作用的溶液中可以稳定纳米颗粒的ATP或单链DNA的减少。这类方法大多使用未修饰的纳米材料，只有少数使用DNA修饰的纳米金。如上所述，目前基于纳米材料稳定性变化而设计的纳米颗粒非交联检测方法多是在检测物存在的时候使纳米材料的稳定性下降，产生聚集。这一类的检测方法仅适用于检测物的存在降低纳米材料稳定性的情况，所有方法都基于以下几种分子对纳米金稳定性的差异双链DNA结构比单链DNA稳定纳米金差，长的单链DNA比三磷酸腺苷dNTP稳定纳米金差，ADP和脲苷比ATP稳定纳米金差。该类方法在使用上具有局限性。比如对检测物涉及除以上几种分子以外的分子，未见报道。另外该方法在检测灵敏度上比较差，这是由于少量的聚集不容易观测。最近报道了一例利用纳米材料稳定性提高进行铅离子检测的方法(HuiWei，Nanotechnology19(2008)095501(5pp);ZhidongWang等人Adv.Mater.2008，20，3263-3267)。在他们的方法中，铅离子可以将双链DNA(由单链DNA基体和单链DNA酶形成)中的单链DNA基体切断。然后利用所生成的单链DNA比双链DNA能够更好地稳定纳米金来检测铅离子的存在。这种方法显著提高了检测的灵敏度。但该方法仍然是基于双链DNA结3构和单链DNA稳定纳米金能力的差异。以上所述方法存在着以下不足1、可检测物种类的局限性，仅限于检测体系中存在双链DNA，或/和单链DNA，或/和dNTP，或/和ADP和脲苷，或/和ATP。2、当利用双链DNA和单链DNA对纳米金稳定性差异进行DNA检测时，由于双链DNA和单链DNA对纳米金稳定性的差异不是很大，尤其是单链DNA对纳米金的稳定作用显著地受其组成影响，比如含有连续T的单链DNA不能很好地稳定纳米金，被检测DNA的摩儿量需要和DNA探针的摩儿量尽量接近，才可以直接肉眼观测到的显著差异。当被检测的DNA样品是复杂样品，很难定量时，就需要大量的优化实验。
发明内容本发明针对现有技术中的问题，其目的在于提供一种增强纳米金稳定性的方法及应用其的生物检测的方法。本发明的增强纳米金稳定性的方法，是将dNMP加入纳米金溶液中。优选的，本发明的增强纳米金稳定性的方法，其特征在于加入纳米金溶液中的dNMP的数量为应大于纳米金摩儿量的50倍。优选的，本发明的增强纳米金稳定性的方法，其特征在于加入纳米金溶液中的dNMP的浓度大于150nM。优选的，本发明的增强纳米金或纳米银稳定性的方法，其特征在于利用各种各样的核酸酶反应来生成dNMP。本发明的一种生物检测方法，是利用检测过程中生成的dNMP来检测被分析物。该方法利用纳米金的颜色变化来标明被检测物的存在与否。被分析物可以是酶，蛋白质，核酸，小分子，金属离子。本发明的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将被检测物与某种特定的酶，以及其它酶反应所需要的成分混合，并在酶反应所需要的条件下保存，酶反应将生成dNMP;(2)将反应溶液与纳米金溶液混合；(3)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)，通过溶液颜色变化来判定被检测物的存在。被分析物的存在于否可以由紫外可见吸收定量分析。被分析物的存在于否可以由溶液的颜色变化定性地分析。本发明的一种生物检测方法，是将所生成的dNMP加入纳米金溶液中，通过增强纳米金的稳定性进行A核酸外切酶的活性检测。优选的，本发明的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将不同浓度的A核酸外切酶与其基体(比如5端磷酸化的双链DNA)混合，并在37度下保温一段时间，75度下加热10分钟；(2)将反应混合物与纳米金溶液混合；(3)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)。本发明的另一种生物检测方法，其特征在于，该方法是将所生成dNMP加入纳米金溶液中，通过增强纳米金的稳定性进行SI核酸酶的活性检测。优选的，本发明的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将不同浓度的S1核酸酶与其基体(比如单链DNA)混4合，并在37度下保温一段时间；(2)将反应混合物与纳米金溶液混合；(3)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)。本发明的再一种生物检测方法，其特征在于，该方法是将所生成的dNMP加入纳米金溶液中，通过增强纳米金的稳定性进行DNA的恒热放大检测。优选的，本发明的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将被检测DNA样品(互补的和不互补的单链DNA)与5端磷酸化的检测DNA探针混合，并在室温下保存5分钟；(2)将反应混合物与A核酸外切酶混合，并在37度下保温一段时间，75度下加热10分钟；(3)将反应混合物与纳米金溶液混合；(4)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)。本发明将纳米材料和酶反应有机的结合起来，具有如下的技术效果1、对dNMP和具有相同碱基摩儿浓度的单链DNA对13nm纳米金颗粒的稳定性差异进行研究，发现dNMP比具有相同碱基摩儿浓度的单链DNA能够更显著地提高13nm纳米金颗粒的稳定性。基于这种差异可以用来设计各种各样的生物传感器，极大地扩展了利用未修饰纳米金或银颗粒进行生物检测的方法的使用范围。比如，可以进行各种核酸酶活性的检测。2、由于对dNMP和具有相同碱基摩儿浓度的单链DNA对13nm纳米金颗粒的稳定性具有显著的差异，这种差异可以用来提高检测的范围和灵敏度，以及降低对实验条件进行优化的需要。比如当检测DNA的摩儿量与DNA探针的摩儿量比例在10到0.05的范围内都可以清晰地看到互补DNA样品和不互补DNA样品的区别。3、dNMP是DNA(包括单链，双链DNA，DNA酶和适配体)的降解产物。大量具有独特功能的核酸酶都可以将DNA进行选择性的降解。这种过程可以与纳米检测技术相结合，极大地提高检测的灵敏度和专一性。本发明涉及使用未修饰的纳米金颗粒进行生物，医药和环境检测的方法。在该方法中，当检测物靶标存在的时候，检测体系中产生可以极大地稳定纳米金的成份。在本发明中检测体系中产生的是单核苷酸dNMP，dNMP能够比单链和双链DNA更好地稳定未修饰的纳米金。利用这种稳定性的提高，对检测物进行无需任何设备的颜色检测。并且可以在对DNA和小分子的检测中，实现恒热的信号放大。本发明方法可以用来检测蛋白质，酶，DNA，小分子，金属离子和细菌等。本发明的其它特点和优点可以通过下面的实施例来体现。需要指出的是，以下实施例仅用来举例说明，在本发明的范围内可以进行各种各样的变化和修改。图1(A)-图1(C)是本发明中所使用的未修饰13nm金颗粒的透射电镜(TEM)图像和紫外可见吸收谱。样品在测量紫外可见吸收前稀释10倍，特征吸收峰在519nm。图1(D)是纳米金的稳定性测定曲线。纳米金的稳定性随dNMP的用量增加而定量提高。图2.是纳米金溶液与双链DNA，单链DNA和dNMP混合和加入盐溶液后的紫外可见吸收光谱。插图是所观察到的不同混合物的颜色。图3(A)-图3(E)是本发明一个实施例中通过增强纳米金的稳定性进行入核酸外切酶的活性检测的方法。该实施例中A核酸外切酶将双链DNA中的5端磷酸化的单链DNA分解成单核苷酸dNMP。5图4(A)-图4(C)是本发明一个实施例中通过增强纳米金的稳定性进行SI核酸酶的活性检测的方法。该实施例中SI核酸酶将单链DNA分解成单核苷酸dNMP。图5(A)-图5(C)是本发明一个实施例中通过增强纳米金的稳定性进行DNA的恒热放大检测的方法。该实施例中当靶标与DNA探针互补时，A核酸外切酶将5端磷酸化的单链DNA探针分解成单核苷酸dNMP。详细说明〃AuNPs"or"AuNPs"指金纳米颗粒，通常是球形的，典型的尺寸为直径1-lOOnm.dNMP是单核苷酸dAMP，dGMP，dCMP和dTMP的混合物。适配体指能够专一性地与靶标分子结合的DNA(或者RNA)分子，耙标可以是蛋白质，DNA，小分子和金属离子等等。DNA(或者RNA)酶是能够催化化学反应的DNA(或RNA)分子。具体实施例方式在下述各实施例的各附图中，试管中纳米金溶液的颜色从左到右依次为图2灰色，灰色，灰色和红色。图3(B)灰色和红色。图3(C)灰色，紫色，暗红色，暗红色，红色，红色，红色和红色。图3(E)红色，灰色和紫色。图4(B)灰色，紫色和红色。图4(C)紫色，红色和灰色。图5(A)第一列灰色和紫色；第二列暗红色和暗红色。图5(C)紫色和灰色；红色和紫色。实施例材料和方法HAuCI4从ACROSORGANIC购买。AMP，TMP，CMP，GMP从上海楷洋生物技术有限公司购买。柠檬酸三钠从国药集团化学试剂公司购买。A核酸外切酶从Biolabs购买。Sl核酸酶从TaKaRa(大连)购买。所有DNA从TaKaRa(大连)购买。13纳米的金颗粒(AuNP)按照经典的柠檬酸钠还原法制，最终的浓度大约是12.7nM.实施例1:未修饰的纳米金的制备和dNMP对纳米金的稳定性的提高。柠檬酸三钠的水溶液(25ml，38.8mM)快速加入沸腾的金氯酸HAuCI4溶液中(250ml，ImM)。几分钟后，溶液的颜色从浅黄色变成深红色。溶液继续回流搅拌15分钟使反应完全。然后慢慢地地冷却到室温。4度保存。按照纳米金在520nm的紫外吸收强度(图1(C))，所制备的纳米金的的浓度是12.7nM，尺寸是13nm(见图l(A)和(B)。纳米金的稳定性实验中，纳米金的浓度是3nM，100iiL。dNMP是dAMP，dTMP，dGMP和dCMP的混合溶液(100yM或者/ImM)，其中各单核苷酸的比例与单链DNA(5'CCGCAAATTGTTC)相同。表1中的0.6MNaCl磷酸缓冲液的用量是使纳米金在10秒钟内完全聚集(A520=0)时的用量。实验过程简单如下100微升3nM的纳米金溶液与不同量的dNMP溶液混合，立即加入适量的0.6MNaCl磷酸缓冲液使纳米金在10秒钟内完全聚集(A520=0)。最终的NaCl浓度(mM)用下式计算0.6x1000x0.6MxNaCl磷酸缓冲液6的用量(微升)/{100+0.6MNaCl磷酸缓冲液的用量(微升)+dNMP的用量(微升)}。dNMP可以有效提高纳米金的稳定性。纳米金的稳定性随着dNMP加入量的增加而显著提高(表1，图ID)。没加入dNMP时，纳米金在NaCl浓度54.5mM时就完全聚集，而加入dNMP后，纳米金可以承受显著高浓度的NaCl。承受NaCl的浓度越高，说明纳米金的稳定性越高。表1.纳米金的稳定性测定。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:dNMP，单链DNA和双链DNA对未修饰纳米金的稳定影响的差异双链DNA样品PM/A:0.25微升100yM的5端磷酸化的单链DNA探针A(5'CCGCAAGACCGCTAGC)，0.25微升100iiM与单链DNA探针完全互补的革巴标DNAPM(GCTAGCGGTCTTGCGG)，1微升的缓冲液(0.6MNaCl，lOmM磷酸盐，pH7.4)，禾口0.5微升的水在室温下保存10分钟。单链DNA样品PM:0.25微升100iiM与单链DNA探针完全互补的靶标DNAPM(GCTAGCGGTCTTGCGG)，1微升的缓冲液(0.6MNaCl，10mM磷酸盐，pH7.4)，和0.75微升的水在室温下保存10分钟。单链DNA样品A:0.25微升100iiM5端磷酸化的单链DNA探针A(5'CCGCAAGACCGCTAGC)，1微升的缓冲液(0.6MNaCl，10mM磷酸盐，pH7.4)，和0.75微升的水在室温下保存10分钟。dNMP样品dNMP样品与单链DNA样品A具有相同的碱基摩儿浓度。1.75微升的100iiM的dCMP，1微升的100iiM的dGMP，1微升的100iiM的dAMP，0.25微升的100iiM的dTMP，和1微升的缓冲液(0.6MNaCl，10mM磷酸盐，pH7.4)，在室温下保存10分钟。在以上样品中分别加入100微升的12.7nM的纳米金，然后立即加入IO微升的0.6MNaCl磷酸盐溶液。双链，单链DNA样品立即产生聚集，而dNMP样品保持稳定的红色(图2)。然后进行了UV-Vis吸收测量(图2)。dNMP由于较小的空间位阻和较小的分子尺寸，以及较小的电负性，dNMPs能够比具有相同碱基浓度的单链和双链DNA更好地稳定纳米金。由于dNMPs和DNA都可以不同程度上稳定纳米金AuNPs，在特定的盐浓度下dNMP/AuNP保持稳定，而DNA/AuNP聚集。实施例3:通过增强纳米金的稳定性进行A核酸外切酶的活性检测10微升的酶反应溶液中含有5端磷酸化的单链DNA探针A(100pmole，10iiM)，(5'P04_CCGCAAGACCGCTAGC)与单链DNA探针完全互补的耙标DNAPM(lOOpmole，10iiM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)，反应缓冲液(67mMGlycine-KOH，2.5薩gCI2，50iig/mlBSA，pH9.4)，和不同量的A核酸外切酶(从limitto0.limit)。反应在37。C下进行1小时，然后在75t:下加热10分钟使酶失活。然后反应溶液与200微升的纳米金AuNP(12.7nM)混合，加入100微升的0.2MNaCl磷酸盐溶液。进行UV-Vis吸收测量，波峰的移位用来定量颜色变化和酶的活性。A核酸外切酶对基体的选择性也可以按照上诉实验条件进行。具体如下三种基体分别是(1)5'端磷酸化的单链DNA探针A(100pmole，10iiM)，(5'P04-CCGCAAGACCGCTAGC)与单链DNA探针完全互补的耙标DNAPM(100pmole，10yM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)形成的双链DNA;(2)5'端没有磷酸化的单链DNA探针B(lOOpmole，10iiM)，(5'CCGCAAGACCGCTAGC)与单链DNA探针完全互补的耙标DNAPM(lOOpmole，10yM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)形成的双链DNA;(3)5'端磷酸化的单链DNA探针A(lOOpmole，10iiM)，(5，P04_CCGCAAGACCGCTAGC)。limit的A核酸外切酶。其它实验条件同上。讨论A核酸外切酶作用于双链DNA，沿5'到3'方向渐进性催化去除5'单核苷酸。最适合的底物是5'磷酸化的双链DNA。如图3所示，(A)A核酸外切酶将双链DNA中的5端磷酸化的单链DNA探针A酶解成dNMP。由于dNMPs和DNA都可以不同程度上稳定纳米金AuNPs，对A核酸外切酶活性的检测在特定的盐浓度下进行，在此浓度下dNMP/AuNP保持稳定，而DNA/AuNP聚集。(B)是酶反应溶液与纳米金混合后的紫外可见吸收谱图，(C)是不同浓度的入核酸外切酶反应溶液(O，O.OlU/iiL，O.02U/iiL0.03U/iiL，O.04U/iiL，O.05U/iiL，0.075U/iiL和0.lU/iiL)与纳米金混合后的照片。如图(C)所示，随着入核酸外切酶浓度的增加，更多的单链DNA探针A酶解成dNMP，纳米金越来越稳定，纳米金的颜色由蓝色逐渐成为红色，当酶的浓度大于0.05U/iiL时，所产生的dNMP已经能够在本实施例的盐浓度下安全稳定纳米金。(D)是不同浓度的A核酸外切酶反应溶液(0，0.01U/iiL，0.02U/iiL0.03U/iiL，0.04U/iiL，0.05U/iiL，0.075U/iiL和0.1U/iiL)与纳米金混合后紫外可见吸收A520/A600随A核酸外切酶浓度变化的曲线，(E)是A核酸外切酶反应对基体选择性的照片。A核酸外切酶对双链DNA中的5端磷酸化的单链DNA探针的反应活性显著高于单链的5端磷酸化的DNA和DNA中的没有5端磷酸化的单链DNAB探针。在目前的研究中，典型的A核酸外切酶的检测范围是0.002U/iiL到0.1U/iiL。实施例4:通过增强纳米金的稳定性进行Sl核酸酶的活性检测IO微升的酶反应溶液中含有单链DNAC(100pmole，10iiM)，(5'AGGCTGGAGGTAAAACGACGGAACTAACATGCA)，反应缓冲液(30mM醋酸钠，280mMNaCI，lmMZnS04，pH4.6)，和5U的S1核酸酶。反应在37t:下进行15分钟。然后5微升反应溶液与100微升的纳米金AuNP(12.7nM)混合，加入20微升的0.6MNaCl磷酸盐溶液。进行UV-Vis吸收测量，波峰的移位用来定量颜色变化和酶的活性。Sl核酸酶对基体的选择性也可以按照上诉实验条件进行。具体如下两种基体分别是(1)单链DNA探针B(100pmole，10iiM)，(5'CCGCAAGACCGCTAGC)与单链DNA探针完全互补的耙标DNAPM(100pmole，10iiM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)形成的双链DNA;(2)单链DNA探针B(100pmole，10iiM)，(5'CCGCAAGACCGCTAGC)。其它实验条件同上。讨论为了验证本发明方法应用的普遍性，我们使用该方法对S1核酸酶的活进行了性检测。Sl核酸酶是单链DNA特异的核酸内切酶，能将DNA或RNA降解成为5'-P单核苷酸。如图4所示，(A)Sl核酸酶将单链DNA探针A酶解成dNMP。(B)是酶反应溶液与纳米金混合后的紫外可见吸收谱图和照片。当溶液中存在Sl核酸酶时，单链DNA被酶解成dNMP，而dNMP能够更好地稳定纳米金。在特定的盐浓度下进行，dNMP/AuNP保持稳定，而DNA/AuNP聚集。因此可以检测S1核酸酶的存在和活性。(C)是是S1核酸酶反应对基体选择性的照片。Sl核酸酶对单链DNA探针的反应活性显著高于双链的DNA。实施例5:通过增强纳米金的稳定性进行DNA的恒热放大检测10微升的反应溶液中含有5端磷酸化的单链DNA探针A(100pmole，10iiM)，(5，P04-CCGCAAGACCGCTAGC)与单链DNA探针完全互补的耙标DNAPM(O.1iiM，1iiM，10iiM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)，反应缓冲液(67mMGlycine-KOH，2.5mMMgCI2，50iig/mlBSA，pH9.4)，和1U的A核酸外切酶。反应在37t:下进行1小时，然后在75t:下加热IO分钟使酶失活。然后5微升的反应溶液与100微升的纳米金AuNP(12.7nM)混合，加入20微升的0.6丽aCl磷酸盐溶液。进行UV-Vis吸收测量，波峰的移位用来定量颜色变化和DNA的检测。负控制实验中使用不互补的靶标DNAN(O.1iiM，1iiM，10iiM)(5'CCGACGCGCTGGAGTA)。同样的DNA杂交的纳米检测实验在不存在A核酸外切酶的条件下进行，用于展示本发明的优点。讨论如图5所示，(A)DNA的检测，按照专利US2005059042A1。当5端磷酸化的单链DNA探针A与单链DNA探针完全互补的靶标DNAPM的摩儿比例等于10或0.1时，无论用肉眼或紫外可见吸收测量不能够检测DNAPM的存在。(B)按照本发明的DNA的检测。在本实施例中，单链DNA的摩儿比是指5端磷酸化的DNA探针A与耙标DNAPM(或N)的摩儿比。当5端磷酸化的单链DNA探针A与单链DNA探针完全互补的靶标DNAPM的摩儿比例等于10或0.1时，仍然能够用肉眼清晰地检测到DNAPM的存在。当使用紫外可见吸收测量时，检测范围可以扩大一到两个数量级(表2)。表2.按照本发明和现有技术进行DNA检测的紫外可见吸收数据(A520/A650)。9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>专利US2005059042A1以及其它目前报道的方法都是利用双链和单链DNA对稳定纳米金的能力的差异来设计检测DNA的。然而由于双链DNA和单链DNA对纳米金稳定性的差异不是很大，尤其是单链DNA对纳米金的稳定作用显著地受其组成影B向，比如含有连续T的单链DNA不能很好地稳定纳米金，被检测DNA的摩儿量需要和DNA探针的摩儿量尽量接近，才可以直接肉眼观测到的显著差异。当被检测的DNA样品是复杂样品，很难定量时，就需要大量的优化实验。然而本发明成功地利用了两个实验现象来提高使用未修饰纳米金检测的使用范围和提高其灵敏度。第一个现象是，dNMPs，由于较小的空间位阻和较小的分子尺寸，以及较小的电负性，dNMPs能够比具有相同碱基浓度的单链和双链DNA更好地稳定纳米金。我们可以将区分双链和单链DNA的问题转化为更容易的区分dNMPs和单链DNA的问题。第二个现象核酸酶反应的专一性和多样性。众多的高灵敏的DNA检测方法都是依赖于高度专一性的酶，这些酶可以显著地改变DNA的结构和尺寸，这些变化都可以用于使用未修饰纳米金进行的DNA检测中。比如在本实施例中，我们利用A核酸外切酶来对DNA进行恒热放大检测。因此当5端磷酸化的单链DNA探针A与单链DNA探针完全互补的靶标DNAPM的摩儿比例大于等于100时，仍然有足够的dNMPs产生来稳定纳米金，从而能够检测DNAPM的存在。权利要求一种增强纳米金稳定性的方法，其特征在于该方法是将单核苷酸dNMP加入纳米金溶液中。2.根据权利要求1所述的增强纳米金稳定性的方法，其特征在于加入纳米金溶液中的dNMP的数量应大于纳米金摩儿量的50倍。3.根据权利要求1或2所述的增强纳米金稳定性的方法，其特征在于加入纳米金溶液中的dNMP的浓度大于150nM。4.根据权利要求1所述的增强纳米金稳定性的方法，其特征在于利用各种各样的核酸酶反应来生成dNMP。5.—种生物检测方法，其特征在于，该方法利用检测过程中生成的dNMP来检测被分析物，该方法利用纳米金的颜色变化来标明被检测物的存在与否。6.根据权利要求5所述的生物检测方法，其特征在于，被分析物可以是酶，蛋白质，核酸，小分子，金属离子。7.—种生物检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(l)将被检测物与某种特定的酶，以及其它酶反应所需要的成分混合，并在酶反应所需要的条件下保存，酶反应将生成dNMP;(2)将反应溶液与纳米金溶液混合；(3)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)，通过溶液颜色变化来判定被检测物的存在。8.根据权利要求5所述的生物检测方法，其特征在于，被分析物的存在于否可以由紫外可见吸收定量分析。9.根据权利要求5所述的生物检测方法，其特征在于，被分析物的存在于否可以由溶液的颜色变化定性地分析。10.—种生物检测方法，其特征在于，该方法是将所生成的dNMP加入纳米金溶液中，通过增强纳米金的稳定性进行A核酸外切酶的活性检测。11.根据权利要求5所述的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(l)将不同浓度的A核酸外切酶与其基体(比如5端磷酸化的双链DNA)混合，并在37度下保温一段时间，75度下加热10分钟；(2)将反应混合物与纳米金溶液混合；(3)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)。12.—种生物检测方法，其特征在于，该方法是将所生成dNMP加入纳米金溶液中，通过增强纳米金的稳定性进行SI核酸酶的活性检测。13.根据权利要求7所述的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将不同浓度的SI核酸酶与其基体(比如单链DNA)混合，并在37度下保温一段时间；(2)将反应混合物与纳米金溶液混合；(3)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)。14.一种生物检测方法，其特征在于，该方法是将所生成的dNMP加入纳米金溶液中，通过增强纳米金的稳定性进行DNA的恒热放大检测。15.根据权利要求9所述的生物检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将被检测DNA样品(互补的和不互补的单链DNA)与5端磷酸化的检测DNA探针混合，并在室温下保存5分钟；(2)将反应混合物与A核酸外切酶混合，并在37度下保温一段时间，75度下加热10分钟；(3)将反应混合物与纳米金溶液混合；(4)加入适量的盐溶液(比如氯化钠)。全文摘要本发明提供一种增强纳米金稳定性的方法及应用其的生物检测的方法。单核苷酸dNMP能够比组成相同，且碱基浓度相同的单链DNA更好地稳定纳米金。dNMP可以由各种各样的具有基体选择性的核酸酶消化核酸形成。将dNMP能够更好地稳定纳米金这一特性与特异性的酶反应相结合，纳米金的颜色变化可以用来简单方便地检测多种多样的分析物，包括酶和DNA等。该方法极大地扩大了使用未修饰纳米金进行生物检测的检测物范围，提高了检测的灵敏度。以DNA检测为例，将检测的探针和靶标的摩儿比例范围扩大了三个数量级。该方法可以推广到包括小分子和重金属离子在内的各种不同种类的物质的检测。文档编号G01N21/78GK101762574SQ20081020762公开日2010年6月30日申请日期2008年12月23日优先权日2008年12月23日发明者娄新徽,赵建龙申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所