专利名称：乙基紫在dna检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体而言，本发明涉及乙基紫(EV)在聚丙烯酰 胺凝胶上对DNA染色的方法，其成本低、步骤简单、操作时间短、灵敏度高而且染色后 的背景颜色浅。另外，本发明还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
背景技术：
当前，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离DNA、蛋白质等生物大分子并使之条带显 色(可视化)，已经成为生物检测中最常用的方法之一了。其中，使在聚丙烯酰胺凝胶 上的DNA分子条带可视 化，可以采用同位素标记、荧光染料、可视有机染料和银染等。 出于灵敏性、安全性以及速度的考虑，当前最受欢迎的技术之一是荧光检测法，其使用 诸如溴化乙锭(EB)、SYBR green, SYBR gold等荧光染料，如紫外光线(UV)的照射下 发出荧光，可用于检测聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带[1-5]。然而，这些荧光染料都具 有一些不可克服的缺点，尤其是EB，作为一种较强的致突变剂，容易对操作者的健康产 生威胁，因而需要在操作中格外小心并采取适当的防护措施，不方便使用，而且所有荧 光染料在使DNA条带可视化时，需要紫外线等短波光线照射，也不利于观察实验结果的 操作者的健康，同时荧光检测仪器设备成本也比较高[6-8]。因此，肉眼可见、操作简单、无毒、低成本的可视有机染料成为替代荧光染料 为DNA染色的选择之一。已经有一些报道公开了可视有机染料用于聚丙烯酰胺凝胶上 DNA的染色方法，如亚甲蓝[9]、亮甲酚蓝[10]、结晶紫[11]、以及尼罗河蓝[12，13] 等。但是，这些染料染色和脱色时间长，而且灵敏度较低，普遍不如荧光染料。为此，本发明人经过长期实践研究，令人惊讶地在发现成本低的乙基紫(ethyl violet, EV)可用于在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色，其可以在20分钟的染色时间内检 测出低至0.8-1.6ng级的DNA，灵敏度是尼罗蓝(NB)的四倍，近似甚至超过EB等荧光染 料的灵敏度。EV在现有技术中被报道用于对哺乳动物组织、蛋白质进行染色[14-17]， 但是未见有报道用于对聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离的DNA染色。本发明人还优化出了使 用EV对在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其可以在短至20分钟的时间内以染色 这样简单的步骤完成而仍旧能够保持近似甚至超过EB等荧光染料的灵敏度。另外，本发 明人还发明了基于上述染色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
发明内容
本发明的目的在于提供EV染色法，其能对在聚丙烯酰胺凝胶中的DNA染色， 该方法安全、操作方便、成本低，而且灵敏度高，达到甚至超过EB等荧光染料的灵敏 度。另外，本发明的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。具体而言，在第一方面，本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染 色的方法，其特征在于，所述方法包括将聚丙烯酰胺凝胶浸入pH为5.5-9的含乙基紫的 染色液中染色。本发明第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA后使用，对 聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带进行染色，尽管不优选，但是该方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙烯酰胺凝胶中之后使用。
EV是一种无毒性的三苯甲烷染料，其结构式如图1所示。本发明人经研究发 现，EV的分子结构和DNA分子具有很强的亲和力，但是EV分子结构和聚丙烯酰胺结合 的能力则弱得多，从而能够使DNA(相对于聚丙烯酰胺凝胶基质)显出颜色；而且其对 DNA的显色能力受pH这样的环境因素影响很大。如图2B所示，在小于5.5的酸性环境 下以及在大于9的碱性环境下，EV对DNA的显色强度都急剧下降。在酸性环境下的下 降可能是由于DNA骨架上的磷酸基团上所带的负电荷被质子化了，使得DNA与EV之间 缺乏静电力的作用，从而EV难以和DNA通过静电力作用而显色了；而在碱性环境下的 下降，由于EV与OH_发生了化学反应(图4)，其产物不再具有显色能力。根据实验结 果，优选在本发明的第一方面，所述染色液的pH为6-8，如pH6、pH6.5、或pH7。染色后，聚丙烯酰胺凝胶无需脱色步骤。因此，优选本发明第一方面所述的方 法不包括脱色步骤。染色后的聚丙烯酰胺凝胶可以倒掉染色溶液后，就直接观察染色结 果，也可以洗去其表面残留的染色液，然后用于观察结果。优选在本发明的第一方面， 所述方法包括在染色后洗涤的步骤。更优选本发明第一方面所述的方法由将聚丙烯酰胺 凝胶浸入pH为5.5-9的含乙基紫的染色液中染色的步骤和在染色后洗涤的步骤组成。在 本文中，“洗涤”指的是用溶剂清洗聚丙烯酰胺凝胶，用以洗去上一步骤残留在聚丙烯 酰胺凝胶上的试剂。其中，优选溶剂是醇、水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲 液、PBS缓冲液等。洗涤的时间不必过长，可以是30秒至5分钟，优选是1分钟至3分 钟。优选洗涤是先用醇洗然后用水洗。在本发明的具体实施方式
中，先用50%乙醇溶液 冲洗1分钟，接着用去离子水清洗1分钟。优选在本发明的第一方面中，所述染色液中乙基紫的浓度为0.0005 %至 0.0015%,优选为0.0006%至0.0012%，最优选为0.0008%。本发明人经研究发现，EV 浓度过低，则染色后的颜色强度会有下降，而浓度过高，EV会使背景也过多地染上色， 从而降低图像的对比度。另外，在本文中如未特别指出，所述“溶液”均为水溶液，艮口 溶剂为水，优选明示出其中所含的溶质为所述溶液中的全部溶质；也优选对于液体溶质 来说，其百分比浓度指的是体积百分比浓度，而对于固体溶质来说，其百分比浓度指的 是质量百分比浓度。在现有的染色方法中，有机溶剂常用来作为染色的介质或固定剂，用以提高染 色强度，从而提高灵敏度。但是，本发明人经研究发现，有机溶剂并不能对聚丙烯酰胺 凝上的DNA有效提高染色强度。因此出于成本和配制方便的考量，优选在本发明的第一 方面中，所述染色液基本不含有机溶剂。其中，“基本”表示有机溶剂的含量小于5%， 优选小于1%，更优选小于0.1%，更加优选小于0.01%，在本发明的具体实施方式
中， 除了最初为了快速溶解EV而使用有机溶剂之外，稀释时不再添加有机溶剂。优选所述 有机溶剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。在现有的染色方法中，无机盐常用来降低凝胶背景上染色的程度。但是，本发 明人经研究发现，加入无机盐后随着凝胶背景上染色强度的下降，DNA条带的染色强度 更剧烈地下降。这可能是由于无机盐中的阳离子与EV竞争性地结合掉了 DNA双链上 磷酸基团所带的负电荷的缘故。因此，优选在本发明的第一方面中，所述染色液基本不 含无机盐。其中，“基本”表示无机盐的浓度小于5mM，优选小于ImM，更优选小于O.lmM,更加优选小于O.OlmM，在本发明的具体实施方式
中，除了为了调节pH加入酸 或碱而可能形成的无机盐之外，不再添加无机盐。优选所述无机盐选自NaCl、MgCl2、 ZnCl2和(NH4)2SO4之一或多种。最优选，本发明第一方面所述的方法中所述的染色液是 EV的水溶液，其中溶质仅是EV，溶剂仅是水。在本发明的第一方面中，染色的时间为至少5分钟。本发明人研究发现，染色 的时间可以不必过长。因此出于节约操作时间的考量，优选在本发明的第一方面中，染 色的时间优选为10至240分钟，更优选为15至45分钟，最优选为20分钟。在第二方面，本发明的目的在于提供用于本发明第一方面所述方法的试剂盒， 其包括分装的pH为6-8的含乙基紫的染色液。所述试剂盒还可以包括分装的醇，如50% 乙醇溶液。更优选所述试剂盒中染色液中各组分的含量如本发明第一方面所优选的那 样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如去离子水。在本文中，试剂盒具有本领域技术人员所能理解的含义，在本文中，其包括分 开的容器，分别包装(即，分装)不同的溶液。这样，不同的溶液之间不会发生混合。 其中，容器是任何能够保存其所储存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，优选是能够 长期保存其所储存的溶液的容器。另外，优选本发明第二方面的试剂盒还包括记载有本 发明第一方面所述方法的说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂 盒中；说明书也可以是直接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容 器上。 在第三方面，本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上检测DNA的方法，其 包括在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后进行本发明第一方面所述的方法。聚丙烯酰胺 凝胶电泳是本领域常规的技术，其方法步骤及使用的试剂、设备可参见《分子克隆实验 指南》(科学出版社，2002)等书籍或实验手册，也有许多已经商品化了。在第四方面，本发明的目的在于提供用于本发明第三方面所述方法的试剂盒， 其包括分装的聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂和pH为6-8的含乙基紫的染色液。聚丙烯酰胺凝 胶电泳试剂是本领域技术人员所熟知的，其可以通过商业渠道容易地购买。所述试剂盒 还可以包括分装的醇，如50%乙醇溶液。更优选所述试剂盒中染色液中各组分的含量如 本发明第一方面所优选的那样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如 去离子水。另外，优选本发明第四方面的试剂盒还包括记载有本发明第三方面所述方法 的说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂盒中；说明书也可以是 直接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容器上。在第五方面，本发明的目的在于提供乙基紫在制备用于在聚丙烯酰胺凝胶上对 DNA染色的染色液中的应用。本发明人经研究发现，EV的分子结构和DNA分子具有很 强的亲和力，但是EV分子结构和聚丙烯酰胺结合的能力则弱得多，从而能够使DNA(相 对于聚丙烯酰胺凝胶基质)显出颜色。因此，EV作为对聚丙烯酰胺凝胶中DNA染色的 有效成分可以配制入染色液中，从而制备形成用于在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的染 色液。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需 要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，尤其是权利要求书和说明书中位于括 号内的附图标记仅仅是为了方便阅读时的理解，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修 正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这 些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像 它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
图1显示了 EV的化学结构式。图2显示了本发明的EV染色法中以不同EV浓度和不同pH值染色的效果变化曲 线，其中，(A)为以不同的EV浓度染色得到的强度变化；(B)为以不同pH值染色得到 的强度变化。图中曲线分别针对上样量为12ng和6ng的泳道中大小为1353bp和1078bp 的DNA条带。图3显示了本发明的EV染色法与其他2种比较例的方法的染色照片，其中， (A)本发明的EV染色法，(B)现有的EB染色法，(C)现有的NB染色法。泳道从左至右 上样的 OX174DNA/HaeIII 分子量标记的量分别为(1)200，(2)100，(3)50，(4)25， (5)12.8，(6)6.4，(7)3.2，(8)1.6，(9)0.8，(10)0.4ng。图4显示了 EV与OH_反应的化学式。图5显示了本发明的EV染色法与现有的EB染色法的灵敏度比较图，其中， (A)本发明的EV染色法，(B)现有的EB染色法。泳道从左至右上样的IOObp DNA分 子量梯度标记的量分别为(1)100，(2)50，(3)25，(4)12.8，(5)6.4，(6)3.2，(7)， 1.6(8)0.8，(9)0.4，(10)0.2ng。
具体实施例方式以下通过具体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的材料、步骤均为本领 域技术人员所熟知的，如可参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)等书籍或实
验手册。1，实验材料乙基紫(EV)、溴化乙锭(EB)、尼罗蓝(NB)、丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺 (Bis) >四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、Tris、和硼酸购自Sigma-Aldrich Chemical Co. (St丄ouis，MO,美国)。ΦΧ174 DNA/HaeIII分子量标记(Cat # G1761)购自 Promega Corporation (Madison, WI,美国)；IOObp DNA 分子量梯度标记购自 TAKARA
公司(大连，中国)。其他化学产物均通过市售渠道购买。2，电泳和图像分析根据常规的聚丙烯酰胺电泳法进行，简要过程如下用TBE缓冲液 (89mM TB, 2mM EDTA, pH 8.3)溶解丙烯酰胺并聚合成8 %聚丙烯酰胺凝胶 (80mmX IOOmmX0.75mm),其中，丙烯酰胺与Bis的用量比为29 1。 分子量标记 用 Tris-EDTA(TE)缓冲液(IOmM EDTA，IOOmM Tris-Cl, pH 8.0)稀释成各个浓度并上 样到凝胶的各个泳道上对于上样的是OX174DNA/HaeIII分子量标记来说，使得每个 泳道的ΦΧ174 DNA/HaeIII分子量标记的上样量分别为200，100，50，25，12.8，6.4， 3.2，1.6，0.8，和0.4ng;对于上样的是IOObp DNA分子量梯度标记来说，使得每个泳道的IOObp DNA分子量梯度标记的上样量分别为100，50，25，12.6，6.4，3.2，1.6，0.8， 0.4，和0.2ng。溴酚蓝和二甲苯胺FF(xylene cyanol FF)作为电泳过程中指示前沿的标 记。用 Miniprotean III dual slab cells (BioRad，Hercules, CA,美国)和 PAC 300 (BioRad) 以20mA/凝胶的参数进行电泳，电泳直至溴酚蓝到达凝胶底部边缘，一般需要30分钟。
电泳完成后的凝胶分别用以下染色法进行染色并观察显色结果。用EV、NB染 色的凝胶利用扫描仪(Epson Perfection V700 Photo,美国)以600dpi的分辨率扫描成图 像；用EB染色的凝胶在302nm波长的紫外灯照射下用Molecular Imager Gel Doc XR成 像系统(BioRad)拍成照片(图像)，然后用计算机定量分析DNA条带的显色结果，其中 图像定量分析软件为 Multi Gauge software of Science Lab 2006 (FUJIFILM Corporation,日 本)。 3，本发明的EV染色法的实施例EV溶解于90%乙醇溶液中配成0.4%的EV溶液。然后，用去离子水将EV溶 液稀释成不同浓度的EV溶液，最终溶液中EV的浓度分别为0.0001%至0.002%;同时， 将EV溶液通过加入IM HCl或IM NaOH来调节成不同的pH值的EV溶液，最终溶液中 pH值分别为3至11;同时，将EV溶液通过加入甲醇、乙醇、甘油、丙二醇来调节成含 不同有机溶剂种类和浓度的EV溶液，使最终溶液中的有机溶剂的含量分别为0 (最初溶 解EV的90%乙醇溶液可以忽略不计)或5%至40%;同时，将EV溶液通过加入NaCl、 MgCl2> ZnCl2> (NH4)2SO4来调节成含不同无机盐种类和浓度的EV溶液，使最终溶液 中的无机盐浓度分别为OmM (调节pH时加入的酸或碱可以忽略不计)至200mM。电泳 后，使用多个聚丙烯酰胺凝胶分别浸入IOOmL各个EV浓度、pH值、有机溶剂种类和浓 度以及无机盐种类和浓度的最终溶液中进行染色，染色时间分别为5至240分钟。然后 用50mL 50%乙醇溶液冲洗1分钟，接着在IOOmL去离子水中清洗1分钟。这一系列实验的结果比较如下(I)EV的浓度对染色的影响溶液中以0.0002%-0.002% EV的浓度分别进行染色，其结果如图2A所示，综 合DNA条带的检测灵敏度以及DNA和背景之间的图像对比度，发现0.0008 %的EV浓度 是最佳的。尽管浓度低至0.0005%，EV仍旧能对凝胶上的DNA进行染色，但是染色后 的颜色强度会有下降，而高于0.001%的EV浓度会使背景也过多地染上色，从而降低图 像的对比度。(2)溶液的pH值对染色的影响溶液中以pH 3-11分别进行染色，其结果如图2B所示，综合DNA条带的检测灵 敏度以及DNA和背景之间的图像对比度，发现pH6-8是最佳的，在酸性和碱性条件下， 染色效果均会发生显著下降。(3)溶液中的有机溶剂对染色的影响在染色中，甲醇、乙醇、甘油、丙二醇等 有机溶剂常用来作为染色的介质或固 定剂，用以提高染色强度，从而提高灵敏度。但是，经过实验，发现这些有机溶剂以 5% -40%的浓度并不能对聚丙烯酰胺凝上的DNA有效提高染色强度。(4)溶液中的无机盐对染色的影响在染色中，NaCl、MgCl2> ZnCl2> (NH4)2SO4等无机盐常用来降低凝胶背景上染色的程度。但是，经过实验，发现加入无机盐后DNA条带的染色强度更剧烈地下降， 甚至当无机盐浓度超过IOOmM时，经20分钟的染色都无法检测到200ng的DNA分子量 标记。(5)染色时间对染色的影响用0.0008% EV溶液对 强DNA条带相对于背景的染色强度，超过20分钟 后灵敏度基本保持平稳，而低于20分钟则会时间长度依赖性地降低染色强度。4，比较例1 现有的EB染色法根据Sambrook J等[19]的手册进行染色。基本过程如下电泳后，聚丙烯酰胺 凝胶浸在0.5 μ g/mL的EB溶液中染色15分钟。5，比较例2 现有的NB染色法根据Yong-II Yang等[13]的论文进行染色。基本过程如下NB溶解于甲醇配 成0.1%的NB溶液，然后用20%乙醇将其稀释成0.0015% NB溶液。电泳后，聚丙烯酰 胺凝胶浸在IOOmL 0.0015% NB溶液中染色15分钟。在染色过程中，实验容器需用铝箔 包裹以避光。6，结果比较本发明的用EV对在聚丙烯酰胺凝胶中的DNA染色的方法能以约20分钟完成， 其可以检测到低至0.8ng的ΦΧ174 DNA/HaeIII分子量标记，超过现有的EB染色法的4ng 的检测效果，更远超过现有的NB染色法的检测极限(参见图3)。如图5所示，对于比较规律的DNA样品(如IOObp DNA分子量梯度标记)来 说，本发明的用EV对在聚丙烯酰胺凝胶中的DNA染色的方法的灵敏度和现有的EB染色 法相似，甚至能超过。参考文献[l]Aaij, C., Borst, P., Biochim.Biophys.Acta 1972，269，192-200.[2] Sharp, R.A., Sugden, B., Sambrook, J., Biochemistry 1973，12， 3055-3062.[3]Ohta, T.，Tokishita, S.I., Yamagata, H., Mutat.Res.2001，492，91-97.[4]Suenaga, E.，Nakamura, H., Anal.Sci.2005，21，619-623.[5]Tuma, R.S., Beaudet, M.P., Jin, X.，Jones, L.etal.，Anal.Biochem.1999,
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权利要求
1.在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括将聚丙烯酰 胺凝胶浸入pH为5.5-9的含乙基紫的染色液中染色。
2.权利要求1所述的方法，其包括在染色后洗涤的步骤。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液中乙基紫的浓度为0.0005%至 0.0015%,优选为 0.0006%至 0.0012%，最优选为 0.0008%。
4.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液基本不含有机溶剂，优选所述有机溶 剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。
5.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液基本不含无机盐，优选所述无机盐选 自 NaCl、MgCl2> ZnCl2 禾日(NH4)2SO4 之一或多种。
6.权利要求1或2所述的方法，其中染色的时间为至少5分钟，优选为10至240分 钟，更优选为15至45分钟，最优选为20分钟。
7.用于权利要求1-6之任一所述方法的试剂盒，其包括分装的pH为6-8的含乙基紫 的染色液。
8.乙基紫在制备用于在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的染色液中的应用。
9.在聚丙烯酰胺凝胶上检测DNA的方法，其包括在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然 后进行权利要求1-6之任一所述方法。
10.用于权利要求9所述方法的试剂盒，其包括分装的聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂和pH 为6-8的含乙基紫的染色液。
全文摘要
本发明涉及乙基紫(EV)在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其中染色液为pH为6-8的含乙基紫的溶液。另外，本发明还涉及基于上述方法的在聚丙烯酰胺凝胶上检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
文档编号G01N27/447GK102021230SQ200910170880
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月12日 优先权日2009年9月12日
发明者丛维涛, 冯治国, 张美玲, 朱忠欣, 李校堃, 林绍强, 梁广, 金利泰 申请人:温州医学院