专利名称：：一种蜡图案化硝酸纤维素膜、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生化分析产品开发及其应用，特别涉及一种蜡图案化硝酸纤维素膜、其制备方法及应用。
背景技术：
：硝酸纤维素膜作为一种常用的蛋白吸附、固定、反应的基底材料已经得到了广泛的应用，比如常见的斑点免疫，早孕试纸等。而相对于传统的硝酸纤维素膜，本发明利用喷蜡打印的制作方法所得到的蜡图案化硝酸纤维素膜具有蜡/硝酸纤维素交替组成、亲疏水相间的结构。微流控芯片(Microfluidics，Lab-on-a-chip)是一个跨学科的新领域，指的是把生化领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。它是微纳米技术的重要组成部分，也是系统生物学研究的主要技术平台之一。微流控芯片的主要制作材料包括硅，玻璃，石英，聚合物(最常用的为聚二甲基硅氧烷和有机玻璃)。近年来，哈佛大学Whitesides小组开始使用低成本的滤纸作为芯片制作的基底材料(PatternedP即erasaPlatformforlnexpensive，Low—Volume,PortableBioassaysAndresW.Martinez,ScottT.Phillips,ManishJ.Butte，andGeorgeM.WhitesidesAngew.Chem.Int.Ed.2007,46，1318-1320)。这种以纸为基底材料的微流控芯片具有以下的优点1、制作方法简单、快速、成本低；2、反应单元和驱动单元完全集成于芯片上；3、不需要软件的控制，无需外界接口；4、不需要外动力源，适合野外分析；5、体积小、成本低、操作特别简单。由于其具有发展便携化、低成本诊断分析平台的前景，因而这方面的研究也在迅速展开之中。而目前文献报道的制作纸质微流控芯片的基底材料主要为纯纤维素组成的普通滤纸，比如Whatman公司生产的一号滤纸。但是这种纯纤维素组成的普通滤纸蛋白吸附能力差，因而不适合作为蛋白固定的载体，不能在这样的芯片上完成免疫分析等诊断分析操作。本发明采用由硝化纤维素组成的硝酸纤维素膜这一常用的具有很强蛋白吸附能力的材料取代普通的滤纸制作了纸质微流控芯片，具有以下的优点1、由硝酸纤维素膜制成的纸芯片具有很强的蛋白吸附、固定的能力，因而免疫分析可以在此芯片上很好的完成；2、与普通滤纸的平均孔径(10到100微米)相比，硝酸纤维素膜的平均孔径(0.45微米)更小，因而在喷蜡打印后的烘烤过程中，蜡在硝酸纤维素膜上的扩散可以得到更好的控制，因而可以得到最小100微米尺寸的微通道，同时得到的图案的边缘也更为均匀；3、硝酸纤维素膜的平均孔径为0.45微米，因而微米尺寸的固体可以被截留，所以蜡图案化硝酸纤维素膜可以用来过滤微米级别的杂质，样品处理能力更强；4、与普通滤纸相比硝酸纤维素的表面更为均匀，因而液体在其上面的流动更为均为和重复；5、与普通滤纸相比硝酸纤维素膜的纤维素更为致密，因而可以承受的机械强度更大。因此利用硝酸纤维素膜制备纸质微流控芯片具有十分重要的意义。
发明内容本发明的目的是提供一种蜡图案化硝酸纤维素膜、其制备方法及应用。本发明提供了一种蜡图案化硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜为正面、背面与内部均为蜡区域和硝酸纤维素区域交替出现、亲水区域和疏水区域交替出现的结构。这样液体样品就可以通过蜡的限制作用到达指定反应区域，完成反应分析。同时由于蜡的限制作用，各个反应区域不会相互干扰。本发明还提供了硝酸纤维素膜的制备方法，用电脑设计所需要的图案，然后用打印机将蜡打印到未处理的硝酸纤维素膜的表面，将打印好的硝酸纤维素膜放入高温容器(如烘箱、热板等)中烘烤，烘烤温度为100摄氏度至150摄氏度之间，烘烤时间为4分钟至1个小时之间，使蜡熔化并透过硝酸纤维素膜，形成蜡/硝酸纤维素交替组成、亲疏水相间的硝酸纤维素膜，然后取出冷却，即得到蜡图案化的硝酸纤维素膜。整个过程可以在5-10分钟之内完成，操作简便。本发明提供的硝酸纤维素膜的制作方法，所述制作工具采用商业化的喷蜡打印机和烘箱，打印操作灵活、简便、快速，烘烤操作也同样简便快速。因而利用本方法可以大批量的制作低成本的蜡图案化硝酸纤维素膜，非常适合于商业开发。本发明提供的硝酸纤维素膜的制备方法，所述高温容器为烘箱、热板等容器中一种；所述打印机为喷蜡打印机。本发明提供的硝酸纤维素膜可应用于蛋白吸附、固定，蛋白图案化等分析操作，并可有效的抑制蛋白固定中常常存在的咖啡环效应；可应用于免疫分析(如斑点免疫等)等分析操作；还可利用硝酸纤维素膜的亚微米的孔径对微米尺寸的杂质进行截留实现样品纯化等分析操作。也可应用于尿液、血液、唾液、水等各种液体样本的多指标生化分析，如用于尿液检测试纸、水质监测试纸等。本发明蜡图案化硝酸纤维素膜可以完成尿液、血液、唾液、水等各种液体样本的过滤，去除其中微米尺寸的杂质(比如细胞等)，将尿液、血液、唾液、水等各种液体样本直接应用于生化分析中。本发明的创造性在于1、硝酸纤维素膜这一常用的具有很强蛋白吸附能力的材料取代普通的滤纸制作了纸质微流控芯片，并在这种膜上完成了免疫分析操作；2、用喷蜡打印机快速、大批量制作快速蜡图案化硝酸纤维素膜，操作简便，制作速度快，非常适用于商业化。本发明具有制作方法简单、快速、成本低等优点。图l喷蜡打印制作蜡图案化硝酸纤维素膜的流程，其中1为硝酸纤维素膜，2为打印步骤，3为烘烤步骤，4为蜡图案化硝酸纤维素膜，5为侧面图，6为蜡，7为硝酸纤维素。图2打印上蜡的硝酸纤维素膜正面在烘烤前后的变化。图3打印上蜡的硝酸纤维素膜后面在烘烤前后的变化。图4打印上蜡的硝酸纤维素膜横切面在烘烤前后的变化，其中1为蜡。图5是通过蜡图案化形成硝酸纤维素微通道在制作前后的变化，其中1为平行打印的正面，2为垂直打印的正面，3为平行打印的背面，4为垂直打印的背面，5为平行打印600微米通道，6为垂直打印600微米通道。图6是硝酸纤维素膜的孔径在制作前后的比较(标尺为3微米)。图7为蜡图案化形成的通道的最小打印尺寸。图8是蜡可以起到疏水间隔作用的最小尺寸，其中1为60微米。图9为蜡图案化形成圆形和方形图案在硝酸纤维素膜的最小尺寸，其中1为200微米，2为1000微米，3为400微米。图10是蜡图案化硝酸纤维素膜蛋白吸附能力的表征及其与未处理的硝酸纤维素膜蛋白吸附结果的比较，其中1为蜡图案化硝酸纤维素膜，2为硝酸纤维素膜。图11为蜡图案化硝酸纤维素膜蛋白吸附结果与加样体积的关系(3毫米反应尺寸)，从图上可以看出只有当包被体积超过4微升时，包被区域才能结果均匀。图12为各种不同形状的蛋白包被结果，其中1为1毫米XI毫米，2为1毫米，3为800微米，4为300微米，5为1000微米。图13蜡图案化硝酸纤维素膜用于人免疫球蛋白荧光免疫分析的工作曲线及50微克/毫升人免疫球蛋白免疫分析单元结果的均匀性分析，其中1为50微克/毫升的人免疫球蛋白的分析结果。图14蜡图案化硝酸纤维素膜用于人免疫球蛋白显色免疫分析结果(利用胶体金作为免疫标记并结合银染色放大信号)，其中1为空白，2为1纳克/毫升人免疫球蛋白，3为10纳克/毫升人免疫球蛋白，4为100纳克/毫升人免疫球蛋白，5为1000纳克/毫升人免疫球蛋白，6为10000纳克/毫升人免疫球蛋白。图15蜡图案化硝酸纤维素膜用于样品过滤及其过滤能力与蜡图案化的普通滤纸的比较(1微米的硅胶颗粒与小分子量的苋菜红溶液作为测试溶液)，其中1为1微米的硅胶颗粒，2为苋菜红溶液，3为蜡图案化普通滤纸，4为蜡图案化硝酸纤维素膜，5为正面图，6为背面图，7为50毫克/毫升，8为5毫克/毫升，9为0.5毫克/毫升。具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例1:蜡图案化硝酸纤维素膜的制备方法用绘图软件在电脑上设计好所需要的图案，然后用喷蜡打印机在硝酸纤维素膜上打印蜡图案，再将表面打印有蜡的硝酸纤维素膜放入125摄氏度的烘箱中烘烤5分钟(此过程中蜡将熔化并透过硝酸纤维素膜)，然后取出冷却，即到了蜡图案化的硝酸纤维素膜。具体流程如图1所示(主要包括打印和烘烤两步，整个流程可以在10分钟之内完成)。用这种制备方法制备的蜡图案化硝酸纤维素膜的外观，尺寸，表面形貌等表征如图2，图3，图4，5，图6，图7，图8，图9所示。这种制作方法简单、直接、成本低，制作速度非常快，非常适合于大规模制作蜡图案化硝酸纤维素膜，具有商业化前景。实施例2:用蜡图案化的硝酸纤维素膜进行免疫分析，具体实施过程如下整个荧光免疫分5析过程(以人免疫球蛋白(IgG)作为模型分析物)说明如下1、在由蜡限定的3毫米尺寸的图案化硝酸纤维素膜反应单元中加入羊抗人免疫球蛋白溶液，由于硝酸纤维素具有较强的蛋白吸附能力，因而抗体蛋白会吸附在其表面上，蛋白在蜡图案化硝酸纤维素膜上的包被表征如图10，图11，图12所示；2、加入5毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液(BSA)，BSA溶液对反应区域进行封闭以降低非特异性吸附；3、加入洗涤液PBS+0.05%Tween20，洗涤反应区域；4、加入人免疫球蛋白的样品，样品中的人免疫球蛋白与反应区域中上包被的羊抗人免疫球蛋白免疫反应；5、再加入洗涤液PBS+0.05%Tween20，洗涤反应区域；6、加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人免疫球蛋白溶液，异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白溶液与上一步反应步骤中免疫反应的产物结合，形成待检测的免疫复合物；7、荧光检测，得到免疫诊断结果。以上步骤中每步加入的溶液的体积为4微升。以人IgG作为模型分析物在该免疫分析系统上得到的人IgG的工作曲线，如图13所示。蜡图案化的硝酸纤维素膜进行胶体金标记免疫分析并进行银染色放大的过程如下1、同荧光免疫分析中1-5步骤；2、加入胶体金标记的羊抗人IgG溶液，胶体标记的羊抗人IgG溶液与上一步反应步骤中免疫反应的产物结合，形成待检测的免疫复合物；3、再加入洗涤液PBS+0.05%Tween20，洗涤反应区域；4、加入双蒸水洗涤反应区域；5、加入现配制的银染色溶液，加入到反应区域，进行银染色。胶体金免疫结合银染色得到分析结果如图14所示。实施例3:用蜡图案化的硝酸纤维素膜去除样品的杂质。由于硝酸纤维素膜的孔径很小，只有O.45微米，因而微米尺寸的杂质都可以得到截留，如图15所示。1微米尺寸的硅胶颗粒在蜡图案化的硝酸纤维素膜上得到了截留，而1微米尺寸的硅胶颗粒在蜡图案化的普通滤纸上没有被截留。而小分子苋菜红在两种蜡图案化硝酸纤维素膜和普通滤纸上都可以通过，因而蜡图案化的硝酸纤维素膜的样品可以用于去除各种生物液体样本如血液、尿液中微米尺寸的杂质如细胞等，而在背面进行小分子的反应分析操作。权利要求一种蜡图案化硝酸纤维素膜，其特征在于该硝酸纤维素膜为正面、背面与内部均为蜡区域和硝酸纤维素区域交替出现、亲水区域和疏水区域交替出现的结构。2.权利要求l所述硝酸纤维素膜的制备方法，其特征在于用电脑设计所需要的图案，然后用打印机将蜡打印到未处理的硝酸纤维素膜的表面，将打印好的硝酸纤维素膜放入高温容器中烘烤，烘烤温度为100摄氏度至150摄氏度之间，烘烤时间为4分钟至1个小时之间，然后取出冷却，即得到蜡图案化的硝酸纤维素膜。3.按照权利要求2所述硝酸纤维素膜的制备方法，其特征在于所述高温容器为烘箱、热板一些容器中一种。4.按照权利要求2所述硝酸纤维素膜的制备方法，其特征在于所述打印机为喷蜡打印机。5.权利要求1所述硝酸纤维素膜应用于蛋白吸附、固定，蛋白图案化；免疫分析；对微米尺寸的杂质进行截留实现样品纯化一些分析操作。全文摘要本发明提供了一种蜡图案化硝酸纤维素膜、其制备方法及应用，该硝酸纤维素膜为正面、背面与内部均为蜡区域和硝酸纤维素区域交替出现、亲水区域和疏水区域交替出现的结构；其制备方法是用电脑设计所需要的图案，然后用打印机将蜡打印到未处理的硝酸纤维素膜的表面，将打印好的硝酸纤维素膜放入高温容器中烘烤，然后取出冷却，即得到蜡图案化的硝酸纤维素膜；本发明应用于蛋白吸附、固定，蛋白图案化；免疫分析；对微米尺寸的杂质进行截留实现样品纯化等分析操作；本发明制作方法简单、直接、成本低，制作速度非常快，非常适合于大规模制作蜡图案化硝酸纤维素膜，具有商业化前景。文档编号G01N21/64GK101726591SQ20091022059公开日2010年6月9日申请日期2009年12月9日优先权日2009年12月9日发明者施维维,林炳承,秦建华,陆瑶申请人:中国科学院大连化学物理研究所