专利名称：检测牛奶中结合珠蛋白含量的免疫传感器及检测方法
技术领域：
本发明属于生物化学及电化学技术领域，特别涉及针对奶牛隐形 乳腺炎的重要标志物一牛奶中结合珠蛋白含量的快速检测方法。
背景技术：
奶牛乳腺炎(mastitis)是所有奶牛疾病中发病率最高、危害最为 严重的一种乳腺炎症性疾病，主要包括临床型乳腺炎和隐性乳腺炎两 种类型，其中又以隐性乳腺炎的发病最为普遍。隐性乳腺炎的发生可 引起奶牛的产奶量下降，并导致牛奶中体细胞数量(SCC)升高而降 低乳品质量。若处理不当，则有可能发展成为临床型乳腺炎，带来更 大的危害。因此，对隐性乳腺炎进行适时、准确的监测是奶牛场最为 重要的工作。由于隐性乳腺炎患牛缺乏明显的乳腺炎症表现，临床上必须借助 特殊手段才能建立该病的诊断。现阶段临床上诊断奶牛隐性乳腺炎的 常规方法包括牛奶体细胞计数法和乳汁细菌培养法。体细胞计数又包 括采用体细胞计数仪进行直接计数和采用CMT法(加利福利亚乳腺 炎检测方法)进行间接计数两种方法。丹麦福斯公司生产的系列体细 胞计数仪是目前唯一商品化的体细胞计数装置，但该类仪器的价格非 常昂贵，检测成本亦较高，很难在国内中小牛场普及；CMT法以及国内一些研究机构根据CMT原理开发出来的HMT法、SMT法等不 需特殊设备，检测成本较低廉，但容易出现假阳性或假阴性反应，检 测结果的可靠性相对较低。乳汁细菌培养法是诊断奶牛隐性乳腺炎较 为可靠的一种方法，但存在检测过程耗时较长、不能进行实时在线诊 断等缺点。可用于诊断隐性乳腺炎的方法还包括牛奶电导率检验法、 酶类检测法、PCR检测法等，这些检测方法或者要求苛刻的检测条件， 或者要求较高的专业技能，难以在基层单位推广应用。
近年来的科学研究表明，牛奶中结合珠蛋白(Haptoglobin, Hp) 的含量升高可作为诊断奶牛隐性乳腺炎的敏感指标，目前国外已有商 品化的检测牛结合珠蛋白的ELISA试剂盒问世。虽然ELISA检测方 法具有灵敏度高、特异性强的优点，但亦存在检测成本高、操作步骤 繁琐等不足。
鉴于奶牛隐性乳房炎的严重危害及以上诊断方法的缺点和局限 性，临床上急需一种快速、灵敏、操作简单、检测成本低廉且能实现 在线诊断的检测方法。
免疫传感器检测技术是将免疫检测技术与传感检测技术相结合 而形成的一类新型检测技术，是生物传感器领域发展最迅速的技术之 一，具有灵敏度高、特异性强、检测快速、使用简便、低成本和容易 实现在线检测等许优点。电流型免疫传感器是免疫传感器的一种类 型，通常由转换元件(支持电极)、生物敏感元件(抗体或抗原修饰 的工作电极)、电解池以及数据采集与处理系统组成，通过检测抗原-抗体反应前后电流的变化而实现定性/定量检测。近十余年来，电流型免疫传感器在医学、动物医学、环境分析和食品安全检测等多领域 中得到了广泛的研究，其中工作电极上生物分子的组装技术一直是该 研究领域的关键内容。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测牛奶中结合珠蛋白含量的免 疫传感器，包括工作电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，免疫 传感器的工作电极为金电极，金电极上结合有纳米金颗粒，纳米金颗 粒上连接有抗结合珠蛋白抗体。
进一步地，所述的金电极为圆盘金电极，辅助电极为铂丝电极，
参比电极为Ag/AgCl标准电极。
更进一步地，所述纳米金粒子的直径为15~25nm。 本发明的免疫传感器以电化学三电极系统为基本装置，以圆盘金 电极为工作电极，在金电极上组装纳米金颗粒，纳米金颗粒上连接抗 结合珠蛋白抗体，利用抗体-抗原的特异性亲和作用捕获牛奶中的待 测抗原——结合珠蛋白，采用循环伏安法检测免疫反应前后传感器的 电流变化，实现对牛奶中结合珠蛋白的定量检测。
本发明免疫传感器结构简单，在制备时，首先对金电极表面进行 抛光等预处理，以氯金酸溶液为电解质溶液、用循环伏安法使金离子 在电极表面发生还原反应产生金单质，金单质以纳米粒子形态沉积在 电极表面，再通过纳米金粒子吸附抗结合珠蛋白抗体，用小牛血清封 闭非特异性结合位点，制得工作电极，最后将工作电极与参比电极、辅助电极组装形成纳米金免疫传感器。
本发明还提供了一种使用上述免疫传感器检测牛奶中结合珠蛋 白含量的方法，其特征在于包括以下步骤-
a. 将已知浓度的结合珠蛋白抗原溶液进行梯度稀释，分别将权 利要求1所述免疫传感器在上述结合珠蛋白抗原溶液中浸泡30分钟后 放入电解池溶液中，设置扫描电压为-0.2V-0.6V、扫描速度0.1V/s，进 行循环伏安扫描检测，得到一系列氧化峰电流下降百分比数据，将该 数据与结合珠蛋白抗原溶液的浓度建立关联，得结合珠蛋白抗原溶液 的工作曲线图和线性回归方程；
b. 取待测的新鲜牛奶样品，3000rpm离心10分钟，取乳清用超纯 水稀释，将上述免疫传感器在稀释液中浸泡30分钟后放入电解池溶液 中，设置扫描电压为-0.2V-0.6V、扫描速度0.1V/s，进行循环伏安扫描 检测，得氧化峰电流下降百分比数据，将该数据代入步骤a所得线性 回归方程，计算得出牛奶样品中结合珠蛋白的含量。
进一步地，所述的电解池溶液含5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化 钾、0.1M氯化钾。
本发明检测方法通过采用循环伏安法检测抗体与被检抗原反应 前后传感器的电流响应变化，确定被检抗原的含量。
将标准浓度的抗原溶液按照绘制标准曲线的要求进行系列稀 释，分别用本发明的免疫传感器对上述抗原溶液进行循环伏安扫描检 测，可得到一系列氧化峰电流(力下降百分比数据^式中力为免疫反应前的氧化峰电流，A为免疫反应后的氧化峰电流。
分别以峰电流电流下降百分比《及与其相对应的抗原浓度为纵
坐标和横坐标，用Excel软件处理绘制标准曲线图，获得其相应的回 归方程，并对该方法组装的免疫传感器检测的灵敏性、特异性和稳定 性进行分析。
当检测牛奶样品中的结合珠蛋白含量时，用本发明的免疫传感器 对样品溶液进行循环伏安扫描检测，计算得出氧化峰电流(力下降百 分比A，将该数据代入上述线性回归方程，计算得出牛奶样品中结合 珠蛋白的含量。
本方法基于电流型免疫传感器，采用电化学循环伏安扫描法对牛 奶中结合珠蛋白进行定量测定，操作简单、检测快速、灵敏度高、检 测成本低廉、易于推广，可作为临床上通过检测牛奶中结合珠蛋白含 量而建立奶牛隐性乳腺炎诊断的一种实用、简便的方法。
图1为本发明纳米金免疫传感器检测结合珠蛋白的工作曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的内容作进一步的说明。
实施例l:制备纳米金免疫传感器 1)溶液的配置Piranha溶液98%浓硫酸和30%过氧化氢溶液按体积比为3 : l的 比例配制。
氯金酸电解液溶液:将lg氯金酸溶解到100ml纯水中配制成1% 氯金酸溶液，再取lml 1%的氯金酸溶液加入到30ml 0.5M稀硫酸溶 液中，混合均匀。
电解池溶液称取0.0832g铁氰化钾，0.1056g亚铁氰化钾，0.3728g 氯化钾溶解到50ml纯水中。 2)制备纳米金免疫传感器
将圆盘金电极依次用直径为l(im、0.3^im和0.05pm的氧化铝粉末抛 光至光亮，用上述配制好的Pimnha溶液浸泡10分钟，再依次浸泡于无 水乙醇和双蒸水中超声波清洗15分钟，将清洗后的电极放入0.5M硫 酸溶液中，用循环伏安法在-0.3 1.5V电压下抛光30分钟，晾干备用。
以上述配制的氯金酸电解液为底液，采用线性循环伏安扫描法， 设置起始电压为1.1V，末电压为OV，扫面速度0.1V/s，扫描圈数为l 圈，在圆盘金电极上沉积纳米金颗粒，所得纳米金颗粒的直径约为 20nm，得纳米金电极。
将纳米金电极浸入0.5吗/ml的牛结合珠蛋白抗体溶液中，室温下 孵育20分钟后取出，用0.25%小牛血清封闭15分钟，纯水洗净后晾干 备用，得纳米金免疫电极。
将免疫电极与参比电极、辅助电极组装形成纳米金免疫传感器。
在纳米金免疫电极的制备过程中，采用循环伏安法(电压 -0.2V-0.6V，扫描速度0.1V/s，电解池溶液为5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，0.1M氯化钾溶液)对每一步处理进行表征。
实施例2:结合珠蛋白的检测 1)绘制工作曲线
将牛结合珠蛋白标准抗原(浓度为0.77mg/ml)分别稀释至 1540ng/ml、 770ng/ml、 385ng/ml、 154ng/ml、 77ng/ml、 38.5 ng/ml、 7.7ng/ml、 3.85 ng/ml、 1.54 ng/ml和0.77 ng/ml。
用实施例l所制得的纳米金免疫传感器分别在上述浓度的标准抗 原溶液中浸泡30分钟后，采用循环伏安法对牛结合珠蛋白标准抗原进 行定量检测，以免疫反应前后氧化峰电流O')下降的百分比《作为 定量依据。
加(厶-力)/厶x1000/0，
式中力为免疫反应前的氧化峰电流，力为免疫反应后的氧化峰电流。
对每一浓度标准抗原检测三次，取氧化峰的平均值作为每一标准 抗原浓度所对应的峰电流值。以标准抗原浓度的对数值为横坐标 (X)， W直为纵坐标(Y)，用Excel软件处理并绘制标准曲线，即得 到标准抗原溶液的工作曲线图(如图l所示)和其相关的线性回归方
程
Y=0.2672X-0.0567
其中X二log^C， C为抗原浓度，Y为氧化峰下降百分比)，线性相 关系数R2 = 0.9959，满足定量分析方法对精密度的要求。牛结合珠蛋白抗原的稀释浓度(V=V标准抗原V水)在7ng/ml(V=l: 100000) 350ng/ml (V=l: 2000)时，免疫传感器氧化峰电流(i)下降的百分数A与抗原浓度的以IO为底的对数呈良好的线
性关系。
2)牛奶样品中结合珠蛋白的检测
取待测新鲜牛奶2ml， 3000rpm (离心力为603g)离心10分钟，弃乳脂，用超纯水稀释1000倍。室温下，将免疫传感器在乳清稀释液中浸泡孵育30分钟，取出放入电解池溶液中，设置扫描电压为-0.2V-0.6V、扫描速度0.1V/s，进行循环伏安扫描检测，计算出其氧化峰下降百分比h对每一样品使用不同工作传感器连续测量三次，K值分别为1.94， 1.86， 1.92 ，取其平均值1.91代入上述回归方程Y二0.2672X-0.0567中，计算出结合珠蛋白的含量为92ng/ml。乘以乳清的稀释倍数IOOO，得被测牛奶中的结合珠蛋白含量为92ug/ml。
实施例3:回收率试验
取3份牛结合珠蛋白抗原溶液进行稀释后，按实施例2所述步骤测定结合珠蛋白含量，测定结果如下表
样号 加入浓度(ng/ml) 回收量(ng/ml) 回收率(％)
1 15.4 14.85 96.44
2 77 71.96 93.45
3 154 137.26 89.13其平均回收率为93.01%，相应的回收率的标准偏差(RSD)为0.09%，符合定量分析方法的精密度要求。
实施例4:稳定性试验
取3份牛结合珠蛋白标准抗原溶液进行稀释后，按实施例2所 述步骤测定结合珠蛋白含量；重新制备纳米金免疫传感器，置4。C冰 箱中保存48h后，重新测定3份同样浓度标准抗原溶液，测定结果如
样号第 一 次测量浓度放置48h后测量浓度 偏差％ (ng/ml) (ng/ml)
1 14.8514.02 5.59
2 137.26 149.35 8.10
3 71.96 75.12 4.21 平均偏差为6.07%，说明传感器稳定性良好。
实施例5:重复性试验
制备2个纳米金免疫传感器，分别标记为1#， 2#传感器。取3 份牛结合珠蛋白标准抗原溶液进行稀释后，分别用1#， 2#传感器检 测，测量结果如下表-
样号1#传感器测量浓度 2#传感器测量浓度 偏差％
(ng/ml) (ng/ml)
1 57.98 63.29 8.39
122 74.06 83.47 11.27
3 7.311 7.590 3.68
用2个传感器一起检测三组抗原溶液，同一浓度下传感器之间检测偏差分别为8.39%， 11.27%和3.68% 。平均偏差为7.79%，符合免疫传感器重复性要求。
权利要求
1、检测牛奶中结合珠蛋白含量的免疫传感器，包括工作电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，免疫传感器的工作电极为金电极，金电极上结合有纳米金颗粒，纳米金颗粒上连接有抗结合珠蛋白抗体。
2、 如权利要求1所述检测牛奶中结合珠蛋白含量的免疫传感器， 其特征在于所述的金电极为圆盘金电极，辅助电极为铂丝电极，参比 电极为Ag/AgCl标准电极。
3、 如权利要求2所述检测牛奶中结合珠蛋白含量的免疫传感器， 其特征在于所述纳米金粒子的直径为15 25nm。
4、 检测牛奶中结合珠蛋白含量的方法，其特征在于包括以下步骤a. 将已知浓度的结合珠蛋白抗原溶液进行梯度稀释，分别将权 利要求1所述免疫传感器在上述结合珠蛋白抗原溶液中浸泡30分钟后 放入电解池溶液中，设置扫描电压为-0.2V-0.6V、扫描速度0.1V/s，进 行循环伏安扫描检测，得到一系列氧化峰电流下降百分比数据，将该 数据与结合珠蛋白抗原溶液的浓度建立关联，得结合珠蛋白抗原溶液 的工作曲线图和线性回归方程；b. 取待测的新鲜牛奶样品，3000rpm离心10分钟，取乳清用超纯 水稀释，将权利要求1所述免疫传感器在稀释液中浸泡30分钟后放入 电解池溶液中，设置扫描电压为-0.2V-0.6V、扫描速度0.1V/s，进行循 环伏安扫描检测，得氧化峰电流下降百分比数据，将该数据代入步骤 a所得线性回归方程，计算得出牛奶样品中结合珠蛋白的含量。
5、如权利要求4所述检测牛奶中结合珠蛋白含量的方法，其特征在于所述的电解池溶液含5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾、0.1M氯化钾。
全文摘要
本发明公开了一种检测牛奶中结合珠蛋白含量的免疫传感器，包括工作电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，免疫传感器的工作电极为金电极，金电极上结合有纳米金颗粒，纳米金颗粒上连接有抗结合珠蛋白抗体。本发明利用抗体-抗原的特异性亲和作用捕获牛奶中的待测抗原——结合珠蛋白，采用循环伏安法检测免疫反应前后传感器的电流变化，实现对牛奶中结合珠蛋白的定量检测。本发明还提供了一种结合珠蛋白的检测方法，该方法操作简单、检测快速、灵敏度高、检测成本低廉、易于推广，可作为临床上通过检测牛奶中结合珠蛋白含量而建立奶牛隐性乳腺炎诊断的一种实用、简便的方法。
文档编号G01N33/68GK101666804SQ20091015318
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者丁守强, 韬 潘, 勋 谭 申请人:浙江大学