专利名称：一种颜色颗粒免疫层析法检测三聚氰胺试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于畜产品、饲料及奶制品类食品中食品添加剂三聚氰胺残留检测试纸 及其检测方法，属胶体金免疫检测领域。
背景技术：
由于牛奶和饲料工业蛋白质含量测试方法的不完善，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添 加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人称为"蛋白精"。
三聚氰胺(英文名Mdamine)，简称三胺、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，性状为纯 白色单斜棱晶体，无味，分子式C3HeNe ，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂 环有机化工原料。其主要可用于制做三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料，三聚氰胺还可以 作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。在2007年深圳检验检疫局从台湾进口的3批观赏 鱼饲料检出三聚氰胺；同年福建、天津、山东、珠海检验检疫局从进口马来西亚、泰 国、秘鲁的鱼粉中检出三聚氰胺阳性；据美国食品药品管理局(FDA)官方消息，美国 FDA在美国国内生产的用于牛、绵羊、山羊、鱼、虾的颗粒词料饲料中发现含有三聚 氰胺；2007年北京检验检疫局从进口澳大利亚的宠物食品中检出三聚氰胺阳性，同年 3月在美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调査是由于一些宠物饲料供应商为了 增加词料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺，从而导致猫、 狗中毒死亡。因此去年三聚氰胺就已经为我们敲响了警钟。
在2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，进而査出大量的奶制品中 含有国家禁止食品添加剂三聚氰胺，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症。 三聚氰胺被人体食用后会在胃的强酸性环境中水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸 二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸，三聚氰酸随后在肠道内被吸 收，从而进入血液，在血液中三聚氰酸能够和钙离子结合形成不溶解的三聚氰酸钙，肾脏在 过滤血液杂质的时候三聚氰酸钙就会在肾脏聚集最终形成结石。目前全国共发现万余名因 食用奶粉致肾结石的婴幼儿，而在奶制品中三聚氰胺残留量超标会严重影响人类健康水平， 己成为不容忽视的食品污染源。政府和各职能部门对奶制品三聚氰胺残留问题十分关注。在 现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工
3原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测 现在并无国家标准。
故现今急需要一种快速、准确、简单、安全的检测手段。
目前，检测三聚氰胺残留的分析方法主要是依靠气相色谱(GC)与质谱(MS)联用法 (GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)等方法。这些 方法可实现精度的定量分析但速度较慢，检测成本较高，受检测范围和精度的限制。总之， 这些方法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度受样品的净化、浓縮等步骤的影响很大， 耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。
随着免疫诊断技术和单克隆抗体技术的发展，快速诊断三聚氰胺诊断技术不断创新，包 括酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应法等，上述方法各有所长，但都需专用仪器、专业人员 操作，仍不适于三聚氰胺高发地区的大规模现场调査。
将酶联免疫吸附法检测为三聚氰胺的快速诊断。专利200710179476.6 —种检测三聚氰胺 酶联免疫试纸盒是将三聚氰胺用琥珀酸酐连接得到中间体1，再在戊二酸酐半醛与氯甲酸 异丁酯合成免疫原，通过免疫兔获得针对三聚氰胺的多克隆抗体包被酶标板实现酶联免疫吸 附法检测三聚氰胺。
本发明是用使用戊二醛法合成免疫原，用此免疫原免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合筛选 获得针对三聚氰胺单克隆抗体株，制备特异性单克隆抗体，而实现竞争法原理制成试纸，具 有特异性强、灵敏度高，适用于大规模现场检测三聚氰胺。
因此，利用竞争法原理，在传统免疫检测法的基础上引入了胶体金快速检测技术，研制 出三聚氰胺颜色颗粒免疫层析法检测试纸。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无 需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长 的特点。将颜色颗粒免疫层析法引入三聚氰胺检测，为三聚氰胺的快速诊断提供了一个新的 分析检测途径。
发明内容
本发明针对上述存在的一些问题，提供了一种适用于检测三聚寧胺是否超标的颜色颗粒免疫 层析法检测三聚氰胺的试纸条。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的-.
在三聚氰胺残留检测试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤
维素膜两端分别与吸水层和三聚氟胺单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在l一2 毫米范围)，在三聚氰胺单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。关于底板、硝酸纤维素膜、吸 水纸、胶体金标垫的组合方法按专利CN 2741052Y执行。
其中，可利用颜色颗粒作为单克隆抗体标记，颜色颗粒是一种金属溶胶颗粒，包括胶体 金颗粒、胶体银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒；颜色颗粒还可以是一种标记颗粒，包括染料颗粒、 乳胶颗粒、荧光颗粒。
样品吸液层由三层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、 第三层为一定规格无纺布层。
三聚氰胺残留检测试纸的控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，试验线是由三聚氰胺 合成免疫原包被。把检测三聚银胺残留的胶体金试纸的样品吸液层端放入饲料浸汁或奶制品 溶液中，由于毛细管虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至三聚氰胺单克隆抗 体金标垫时，样品中的三聚氰胺与三聚氰胺单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固 定有三聚氰胺合成免疫原试验线时，由于三聚氰胺单克隆抗体金标垫中的抗体与样品中三聚 氰胺优先结合成复合物而失去其与三聚氟胺合成免疫原结合，因此其胶体金不能滞留于试验 线上，试验线处没有红色线显示，即只有一条红色控制线为阳性；相反如果样品中没有三聚 氰胺，三聚氰胺单克隆抗体金标垫中的抗体移动到试验线上，三聚氰胺单克隆抗体就会与三 聚氰胺合成免疫原发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条红色线为阴性，这就是 免疫竞争法原理。试验线的颜色深浅与样品中三聚氰胺含量高低成反比。从阳性过渡到阴性， 由于所测三聚氰胺含量不同，试验线的颜色也不同，形成一个红色颜色梯度差，以这种原理 检测出OD值，从而推断出试验线所反应实际三聚氰胺的量。
用竞争法制成试纸其检测三聚氰胺设定检出量以上，观察窗处出现一条红线为阳性；设 定检出量以下出现双红线为阴性；设定检出量时在试验线处为一条模糊阴影线为界限值，从 而得出判断。
当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无三聚氰胺，标记的金标探针都会 与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代 表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
由于采用上述技术方案，本发明所提供的一种快速检测三聚氰胺残留的胶体金试纸具有 这样的有益效果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。
图1为本发明一种快速检测三聚氰胺残留的胶体金试纸的主视结构图。
图2为发明图一的侧视结构图。
图3为检测显示阳性结果图。
图4为检测显示阴性结果图。
图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单 克隆抗体金标垫，6、样品吸液层，7、底板，8、 MAX线。
具体实施例
1. 根据三聚氟胺的分子结构，推断其分子中的抗原决定区，选用三聚氣胺农药原药采用戊二 醛活化法将三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联，分别合成了免 疫原三聚氰胺-BSA和包被原三聚氰胺-OVA。
2. 单克隆抗体的制备
(1) 用合成的免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细 胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。
(2) 提取小鼠腹水纯化筛选，获得能与三聚氰胺分子结合的单克隆抗体用于胶体金标记。
3. 胶体金的制备及与三聚氰胺单克隆抗体的结合
U)取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到85 95'C，加入适量柠檬酸三纳继续加热 搅拌至沸腾3 10分钟，冷却后避光保存备用。
(2)把三聚氰胺单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。
4. 制膜机制膜利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。
5. 试纸条组合见说明书附图，方法同专利CN2741052Y。
6. 使用方法把试纸的样品吸液层端放入饲料浸汁或奶制品溶液中(液面不得超过MAX线图 中8)， 1分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5 分钟时观察结果。
7. 结果判断根据设定cutoff值，如lrag/kg，检测三聚氰胺浓度lmg/kg以上，观察窗处出 现一条红线为阳性；lmg/kg以下出现双红线为阴性；lmg/kg时在试验线处为一条模糊阴影线 为界限值。
权利要求1. 一种快速检测三聚氰胺残留的颜色颗粒试纸条，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、三聚氰胺单克隆抗体标记的颜色颗粒垫(5)、样品吸液层(6)、MAX线(8)组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条包被三聚氰胺免疫原的试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和单克隆抗体颜色颗粒垫相互交叠连接，在单克隆抗体标记的颜色颗粒垫上压有样品吸液层。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测三聚氰胺快速检测试纸，其特征在于颜色颗粒是一种 金属溶胶颗粒。
3. 根据权利要求2所述的一种快速检测三聚氟胺快速检测试纸，其特征在于金属溶胶颗粒包 括胶体金颗粒、胶体银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒。
4. 根据权利要求1所述的一种快速检测三聚氟胺快速检测试纸，其特征在于颜色颗粒是一种 标记颗粒。
5. 根据权利要求4所述的一种快速检测三聚氰胺快速检测试纸，其特征在于标记颗粒包括染 料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒。
6. 根据权利要求1所述的一种检测三聚氰胺残留的颜色颗粒试纸条，其特征在于试验线是由 三聚氟胺合成免疫原包被制成，控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成。
7. 根据权利要求1所述的一种快速检测三聚氰胺的颜色颗粒免疫层析试纸，其特征在于样品 吸液层由三层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、第三层 为一定规格无纺布层。
专利摘要一种快速检测三聚氰胺残留的颜色颗粒免疫层析试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成。底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有三聚氰胺合成免疫原试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，通过颜色颗粒免疫层析免疫竞争方法制成试纸，利用免疫颜色颗粒免疫层析法来检测畜产品、饲料及奶制品中的三聚氰胺残留量。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。
文档编号G01N33/577GK201269879SQ20082012274
公开日2009年7月8日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者万积成 申请人:万积成