专利名称：计数玉米须或其它多个细长丝束的设备和系统及该计数用于表征丝束或其来源的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有比较高的吞吐能力/处理能力和可接受的准确性的、对比较小的离散的细长丝束或项目进行的自动地或半自动地计数，并且特别地将所述计数用于各种应用。本发明的一种特殊的应用是计数植物的比较小的细长部分(例如，玉米穗的须)，并且将所述计数用于有益的目的，例如，表征植物或其基因型，或测定植物或其基因型是否具有希望的性状或特性用于进一步研究或商业目的。
背景技术：
植物性能的改进是非常可取的。最终用户希望在给定的条件下很好地进行的变种和杂交种。因此种子公司消耗相当大的资源来开发变种和杂交种以符合那些要求。然而，与植物相关的研究和开发是复杂的，劳动密集的和耗时的。这在植物科学家改进研究方法方面寄予了相当大的需要。一个实施例涉及玉米。已经发现从玉米植物的穗中露出的须的数目可以尤其是一种植物潜在的种子产率的良好指示器。因此，科学家可以人工地计数在近交/自交 (inbred)或杂交遗传线上的须，并对于该变种或杂交种预测潜在的产率、或产率构成因素。 这可以帮助决定所述特别的近交种或杂交变种是否为继续开发或商品化的良好候选对象。 本领域中公知，实验评价经常包括同时观测成百或成千的不同变种或杂交种以得到可取的特性。然而，计数须的传统方法包括人工地计数每个须部分。所述玉米须的性质，其在有时全体被称为刷子的时段期间内形成，使得手工计数非常费时和乏味或劳动量大(通常每穗有大概数百的须，每个须具有小的直径并且长度长成若干英寸)。每个比较小的须丝束应当只能被确定地识别和计数一次。这有点像在一个辫子或一束头发上计数单根的人类头发。它不仅占用大量的时间，也经常会有误差，尤其是如果一个工人不得不在一段延长时期内计数多个穗的须。不需要取下所述穗即得到须的数目是有利的，这使得所述穗可以被授粉、而没有与一种尚未经采样的植物的实质性差异。如果计数是在户外的一种活的植物上进行，由于不利的环境条件(例如，风，热，污物)，它会更繁重。快速获得所述数目也是有利的，这使得可以尽早做出有关近交或杂交线的决定。 传统的计数须的手工方法可能需要大量的劳动和时间，其可能耽误有效地使用所述须数目信息的能力。可以理解的是，所述劳动成本和耽误被待计数的植物数目放大，其在某些有商业价值的种子实验中可能是成千上万的。此外，须在不同的时间和速率下形成，使得全面计数困难，尤其是当所述计数是在须形成时间窗中早期地进行的情况下。因此，在本领域有提供一种玉米须计数设备或系统的客观需要，其可以存在潜在的改进在
a.处理能力(每次计数的平均时间)；b.时间；
c.准确性；
d.可再现性和可重复性；
e.便利性；
f.便携性；和
g.灵活性。对至少部分地使所述计数自动化进行、并且处理与计数和植物或穗相关的数据的能力有需求。这可以是有利地用于，例如，评价产品产量受环境、基因型或农事管理实践的影响。它还有利于使授粉最大化和使不定因素的存在最小化。Anderson等人在2004 Crop Sci 44:464 - 473中讨论授粉和籽粒败育对产量的影响，其并入此处作为参考。因此，对更快需要、更高处理能力、更有效和更准确的用于须计数的设备和系统有需求。对定量地、准确、快速、可靠和可重复的从玉米和其它植物抽取须样品的方式有需求。 对定量地、准确、快速、高可靠性和可重复地计数玉米和其它植物的须的方式也有需求。同样地，对表征植物须的形成、生长和其它特性的改进的设备和系统有需求，在植物或植物的变种之间比较这些特性，评价环境或农事实践，和/或例如在工业生产、植物育种或研究和开发中为了进一步地使用或不使用，针对它们的性状或特性评价植物或植物变种。计数玉米植物或者其它植物的比较小的细长部分或项目的其它类型具有类似的问题，其可以通过本发明一个或多个方面以类似的方式解决。此外，在采集定量的待计数部件或项目样品、和计数多个细长的非植物丝束或碎片方面，可以获得类似的好处。一些非限制实施例包括纤维光学器件，头发，螺纹，纤维，长丝，一束线，丝线，肌腱，细绳等等。所述计数可以被用于例如品质控制检查以确定多捆丝束的每一个包括一致的丝束数目。另一个实施例将是在组或捆的丝束之间检查变种。
发明内容
本发明的一个方面涉及自动地或半自动地计数穗须的设备和系统以减少手工计数的劳动和时间日常开支。所述设备和系统可以用于其它类型植物上须的类似计数，或者其它植物部分或相关项目的计数，或者非植物项目的计数。本发明的另一个方面是为了增加从玉米穗获得与须数目有关的数据的速度，所述数据可以有利地用于各种目的，包括但不限于，(a)更早且更好地选择显示出可取的表现型或者基因型的植物，(b)理解植物的生物进程用于研究和开发目的，或者(C)与从所述植物生产种子相关的计划和业务管理。本发明的另一个方面涉及以可以使用图像评价设备或系统计数的形式来获得多个细长丝束或碎片的定量样品。就玉米须而言，本发明的另一个方面包括能够获得样品而不会对所述穗有不利影响。本发明的另一个方面包括用于量化比较小的伸长片的高处理能力系统。获得碎片切屑的定量样品并使之悬浮在液体中。所述样品孤立地放置，促进了包含样品的切屑以通常在一个平面均勻地分布。用经预编程的图像测量或者分析软件来分析基本上与所述平面正交捕获的、并在平面或在平面附近聚焦的图像，以识别和计数图像中的表示样品切屑的每个对象。多个样品的每一个的图像可以有效和顺序地捕获并储存。图像分析也可以有效地进行。这可以导致与现有的设备和系统相比，相对较高的多个样品处理能力。本发明的另一个方面包括了 基于所述碎片的样品切屑的、数量准确和可靠地量化碎片的数目，然后使用所述量化。所述使用可以简单地是一个统计上有效的或者可接受的计数，或者可用于表征出样品、表征出捕获样品的碎片，或者表征出一些其它与所述碎片或者样品相关的参数。例如，就玉米须而言，所述须计数量化能够用于，尤其是，在植物育种中的选择目的、遗传改进、分批生产、评价转基因处理的影响或者确定与须生产或者穗生长有关的分子标记。使用须量化的另一个方面是为了评估种植和环境因素在须生产方面的影响。为了有商业价值的或者研究目的，它也可以用来用可取的性状或者特性确定植物或者植物的变种。例如，本发明允许研究人员从单独的玉米植物快速地抽取须和定量地测定每穗须的数目。这些信息可用于测定父本线/父本品系的产量潜力，其能够用作确定出父本线在商业种子生产中的用法。所述信息可以用作表型信息以寻找用于须生产的分子标记。所述设备和系统可以用于(生产多个薄而细长组织的)其它植物。所述设备和系统可以适于为了各种用途对其它多个丝束或者伸长的片的比较高处理能力和至少半自动量化的计数。
下列附图不时地在该说明书中附加和引用。其意图是补充该说明书并且并入此处作为参考。A.附图 1.切割工具
图IA是适用于切割玉米植物的须刷以从每个玉米须里获得基本上相等的样品的切割工具的一种示例实施方案的一部分的简化草图。它还可以用于从植物和非植物的其它细长丝束或碎片获得一组样品切屑。图IB是以开放位置示于图IA中的整个切割工具的透视图。图IC是移入相对于生长玉米植物的须刷的一种前端位置中的图IB中的工具的透视图。图ID是在取样的准备中沿着须刷往下移动仅高于外壳的图IB中的工具的透视图。图IE和IF是在取样前后显示植物剩余须刷的透视图。2.实施方案一通过使须切屑成像进行计数图2是图IE中所取的样品可放入的容器的草图。图3A是图2中所取的样品可放入以根据本发明的第一示例性实施方案使样品成像的培养皿的草图。图;3B是表示样品碎片如何分布用于成像的图3A简化顶部平面简图。图3C是图;3B透视图中真实培养皿和样品的图片。图4是为了获得图3C所示类型图像的一种图像测量点的简图。图5是用于获得图3C的图像的系统的图解。图6是为了从图像中自动计数样品碎片的图3C中的图像类型的简化图解简图。图7是表示样品图像和自动计数的样品碎片结果的计算机屏幕显示器。
图8是用前述附图表示的计数流程图。3.实施方案二 通过检测器来计数须切屑为流量
图9是根据本发明的第二个可选示例性实施方案的须样品自动计数系统的图解图。图10是根据图9的原型系统的图。图11是根据第二个示例性实施方案的可选系统的图。图12A-E是图10或11中部件的分解图。4.实施方案3 计数出丝束的横截面
图13是根据本发明第三个和可选示例性实施方案一部分的放大图，其中获得切割玉米须刷的横截面，并人工计数或在横截面的图像上计数每个须。图14A是显示了在切割准备中产生一束须样品的设备和系统。图14B是图14A的这束须刷样品一端的末端平面图。图Hc表示图13的一个任选步骤，即对外露的横截面着色以试图实现来自对捆束的单个须的更好的对比。5.须数目的用途和关联性的实例
图15是表示利用示例性实施方案一的图像分析的须数目准确性的图。图16是表示利用示例性实施方案二的流体流量和光检测器进行须计数的须数目准确性的表。图17是表示基因型之间须数目可变性、并表示须随时间的生长曲线的图。
具体实施例方式A.概述
为了更好地理解本发明，将对示例性实施方案进行详细描述。需要理解的是这些不是可以表达本发明的唯一方式，而是为了举例和例证本发明的原则和方面，其不被这些特定实施方案限制。B.上下文
为简单起见，将主要在计数玉米须的上下文中讨论所述示例性实施方案。需要理解的是实施方案和本发明可以用于计数其它项目，包括但不限于其它比较小的、细长的多个丝束或者植物碎片，或者其它无论是否与植物有关的比较小的、细长的丝束或者项目。C. 一般示例方法
图8描绘了从“源”中提取样品的方法(通常称为方法90 )。在一般方法的上下文， 所述“源”意在指最初的或者开始的收集或者捆束的多个碎片或项目。这些碎片或者项目可以是直径比较小的细长丝束。一个实例是植物的须。另一个植物实例是芹菜的纤维或者丝束。非限制性非植物实例是纤维光学器件，头发，螺纹，纤维，长丝，一束线，丝线，肌腱，细绳，昆虫或者昆虫部件，卵，花粉粒，花粉管等等。图8的方法90也描绘了量化那些开始的堆或者捆束的方法。1.试样收集
识别开始的多个未量化的碎片(图8，步骤91)，例如，给所述起始的捆束唯一的标识以追踪那些起始的捆束、并将其单独碎片的计数与该唯一的标识关联起来。技术人员具有捆束识别的先验知识，并维持着该识别与从起始的捆束收集的样品之间的关联。可以写下该唯一标识，存在于相关的标签或者贴上，记录在手持电脑或其它装置上，或作其它分配。一种堆积方法切割或者以其它方式分离或者除去起始捆束的一部分(图8，步骤 92)。这套起始捆束的分离碎片包含所述捆束的样品。所述样品可以放入单独的贴有标签的容器(图8，步骤93 )以从其它样品中分离每个样品并识别所述样品。所述标签可以是或者包括条形码，或者是可以从其得出对开始捆束的识别的、或者放有唯一标识在其上的其它标志。有关所述标签的信息可以是可机读的。如果不使用容器，可以使用维持着开始捆束的识别与样品之间关联性的一些其它方法。各种方式可用于获得样品。某些在后面的更具体的示例性实施方案中讨论。在某些实施例中，取自整个捆束的部分旨在分离和保藏每个丝束捆的基本上类似长度的部分。 理想地，所述捆束的部分将包括切屑或者每一个丝束捆的部分。这将是开始的丝束捆的数目的定量样品，即使不准确。因此，方法90描绘了一种过程，其已被发现用以提供一种对于组成了所述开始捆束的离散的、类似尺寸的丝束部分而言的相对快速且统计上代表性的采样。2.量化
方法90也提供了一种用于获得统计上可接受的定量样品的方法，只要其是被收集的。 应当注意所述量化工艺可以用于收集工艺的步骤91 一 93，也可以用于那些已经通过其它方法收集的样品，只要所述样品是定量地获得的。通过定量地获得样品，意味着能够在统计上可接受的误差边际范围内测量源自所述开始的丝束捆的有效数目。可以选择这些误差边际范围用于给定应用。理想地它将是准确的。但是为了多种目的，+/- 至5%的误差边际范围可能是足够的。在某些情况下即使更大的误差边际范围可能是可接受的。量化通过一般在平面上分布组成样品的切屑或部分而获得(图8，步骤％)。所述样品的标识可以首先被读取、储藏、并且与所述样品关联(步骤94)。作出所述分布的样品的图像(步骤96)。在方法90中，所述样品的分布任选地可以在一个单独的腔室或者容器中。要么成像所述容器底部的整个区域，或者成像预定的次区域。无论哪种情况中，样品在平面上相对均勻分布将允许单个切屑或碎片的定量计数。在一个实施例中，所述样品可以任选地悬浮于液体中以帮助贯穿平面地均勻分布。在多数情况下，所述样品的切屑或碎片将倾向于由于重力沉降到容器的底部，因此沉降在一个平面上。此外，它们将倾向于随着平行于平面的纵轴沉降，结果所述平面的图像将很可能捕获每个切屑的长度尺寸。通常地，所述液体不应该是对所述切屑有破坏性或者改变它们的尺寸(至少不相对于彼此)。为了长期储存，所述液体也可以用来保藏样品。样品的图像或者其相关的已知区域，可以使用成像设备获得(例如，照相机一基于数字成像功能)。可以使用大量可市购的成像系统的任一种。也可以是定制的。与所述图像相兼容的图像分析软件可用于标识(步骤97)和计数(步骤98)在图像中出现的样品的单个切屑或者碎片，与可能是掺入样品中或者在所述图像中出现的那些碎屑或者不相关的项目对比。通过对所述图像分析软件进行合适的编程，一个或多个尺寸或者其它标准可以用来定义切屑，并且所述图像分析软件将在图像中识别那些符合编程的尺寸或者标准的对象。有效标识的对象可以是通过所述软件自动计数。所述计数将是开始的丝束捆的总丝束的量化。所述计数可以被存储，例如在数据库中(步骤99)，与样品的标识相关联，其也可以关联回到所述样品来自的最初开始的捆束的标识。因此，方法90表述了一种方法，通过该方法，可以得到对于来自于开始捆束的多个丝束或碎片的捆束或碎片的统计上可接受的量化。本领域技术人员可以理解，至少与手工计数比较，所述量化可以相当快速地进行，即使针对大量的样品。如图8中表明，步骤 91 一 99可以重复作为后续的样品。因此，量化可以在比较高的处理能力下完成且具有良好统计准确性，然后被存储以在逐个样品基础上进一步使用。此外，可以管理样品收集工艺以快速和有效地连续提取大量样品并制备它们用于成像和计数。所述成像和/或计数可以在样品提取后立即进行或者在更迟的时间进行，其是适当的或可取的。例如，在第一时间段获得多个样品，将所述样品储存于贴有标签的管形瓶中，然后在更迟的时间或时间段来成像和分析所述图像对于给定的应用可能被认为是更有效的。另外，对某个应用来说可能优选的是相对快速地获得所述样品和图像，但是此后将图像分析延迟一段更迟的时间。例如，对大量样品成像，然后在更迟的时间批量处理所述图像可能被认为是更有效地利用时间。因此方法90对于人和设备资源的使用和分配具有很好的灵活性。所述方法也已经发现是可重复的和可再现的，因此具有高可靠性。液体处理系统，例如在实验室操作中是公知的，可以被添加以使得液体的添加自动化、并从管形瓶或者容器中提取样品、并且移动悬浮在大量已知液体中的样品进行图像分析。这种液体处理系统是可市购的，并可以被编程以实现所需功能。这可以提高所述方法的效率。方法90可用于测定开始的捆束或者开始的捆束的部分样品中丝束或者碎片的数目。获得的信息可以用于其它目的。3.样品的组织和储存
本领域技术人员可以理解，有许多方式可以有效和有序的方式处理和组织在方法90 中获得的大量样品。广泛用于实验室环境的一种方法是利用小管形瓶，闪烁管形瓶，或者用于容纳和分离单个样品的其它容器。另一种是利用多孔托盘作为一种用以分离、储藏和保持多个样品标识的关联的便捷方式。标签(例如可机读的标签，比如条形码)可以位于所述托盘或者其它容器上，并包括有关所述容器和容器中样品的标识信息。每个容器的体积可以大到足以容纳悬浮在液体中的完整样品。自动化的液体处理系统或人工操作的移液管，比如在本领域已知的，可用于移动悬浮在液体中的样品往返成像、同时保持标识信息对每个样品的关联。4.计数的利用
可以理解的是，对一个样品或者一组样品获得的定量计数可以用于许多方式。一些示例性的实施例包括如下。存在这样的情况其中检查是否制备或者组建的丝束捆具有相同数目的丝束将是有利的。纤维光学器件捆束可能需要具有相同数目的丝束以便每个存在的相同数目的槽道、或者在所述捆束上光调制传递的能力。方法90可用于至少点样检查随机的捆束以证明每个组建的捆束具有相同数目的丝束(在误差边际范围内)。如果测得在误差边际范围外的数目，所述方法可以产生警报或者报警。相同工艺可用于检查包装的螺纹，电线等等的一致数目。所述方法可以保持捆束的数目在品质控制的误差边际范围内。另一方面，存在这样的情况其中测量出在捆束之间的丝束数目是否有可变性是有利的。正如提到的，一个实施例将是玉米须。方法90可用于标识那些显示出表示更高产量的可取的须数目的玉米基因型。使用和应用须计数的其它实施例随后进行描述。因此，上述一般方法提出了在本领域中标识的需求。下面是可以实现一般方法方面中形成的特定的示例性、非限制性实施例。D.特定的示例性实施方案一一图像分析 1.概述
第一个示例性实施方案，称为实施方案一，获得每个玉米穗的每个须的短链段或者切屑，将它们基本上在一个平面分布，成像所述平面，并利用图像识别软件标识出表示单个须链段的图像部分以及自动计数所有这类链段。所述结果以识别出得到所述须链段的穗(或者其变种或者基因型)的方式储存，这允许对信息的计算机化数据处理以作各种应用。这些实施方案允许小的须样品被移出活的玉米植物，而不显著地影响所述植物的持续生长生命力。随着须继续生长，所述穗可以以规则的方式被授粉和成熟。所述计数可以按需完成(例如在试样收集后相对快速地、或者在更迟的时间进行)。可以获得多个植物的样品并带到一个计数设备以高效地处理。已经发现这显著地减少了须计数的时间，并且计数准确性在可接受的范围之内。此外，该实施方案允许第一时间取须样品，并且获得并计数相同植物的一个或多个后续的样品(例如，如果须在取样时间之间足够地生长)。这可以用于，例如，记录须从相同植物随时间生长或者形成的参数。a)切割工具
图IA-E表示可用于从植物获得样品的切割工具10。两个刀片14和16 (单个斜边15 )在工具10的一个臂18(图IB中的上臂)的刀头12的平行方向上相互保持固定的距离。 另一个臂22包括具有半圆切口 20的扩展部分。所述切口 21定义为具有一种适于所述刀片14/16之间的宽度的、基本上弯曲的凹面钝边缘。所述臂14/16被枢转地连接(参考数字24)在近侧末端(图1B)。在通常的开放位置(图1B)，所述钝边缘21远离所述刀口。所述手臂18/22可以通过弹簧沈(例如，图1C)或者其它偏移装置通常地相隔支撑。当所述工具臂18/22开放时，在准备取样过程中，一种紧绷牵引的须刷38可以通过切口 21 (图1A、1C和1D)定位。技术人员将所述工具臂18/22拧在一起且所述双刀口 14/16将切过须刷38。所述切口 21某种程度上作为切割段。其钝边缘21是当刀口 14/16 切过所述须时候的须捆束所抵靠的表面。如图IA中所示，刀口 14/16将完全切过须刷38，因为它们可以移至和绕过切口 21 对面。一旦完成切割动作，技术人员释放工具10的臂18/22回到正常的开放位置。这将使须刷38的剩余部分完好地保留在植物上以继续生长(图1F)。这个刀口可以是通过紧固件或者夹紧作用可拆卸地装在工具10的头部12。对所述须使用大约90度倾斜的单个的锐利斜刀口边缘15是为了产生通过所述须的干净的切割，与倾斜切割或者撕裂或者压缩所述须相对。通过平行的、空间上相隔的刀口 14/16从须刷38上切下的须的短链段或者切屑40 将被技术人员收集或者在工具10中捕获。在这些工具10的实施方案中，管形瓶30可以连接到工具10的头部12的侧面，工具10可以翻过来并用液体喷洗(例如，乙醇)以漂洗掉进入管形瓶30的须，造成捕获在头部12中的链段或切屑40由于重力和/或工具10的操作而掉进管形瓶30(图1D)。管形瓶30可以具有一个外部螺纹开口端，可啮合地拧入并从臂18的头部12侧面的互补内部螺纹孔观中拧出。孔观将与刀口 14和16之间的空间连通。基本上所述切屑40可以通过将切口 21移向刀口 14/16背面而推到或以其他方式移到刀口 14和16背面。当管形瓶30装配在头部12上，工具10用管形瓶30指向下面转动时， 所述切屑将相对于所述斜刃口 15移入头部12的腔室并从开孔观移出并进入管形瓶30。 可以使用其它的连接方法和其它容器。如图IA-F所示，所述样品切屑40是从须刷或者捆束38末端附近的同一地方切下的相近长度的须部分。这使须刷38基部完好地保留在玉米穗36上，在其上它可以继续生长和可以被授粉。因此在它不显著地影响所述植物的耐久性或生命力或者在植物加工中所述须的功能的意义上，所述取样是对穗和植物无损伤的。条形码或者其它标签可以位于管形瓶上(例如20毫升体积容量)来表示植物标识对样品(切屑40)的关系。因此可以理解，所述工具可以从植物的一个或多个须刷38上分离相对均勻的短链段或切屑40 (例如约1. 5mm到2mm长，宽度在刀口 14和16之间)而不显著地影响植物的持续生命力。在这些实施例中锐利的单个斜刀片14/16间隔约2mm相隔，所述工具剪的作用是获得干净的切割链段、部分或切屑40。它避免粉碎或者撕裂所述须。因此，工具10 促进了回收植物须刷38每个须的基本上相等尺寸链段40。在这些实施例中，样品取自穗36外壳顶端上大于3cm处以保留将被自然授粉的须刷38。随着时间从每个穗花向顶地(穗的基部到顶部)形成玉米须。估计总须数以允许形成足够的临时须是重要的。其它方法和工具可用于获得全部几乎相同长度的切屑40样品。割刀10使一步获得相对短但均勻的切屑的相对准确和快速的方法的实例更易实现。b)管形瓶
正如讨论的，植物须的样品链段40可以收集在管形瓶30或其它容器(例如液体闪烁管形瓶，高密度聚乙烯，带螺帽，Wheaton Science Products of Millville，新泽西美国) 中，其包括一种可机读的标签34(例如用美国伊利诺州kbra Technologies of Vernon Hills的105SI印刷机制作的ΓΧ1. 25〃白色热转印标签)。 在这些实施方案中，管形瓶30包括一种可除去的盖子32来密封管形瓶30 (图2)。 而且，一旦样品链段40处于管形瓶30中，在这些实施例中所述管形瓶30至少部分地用流体46装满(例如乙醇)以保藏样品(如果需要保藏数月)，并且盖子32紧闭。流体46可以是从美国宾夕法尼亚VWR International of West Chester可购得的脱水的，变性的(SDA 式3A)试剂级乙醇。乙醇是用来保藏具有少量降解至不降解的样品。可以使用其它的保藏液体。这允许样品40基本上是包装好的并紧闭地输送到计数设备，即使该设备远离所述植物。技术人员可以着手获得下一个样品40，并且将它包装进其专用的管形瓶30等等。分离和/或储藏样品的其它容器或者方法，带有或没有液体，是可用的。c)培养皿
在后面将描述的计数或者成像设备50中，所述管形瓶30的内容物可以腾空到培养皿42中(图3A)。应当小心地从管形瓶30中抽空所有须切屑40。选择培养皿42的大小以便所述乙醇46在培养皿42 (例如来自VWR hternational的结晶皿(IOOmmX 50mm))中呈现不多于一个相对薄层(例如约1/4"和25 ml)。更大体积的流体46可以用来试图获得更伸展的切屑40，但是通常最小量的流体46被用来在粗糙的平面上展开切屑40。避免重叠或者接触须是困难或不可能的。已经为图像分析系统70的图像分析软件80编写了专门的计算机脚本，下面将讨论，来估计在重叠或者接触组中的须数目。可以摇动培养皿42来促进样品链段40在培养皿42的底表面上尽可能均勻地分布在薄乙醇层中。此外，可以人工除去碎屑(例如外壳片段、花药片和昆虫)。如图;3B和C所示，一个适当地制备的培养皿42将使链段或切屑40相当好地跨过一般平面上而分布。如图:3B和3C所示，沉降和分布切屑40将以其本身存在，这样它们的长度一般是与所述培养皿42底部的平面平行。用于支撑样品的其它容器或者载体，带有或没有液体，在成像过程中是可用的。d)成像设备
培养皿42 (或类似容器)沿着成像设备50中的照相机M的光轴55并通常与其正交放置(图4)。这可以通过在支架52上标记、或者通过一种培养皿42适合进入的接受器或者模具来完成，以确保每个培养皿42在相对于照相机M或者其视野的相同位置成像。成像设备50 (例如，得自美国密歇根州，Ann Arbor, Biolmage的成像设备Visage 110)基本上是一个暗室或者盒子56。所述内隔墙(图4)可以用深色油漆或覆盖以阻止反射。照相机M悬挂在支架52上以便使整个培养皿42在照相机视野内。当位于支架52上时，照相机讨将基本上聚焦在培养皿42底面的平面上。光箱或者分散照明源60(例如，台式白光透照器，VWR的产品目录号为。 21475-460)可以侧向(约15cm)地安装或者放置在支架52的一侧。光箱60是配置来产生 (a)足够的光来获得介于图像中切屑40和背景之间的足够的对比度，但是(b)从其窗口 62 侧向地跨过支架52完全散射光来阻止反射或者发出强光，也同样优化对比度。所述光可以是稳态的或选通的。应当采用使强光和其它对图像透明度和对比度有干扰的光影响最小化的方法。这种方法在成像和照相领域是常规的和公知的。当获取图像时，暗的盖子或者门(未显示)可以是位于或者移过盒子56的正面开口来消除或者降低环境光。本领域技术人员可以理解，所述精确的成像设备50，及其元件，可以根据需要和需求改变。在该具体示例性实施方案中，照相机M是数码照相机，特别地是CCD成像仪。一个
Evolution MP Color 5.1 Megapixel Mffil/l (Media Cybernetics ^W], East-ffest Hwy, Suite 400, Bethesda, MD USA)具有 E25mm 1:2. 5 (179611)系列尼康镜片，NAC 适配器和Tiffen Cir偏振器(52mm)。另一个实例是Quantix 6303E CCD黑白(12位灰度)数码照相机(得自美国亚利桑那州土桑市的Wiotometrics)具有尼康AF尼科手动对焦的定焦镜片。获得可以用图像分析软件分析的图像的其它设备是可行的。一个实例是数码扫描仪。获取每个培养皿42的三个重复图像来提高准确性(所述三个计数可以取平均值或者被另外以统计学方式利用)。所得数目可以输出到软件软件应用(例如Microsoft Excel)中作进一步分析。
可以采用提高目标样品与背景(或者非相关材料)之间对比度的其它方法或另外的方法。例如，一种选择将是选择具有一种引起切屑40 (自然的或者附着于所述切屑染料的)荧光的波长的照明源而进行的切割40来增加对比度。另一种选择将是，如果是植物或者动物材料，通过某些光能照射的荧光作用来添加适于标识切屑40中基因存在的着色剂 (差别着色)。特别对植物须而言的另一种选择是对花粉或者授粉管使用特定的染料，这样所述图像可以标识出有多少受精作用在成像时发生。当然，其它方法和元件是可行的。如果在管形瓶30 (或者另一个起始容器或者载体)中，光对比度和切屑40的分布足以使图像在足够数目的切屑40和背景之间区分开，则从图2中的管形瓶30转移到图3A 中的培养皿42 (或者在其它容器或者载体间转移)可以不是必需的。e)计算机化系统
计算机(例如PC 72)包括图像识别或者分析软件80(例如可以从Media Cybernetics公司购得的Image Pro Plus 6. 2软件)。所述软件可以是特别适用于数码图像中对于对象的几何学测量。所述软件允许使用者通过专用的脚本来自定义编程。所述软件也允许各种方式存入并处理其产生的分析信息。所述软件兼容许多(如果不是绝大部分) 最近型号的PC型计算机。在这些实施例中，PC 72可以连接(用一个合适的接口 74 )到成像设备50的照相机讨上(参见图幻以基于PC 72的指令来操作照相机M。PC 72此外可以连接(通过合适的接口 78) —种条形码读取器76 (用相关的软件)以从管形瓶30 (或培养皿)上读取条形码信息并将其关联到相同样品的图像。在这些实施例中，计算机72也包括电子制表程序82(例如Microsoft Excel)，以允许数据和图像的显示和存储。有关Image Pro图像分析软件80的详细信息可以参见www, mediacy. com。在玉米须的切屑40用图1 一 3的工具10获得的情况下，软件80将被编程以标识出图像中表示尺寸为约2mm长的须链段的对象。软件80可以被编程以在分析之前除去图像的不相关部分。例如，照相机M的视野可以设置得足够大以捕获培养皿42平面图的每一部分 (例如图3B和C)(这样不可能有切屑40被遗漏)。然而，这将很可能把培养皿42外面的区域带到所述图像内。软件80的一个工具可以用来不让进行对培养皿42图像四周外面的任何事物的分析。软件80被编程以按照下面步骤计数玉米须切屑40 实现分析的方法包括1)自动地标识所述培养皿和设定一种关注的排除了培养皿的边和外面区域的研究区域，幻应用滤光镜来提高所述须与背景的对比度，3)标识图像中的对象并以像素测定它们的面积，4 )分类的所述对象直到16 “位(bin)”或者基于相对于单个须估计面积的面积进行分类(这样允许对接触或重叠须的团中须的数目作一个评估)，5)每个“位”上的对象的数目乘以与每一“位”相关的须数目得到每一位的须的总数目。每一位的须的总数目被总计以得到所有位的须的总数目，从而得到培养皿中整个样品的须的总数目。该方法相对于所述图像本身作出分析，因此是自校准的，这样在图像的尺寸的改变或培养皿位置方面的改变是不相关的。图7是图像分析系统70的示例性计算机屏幕显示器图形用户界面。它举例说明了所述须切屑的计数方法。显示器的左上方是在培养皿42捕获的切屑40的图像。注意有许多切屑从所有其它切屑中分离出来，但有相当大数目是接触或者重叠的。显示器的右下角，对该实施方案而言，是16位或种类(标注“种类”的左手竖栏)。每个位或者种类由一定范围的总面积来定义。在该实施例中，总面积是图7的左上方的图像中的邻接对象所占据的像素数目。在图7的实施例中，383个在种类1的像素的面积范围内匹配的对象通过软件 80标识(参见标注〃对象〃的竖栏)。那些对象每一个的平均面积是356. 78067像素(参见标注“平均面积”的竖栏)。相对比地，42个对象在表示种类2面积的大片面积内被标识。 所述平均面积是720. 71429像素(约两倍于种类1的平均面积)。十二个对象种类在面积种类3内被标识(平均面积1084. 6666像素，约三倍于种类1的平均面积)。四个对象在种类4和5中的每一个内被标识(分别具有约四倍和五倍于种类1的平均面积)。没有对象在种类6和7内被标识，但有一个在种类8内被标识；其面积约8倍于种类1的面积。图7的右上方显示了如何计算最终的须数目。在种类1中的对象被假设为单个须切屑。因此，383个须切屑被接受并放在图7右上方的表格的竖栏“F”中。标识的对象具有约两倍于种类1的平均面积(换句话说，无论是以某些方式接触或重叠，种类2的对象被假设为两个须切屑)。因此，标识在种类2中的42个对象乘以二， 以从种类2中得到一种估计的84个总的须切屑。这种关系延续至剩余的种类。种类3的对象，约三倍于种类1的平均面积，对于种类3而言是乘以三来得到一种估计的36个单独的切屑。对于种类4和5而言，种类4标识的对象是乘以四，种类5的对象是乘以五来分别得到16个和20个总的估计的须切屑。最后，在种类8中标识的一个对象是乘以8 (假设约8个单个切屑组成了在种类8的图像中标识的切屑团或者簇)这样使得8个单个切屑被估计为种类8。在图7右上方“F”栏中的每个估计的单个切屑加在一起得到估计的“须的总数”，在该实施例中是M7。如上所述，该方法允许程序员预设计出用于识别图像中哪些通常称为对象的标准。这些对象可以由单个切屑40或者多个的切屑40 (相邻的、邻接的、重叠的、在团中或者在簇中)组成。不必对单个切屑40做起始测定或分离。而且，程序员可以利用过滤范围来避免计数图像中的非须对象，例如培养皿中的光反射或者叶子碎片。基于每个对象的总面积(在该实施例中基于由对象基本上占据的像素数目)将对象分类或归位入位或种类中，然后通过将单个切屑40的平均面积与每个识别对象的面积比较而给出有多少切屑40组成一个对象的估计。如果所述面积在表示第一种类或者1位的的面积范围内，其被认为是单个切屑40。由与适应于种类1内的面积所标识出的对象的数目，将会是那些种类计数得到的切屑的相同数目。如图7所示，落入位或种类2总面积内的识别的对象基于所计算出的面积将被认为多于一个切屑但少于三个。换句话说，种类2中的假定对象是两个单个的切屑40。在种类2中识别的对象数目将乘以二得到种类2计数的单个须的总数目。该方法对于种类3和上级以类似的方式继续。对一个种类识别的对象将乘以种类数目以得到该种类中每个对象的须的总数目。这在图6中以高度简化的形式表示。软件80将标识图6中标有“1”、“2”、“3”、 “4”和“5”的对象。这可以基于对象1 一 5相对于背景的对比度。它也将识别图6中标有 “叶子碎片”和“未知物”的项目，但是忽略它们因为它们将不会符合预编程的其的可能标准 (例如大小、形状、尺寸或者颜色)和单个切屑40或切屑40的团或簇。软件80将自动计数符合其测试的对象(在编程可接受的范围内)并忽略其它(例如“未知物”或“叶子碎片”)。因此，通过软件30标识为须样品片40的数目是自动获得的。图6包括五个标识对象(1-5)，但是七个估计的单个须切屑(1-7)。对象1、2和4 是具有总像素面积在6 - 10像素范围内的单个须切屑，且一种像素范围在至少三个像素的至少一个轴上。另一方面，对象3和5分别具有16和18的像素面积，远大于和约两倍于对象1 一 3的面积。因为对象3和5的每个都符合组成须切屑的标准，由于它们的较大的总面积，对象3和5将被计数并在高于对象1一 3的种类中分类。基于编程，因为它们约两倍于对象1、3和5的像素面积，它们将在种类2中分类。当计算总须切屑时，对象3和5将各自被认为是由两个单个的须切屑组成，因此图6中所有对象1 一 5的总须切屑将总计为七而不是五。注意所述数目是为了包括那些彼此重叠的均勻须片。即使所述切屑3和5的面积将很可能是不精确地两倍于对象1、2和4的面积，它们将在这样一种面积范围内其被认为表示了无论接触、重叠或以其它方式在图像中标识为单个对象的两个切屑。也值得注意的是，如图6所示，有一些单个切屑对象的面积范围。因此，可以利用种类1对象的像素面积范围，所有种类的情况也是如此。取决于应用程序，可以更实际和/或准确地使用大于简单的宽度和/或长度来用图像识别从须对象中分离出非须物。例如颜色、圆度和对象周边的粗糙度这样的标准可用于精细调整分辨力。可以理解，所述图像可以以彩色、黑白和假色获取，或者用对光的特定波长敏感的传感器捕获。也可以用不依赖于可见波长的感应设备来执行成像以建立图像(例如三维激光，声纳或者雷达扫描器)。软件80可以被编程以在计算机72上显示照相机的图像和/或软件80的图像分析报告(参见图7的实施例)。可以理解的是，软件80可以编程为具有多种功能。如图7 所示，所述Image Pro Plus软件可以有相当复杂的功能。如前所述，一种是使软件80将不同的识别测量的尺寸或形状放入不同的种类种(图7中最多十六种)。所述16类表示递增的大面积的对象，从而很可能表示递增数目的须的团。非须对象在计数须对象之前通过过滤器除去。颜色编码能使操作员验证所述位确实事实上代表着须的正确数目(例如，操作员可以容易地通过肉眼区别两个须和三个须的团、并可以核实所述归位方法可靠地给那些团适当地标记了颜色)。所述种类在PC 72的显示器上可以是彩色代码的(例如，不同的颜色可以与图7右下表中的左栏每一行(或类)用图7的图像中所述切屑的颜色相关联在一起)。最佳地，使用者可以复查所显示的图像(和/或培养皿42中的实际样品)，并且确定图像中的某些对象是否应当计数，以增加准确性和灵活性。使用者还可以在后处理过程中对数目或其它数据做其它改变或调整。例如，使用者可以查看图像并删除图像中的与对象识别或计数之前明显不相关的对象。在图7中所述程序的右下版面标识了对象的数目单个(383)、双倍(两个须重叠)(42)、三倍(3个须重叠)(12)等等，将这些转移到Excel中(右上版面)，其中种类数目乘以位于每个种类中的对象数目，然后总计以给出样品的总须数(参见 383+84+36+16+20=547)。可以理解，所述成像软件有很高的灵活性并可以由用户编程以允许对上述的内容做需要的改变。所述软件可以根据需要或者需求、和/或经验测试来编程和调节以达到可接受的计数准确性。
可以进一步理解的是，一些成像的准备工作可以由用户人工完成。例如，用户可以目测检查培养皿42并人工除去任何碎屑或者非须材料。另外地或可选地，杂质对象可以在捕获图像后从图像中删除。用户还可以摇动、搅拌或者搅动培养皿42以促进须切屑40 的分离和分布。2.操作
示例性实施方案一的示例性操作流程阐述如下 表4. 1须计数流程的概述 1、计划和标签
当所述农作物是齐膝高时，识别出在一排的植物良好接界部分中的十个连续植物。 使用一个测量标准以确保所述植物落入规定长度的行中。在测量面积内标注第一和最后的植物，来表示植物用于后面的鉴别。·随后记录对用于稍后取样75 - 100个生长程度单元("GUD")的所有测定点和计划测定点而言的50%的须的日期(3 — 5天)。GUD在植物科学中是公知的描述时间根据温度累计的参数。·预先为每个作为样品的植物准备管形瓶标签。2.需要用于试验的设备 图IA-E的切割工具10。·标有10毫升的闪烁管形瓶30 (图2)的具有螺帽的托盘，和设定用以支撑管形瓶用作五个测定点的瓶囊带(bando 1 i er )。 挡板，和IL乙醇瓶以及手工泵。3.试验方法
在进入测定点之前用贴有标签的管形瓶30以采样顺序加载瓶囊带。·从在测定点的第一标注植物开始。肉眼观察须刷。如果须数<50，手工计数，在管形瓶的标签上记录须数、并捕获非物理的须样品。这可以比试图用非常少的须收集须样品更快速和更准确。·如果须数>50，将管形瓶30连接到切割工具10上，利用管形瓶30向上支撑，找出所述须使在外壳顶端上方1-1. 5cm露出干净部分的须，当将须刷38握在另一只手中时， 将切割工具10放在露出的须上。当用一只手轻微拉伸所述须时，挤压切割工具10的手柄直到切割完所有的须片。不能完全关闭所述切割工具10。(参见图1A-E)。·去除须刷38的末梢尖锐部分。在该方法期间管形瓶开口应当保持面向上以防止样品的偶然损失。通过挤压完全关闭的切割工具10的手柄18/22而从切割装置10中清除须片40。通过在管形瓶30上的孔33 (图1B)反复地注射乙醇，并且用10毫升70%的乙醇通入管形瓶30中清洗样品40。·拧开管形瓶30，(用盖子32)盖紧，并摇动以分散所切割的须40的团。·移到所述行的下一个植物并重复。·当在瓶囊带中的所有样品管形瓶30已经加满时，转移管形瓶30至闪烁管形瓶储存托盘(未显示)并用下一套管形瓶30重新装载瓶囊带。·在每天结束时，清洁切割工具10，检查管形瓶30包含它们体积的至少1/3的乙醇，拧紧管形瓶盖32，并储藏封好的管形瓶30/32在一个冷的室内区域直到计数。
4.需要的实验室设备
装配在胶合板底盘或者油漆成黑色或者深蓝色的支架52上方的定焦CCD摄像机 54，并且支撑一种直径7cm、侧高14 mm的玻璃培养皿42 ；利用须分散布料覆盖的透照器侧光源60。所有都是装在烟通风橱56中。· PC 72装有Excel 82, ImagePro 80、定制设计的软件脚本；条码扫描仪76。·精细前缘的镊子和乙醇洗瓶。5.计数须的步骤
将须样品40腾空到培养皿42中并用10毫升乙醇清洗管形瓶30。·扫描样品管形瓶30上的条型码，并保留管形瓶30以洗涤、去除标签和再利用。·用镊子从样品40中除去任何非须对象(例如外壳梢、花药、昆虫)，搅拌以粉碎团，并将培养皿42放在底盘52上照相机M的下面。让样品40沉降5秒钟。·在PC 72上启动定制设计软件脚本来成像样品40，将所述图像储存在PC 72的硬盘驱动器上，自动归位重叠的须片，并将位信息储存在Excel 82中。·在PC 72屏幕上检查图像的清晰度和合适度。如有必要则重复图像捕获步骤。·移除培养皿42并用乙醇小心地清洗。·用一个新样品重复上述步骤。·在测量时段结束时用适当Excel的宏命令将样品编码和须数目转移到主文档。可以看出，实施方案一允许须切屑样品40从生长植物获得并使之被带到集中的计数设备。每个样品40与其来自的植物相关联。这些关联可以在计数设备上快速输入计算机72，例如通过样品容器30上的可机读标签34的快速读取。操作员可以准备和放置一个样品40在成像室50中，获取图像，让软件80自动标识和计数切屑数目，这样产生一种植物的须数目，其将自动储存在与其来自的植物相关的数据表或者数据库中(和/或相关的信息比如近交种或者杂交种类型、实验测定点的位置等等)。这种玉米须的规程/协议已经表明可以节约时间(估计是近似十倍的改进，例如从每天50 - 60个穗或样品到500 — 600个)。可以从生长植物上获得无限数目的样品并带到成像位置。操作员可以尽快地连续成像样品。所述计数步骤可以就立即发生或者延迟进行。例如，可以首先获得10000个样品的图像。随后，图像分析这10000个图像，来获得每个图像的须数目，可以发生在批处理模式的一个单独位置而不需要操作人员。已经表明计数的准确性是在一个可接受的范围内。操作员检查和后处理可以提高准确性水平。能够从每穗平均700个须的须数中检测出10%的不同的初步目标已经得到证实。准确性被显示为至少和手工计数一样好。可接受的准确性可以是，例如，在每个样品平均700个须的有效计数的10%以内。 利用实施方案一，已经获得了如下顺序的结果。总测量体系误差为0. 33%(4%左右认为可接受的)，测量可重复性和操作员可再现性误差分别为0. 23%和0. 10%。这可以通过三次重复图像分析的平均计数来提高。图15表示(对于n=324的样品)利用实施方案一得到的数目与手工计数之间良好的关系(线性回归系数R2=O. 99)。在25-700个须范围内，重复须计数的相对标准偏差(RSD)平均为2%，手工计数的实际偏差平均为3%。具有可接受的准确性的情况下相对于手工计数的速度显示为大约10倍快。因而，可以实现比较高水平的样品处理能力。可以理解，外加的自动化是可行的。通过机器人、传送带或其它可编程的传动器， 可以完成腾空容纳样品的容器(无论管形瓶、培养皿或其它)来制备用于成像的样品。这种类型的元件是可以市购的和为了这种目的可定制的。有大量可市购的成像设备和图像分析系统存在。某些甚至可以随时使用而几乎不用改变或不用改变。它们允许有效地捕获许多样品的数码图像。所述图像可以被显示、存档和评价，可以以多种格式建立(例如bmp、Zvi、jpg)。所述软件标识了图像中那些符合预编程测量值或者特性的对象，并且计数所有这类对象。所述系统对图像中的对象作出定量测量，并储存所述数目和将数目和样品识别相关联的信息。所述软件允许交互式测量工具和参数(例如比例、长度、外形、角度、圆周、事件计数)。所述关联的数目和样品识别可以处于一个数据库中以进一步使用(例如使用得自样品的须数目来估计穗或者植物的总产量)。校准之后，所述系统可以自动获取多个样品(或者重复的样品)的序列图像，以可搜索的格式存档图像，并且对下一组样品重复操作。所述系统可以评价、测量、计数和储存所述结果。所述系统可以编程以计算数目并从它们外推信息。所述系统包括像这样的功能 样品定位、自动对焦、在某些荧光槽中获取图像、从不同聚焦位置获取系列图像、随时间获取系列图像、自动测量(可编程的)、对产品作目录分类并存档(可搜索的)、记录和自动执行步骤。测量可以基于各种各样的参数(例如几何的和/或密度的)。测量数据易于输出至大多数数据表程序，包括Microsoft Excel。例如，ZVI格式允许所述图像数据可以与图像数、获取日期、微观设定、曝光数据、尺寸和比例数据、使用的对比技术和其它数据一起被储存进数码内存中。一个通用模板已经被开发从Imageftx) 软件获得输出到Excel中。简单结构向导允许用户建立一个需要的测量程序。描述所述试样的参数可以由用户交互地确定。那些参数可以以一个特别的顺序指导执行。高分辨率图像可以通过长度、 面积、周长、圆周、角度或其它几何的或者密度的参数而自动测量。所述软件基于所述编程的测量参数而自动计数和/或在图像上标记事件。可市购的图像评价软件可以与成像设备50和计算机72 —起使用在图像中产生那些匹配与须切屑一致的标准的可辨别对象的数目。可以通过所述软件编程这种标准。所述软件可以指导自动产生所述数目。一些软件允许用户覆盖或者改变所述数目。这可以发生，例如，如果用户在计算机72显示器上显示图像并看到所述软件已经预先计数或者没能计数一个图像对象。用户可以，通过肉眼检查所显示的图像，确定是否应该或不应该计数， 并改变所述软件的计数。这种图像评价软件的具体功能和方面在本领域是公知的。另一个实例将是一个可以根据一个编程协议来开和关所述照相机的软件驱动。实施例一是以对样品比较高的处理能力有效地获得玉米须的定量数目的系统和方法。可以理解所述系统和方法可以是类似地应用于其它植物或者非植物细长的丝束或片。E.特定的示例性实施方案二一流体流 1.概述
另一个自动地计数须切屑的方法在图9-12中举例说明。代替不得不在培养皿中分布所述样品，对其成像和使用图像分析软件来测定和计数图像中的符合预定试验的对象，该示例性实施方案二可以与实施方案一相同的方式获得样品(例如通过前述的切割工具 10)，但是使用不同的计数方法。具体而言，植物202的每个切屑样品40通过检测器量化，该检测器适于检测和以数字方法计数通过检测器的单个须切屑。所述样品40，数百个须切屑的集合，收集在管形瓶 30中。管形瓶30的内容物是直接灌注或抽到流动通道、导管或管207中，其引导所述屑，以单个方式，通过检测器例如光检测器。所述切屑是足以单个计数的。每个切屑的通过被光检测器记录，因此获得切屑或须链段的总数的数目。清洁所述系统然后送下一个样品40通过并计数。所述检测器可以连接到可以记录每个样品的须数目并将每个数目与其各自的样品或植物关联的计算机上。2.设备
图9和10表示实施方案二的基本设置。目标还是获得多个丝束的样品中碎片的定量数目，和以适当的效率和高处理能力方式完成。在该实施例中，与实施方案一主要的不同在于获得数目的方式。所述单个碎片通常被单置在流体流中，以经过对于流动通道中碎片消失来感应碎片存在的光检测器。如图9和10中须切屑计数的实施例所示，玉米穗的须切屑40 (长1 一 2mm)悬浮在至少200毫升或者在给定的体系中减少结块和优化单体的体积的液体溶液中。所述液体溶液的一个实例是组织学级的液体乙醇，因为它倾向于保持样品和样品的须切屑很好地分散其中。所述乙醇可以是自动地和来自本体乙醇容器206的切屑混合(参见图9和10)。 此外相信可以用其它液体，包括气体(例如空气)移动切屑40通过检测器214。只要所述切屑可以被充分分散。所述切屑，在液体悬浮液中，通过压缩泵或其它合适的泵208泵送到导管210中， 其在计数器216的位置变换到相对窄小的管212 ( < Imm例如TygOn 2075)，为了促进所述切屑移动通过管212的检测点时的分散。在图9的实施例中，样品和乙醇液体混合物被分开并处理成两个平行通道，例如进入两个相同的窄小管212A和B中，每一个带有传感器或者检测器214A和B，为了更高的处理能力。每个传感器2146A和B将与相应的数字计数器216A和B有效通信来记录每个检测器214A和B的检测结果，所述数目将被加到一起作为所有样品的数目。显然地，所述样品/液体混合物可以在仅一个通道中通过一个检测器处理。在该实施例中，所述检测器或者传感器214可以是波段型激光传感器(例如购自美国明尼苏达州明尼阿波利斯Banner Engineering的Model D12 DAB6FPQ5)。这基本上是这样一类光检测器使用具有限定的频带宽度的激光(相对于窄小的单一光束)以通过测量反射率来检测对象的通过。这类传感器是公知的并产生计数的数字输出。所述光电传感器214具有两个主要组件发射器和接受器。所述发射器包含光源， 其可以是，例如LED或者激光。所述发射器的光源是由振荡器进行脉冲调整的。所述接受器包含光电元件，例如光电晶体管或光电二极管，其检测来自发射器的光，并将接受的光强度转化成电压。所述电压被增幅和解调。所述接受器被“调节”到发射器的脉冲频率，并且忽略全部其它的环境光，其由透镜集聚。设置接受器来产生一个输出信号，其出现为超过或低于来自发射器的规定光强度。这种类型的大多数传感器允许调节会引起传感器输出来改变状态的光的多少。因此，每次须切屑(或者待计数的其它碎片)从所述发射器通过所述传感器光束，它将接收器处光束的强度减弱至低于一个阈值，并且产生一个输出信号。所述输出信号被输送到可市购的数字计数器216，其在输出信号的每次接收基础上增量。可以理解，实施方案二可以用各种不同的组件以各种不同的方式实现。例如，一个可选的传感器214是得自美国麻萨诸塞州Natick的Cognex公司的Checker牌光电传感器。 其它的也是可用的。计数须切屑40的其它传感器的实例包括，但不限于，各种单光束光电传感器，得自例如，Balluff USA, 8125 Holton Drive, Florence, KY USA(参见图 12A)，一种光学纤维光电传感器型号 FU 得自美国 Keyence 公司，50 Tice Blvd, Woodcliff Lake, NJ USA。如图9所示，在传感器214之后可以有一个过滤器来回收样品，也允许流体流到一个烧瓶或者其它容器224中以回收、或再循环和再利用。图10表示为这种系统建立的原型实验机构。如图所示，样品切屑40和由本体容器 206测得的液体的量可以是人工地进料到系统200中。泵208将在液体柱中通过窄小的模拟管部分212泵送样品/液体混合物。在每个表示一种切屑经过它的事件基础上，检测器 214将对计数器216增量。电池218可以对所述检测器充电。所述样品/液体混合物可以是被泵送入烧瓶或者其它回收容器224中。如果需要，所述切屑40在此之前可以被滤出。 通过合适地选择组分，可以相当快速地处理样品。发现对样品连续搅动可以通过降低结块和促进须分离来提高准确性。导管中的水泡或空气会造成某些差异。减少这些差异的方法是在本领域技术人员的技能范围内。可以理解，该实施方案二可以由使它便携的组件构成(例如小的和轻质量的足以使其被容纳在背包中)。所述系统可以容纳在背包中并通过电池电源充电。这将允许操作员将该系统带到试验中并在植物上或附近进行须计数。图12B和D表示传感器214如何可以通过用所述样品/液体混合物而被支撑在透明液体导管附近。例如，具有夹具的可铰接支持器可以支撑分离线210A和B和两个检测器 214A和B (图12B)。一种替换物将是如图12D中表示的丝网屏幕。这些构件是为了提供所述组件的稳定性以提高操作性和准确性。当然其它布置也是可用的，包括更持久的结构。 夹具布置和组件的稳定可以是系统的主要优化方向。图11表示了另一种可能的结构。管形瓶或容器30A可以位于来自泵208的流动路径中。样品40可以插入管形瓶30A中。样品40，悬浮在从泵208中抽出的液体中，将被泵送通过光检测器214以量化须切屑，然后被重新捕获在第二管形瓶30B中。以这种方式， 所述样品/液体混合物可以被测定但随后放回试样容器中用于维护。3.操作
这种系统200的操作可以如下。所述样品切屑可以是被收集在闪烁管形瓶中，加入乙醇，然后所述乙醇/切屑内容物被(例如漏斗207-参见图10)灌注到泵系统进口中。应当小心地从管形瓶中取出所有的切屑并放入泵208中。泵速度和夹具结构可以通过经验测试而优化。须切屑的适当分离取决于样本大小、液体体积、搅动的有效度、液体流率和传感器检测能力。这些也可以通过经验测试而优化。使用空气或者真空是将所述切屑泵送到液体中使泵的脉冲作用最小化的可能的选择。每几分钟一个样品左右(或者更小)的处理速度是可能的。这些取决于槽的数目和优化。本领域技术人员可以理解，可以进行常规经验测试来校准所述组件的操作性。
对于许多应用程序显示出可接受的准确性。图16显示了用Banner波段类型的激光传感器(型号D12DAB6FPQ5)的实施方案二的玉米须计数与实施方案一的对相同样品的计数之间的对比。图16的表1的确表明了 52%的平均误差，但很可能是由于校准问题和传感器稳定性，图16的表2显示了用屏幕栅板(图12D)或其它夹具或立柱(图12B—显示了立柱的使用，例如使用USA CA, Camarillo的Harbor Freight Tools的“辅助扩大”立柱， 例如，用于焊接应用)来稳定传感器从而降低约8%的平均误差。通过使用光传感器来通过悬浮在液体中并泵送或移动经过光检测器，来计数单个样品切屑的一般方法可以由用户调整和优化。它可以以类似的方式实施到其它植物和非植物的细长丝束或碎片。对计数的捕获和储存可以通过从数字计数器216传递数字化数目而轻易地完成，其将是呈一种计算机可以接受和使用的格式。用户可以维持每个样品的标识及其在计算机数据表或数据库中的数目。如实施例一中描述的，多个样品的数目信息可以按需使用并储存或存档。F.特定的示例性实施方案三一须刷横截面计数 1.概述
图13和14A-C举例说明了须计数的另一个方法。玉米穗的须刷338用例如3/4透明的胶带340 (图14A)捆住或拉紧并捆在合适位置上。成捆的须刷338在或接近胶带(图 14B)两端横向且利索地切割。这产生了一个英寸长左右的成捆须刷样品的稳定部分、且其相反端暴露以提供整个须刷338的横截切口。样品留在室温放置几分钟，每个暴露的须刷上的须末端往往变黑(图14B)。这提高了对比度。每个须的暴露端可以人工计数，或者可以得到图像并从图像中完成手工计数。可选地，适当编程的图像分析软件可以进行自动计数。2.设备
单个斜刀片344或其它锐利的切割设备可以使所述横向切口(见切线1和2)穿过所述两个须刷338的位置以产生暴露的须末端(图13)。每个须可以人工计数。可选地，可以获得所述横截面的图像并对图像进行肉眼、手工或自动图像分析来计数。成像器的实例是得自美国PA中心区3500 Corporate街道的邮政信箱为610的 Olympus Imaging America公司的Olympus SZX12型号的立体镜，在其装有定位取景彩色照相机，型号 3. 2.0 (7x-10x)，来自 6540 Burroughs街道，Sterling Heights,MI USA。一种替换物是WILD-Heerbrugg型号M32的立体镜(现为Leica Microsystems (瑞士 )有限公司， Max-Schmidheiny 街道 201，9435 Heerbrugg, Switzerland)，装有来自德国 Gottingen 卡尔蔡斯微成像有限公司的蔡斯镜头Axiocam MRc0可以是其它的。某些类型的染色剂或者染料可以用于所述横截面来试图增加须之间的对比度 (在图14C比较顶部和底部图像)。可见光或者非可见光可以被成像。3.操作
图13和14的方法将适用于便携试验须计数。经验是其比实施方案一和二更慢(例如每天处理50个样品左右)。G.选项和替换物
本领域技术人员可以理解可以根据实现本发明的实施方案对此处描述的技术方案进行改变。本发明不局限于此处描述的具体实施方案。对本领域技术人员而言显而易见的改变将包括在本发明内。一些实施例阐述如下。1.设备
所述精确系统和系统设定可以改变。所述精确设备和设备的组合可以根据需求或者需要改变。例如，所述实施方案一中精密照相机或者软件可以改变，其特征和设定也一样。实施方案二中精确的泵和检测器同样可以改变。设计者可以根据需要和需求选择和配置所述设备。可以理解，每个实施例都可以被制成可易于运输和可用于各种定位、设定和环境中。它们甚至可以被制成便携式的以在待计数的项目的位置来提供计数。它可以是便携式的，因为它可以是相对小的尺度(当组合作为操作系统、或作为独立部件时都是如此)，是相对轻质量的，并且可以是电池充电的(或从常规的可用电池电源充电)。例如，对于实施方案一，成像设备50可以建立在农作物场或附近。所述盒子可以看起来像一个便携式的通风橱并保护成像器免遭环境影响。所述图像可以被获取并储存在照相机中，然后用现场的便携式电脑、或邻近建筑中的台式电脑进行分析。可选地，所述图像可以是通过电子邮件或其它通信协议或网络发送到中心存储单元以用于利用图像分析软件处理。可选地，所述容器包括可以直接用于成像而不需要转移到第二容器的须。对于实施方案二，表示如上，所述泵、检测器和数字计数器可以是电池充电的。所述设定可以现场进行，包括在一个场地或者户外。实施方案三，至少当使用手工计数时，容易便携并几乎可以在任何地方操作。在基于实验室的系统和便携式的现场系统之间有一些权衡(例如图像的分辩率在实验室设定中可以更高；现场处理可以产生更快速和可接受的结果)。用户可以将这些问题分散到用于给定应用的系统和方法的设计中。2.方法
类似地，所述精确的方法步骤和次序可以具有一些改变。所述与须切屑有关的测量还可以改变。例如，可以进行须直径的测量或须直径分布的测量代替须切屑的计数。这可以通过相关实施方案一描述的图像分析软件的合适编程来从图像中取得、或者是可以进行单独测量，所述图像已经由须计数存档。当然，当计数其它植物或非植物碎片时类似的改变是可能的。3.应用
另外，计数方法可以有各种应用方面的改变。例如，此处的示例性实施方案主要涉及对活体玉米的须计数。当然它还可以应用于已经从植物上分离的穗。如果需要，所述计数设备和方法可以以类似的方式应用来计数其它小的项目。其它可以是芹菜多孔结构的计数。 也许可能在光学纤维捆束中以单个光学纤维计数这类事物。其它已经在该说明书中提到。 然而，本发明不仅仅局限于那些实施例。但是进一步地，可以理解到发明人已经发现了现有的须计数设备和方法可以延用到各种有益的应用中用于植物研究和开发。所述须计数不仅可以用作植物潜在产量的指示器，也从此已发现可以作出许多扩展。须计数可以以显著地帮助植物研究和开发的方式来应用。这些用来须计数的应用中的一些包括，但不限于，如下
a.与须数或者须宽度有关的植物之间的变化(一次或者若干次之间的对比)，b.一个穗内的须的变化，
c.产量预测(例如早期产量评估；为产量试验评估模拟进料)，
d.基因型的精确表型(例如对每个杂交种和近交种的须运用的速度和图案进行的测
定)，
e.与须特性的改变有关的基因区域的发现，
f.通过提高每棵植物产量来降低所售物品的成本，
g.使用须切屑来评估不同的转基因结构或事物。本领域技术人员可以理解，这些应用可以以许多方式有利地应用。一些实例如下
(a)在花期作出选择使在收获时更有效(即计划收获机器、劳动力、运输等等)。(b)种子产量管理(例如测定限制产量一须数目或授粉量的因素)。(c)对于须数目进行高处理能力的量化的促进工具，以更好地理解母体产量潜力、 稳定性、风险和失效。(d)通过更好地理解决定产量潜力的因素来修改育种策略。(e)将须计数应用到研究方法、育种策略和生产场管理(管理、风险评估、预定产量评估)。进一步的应用实例在如下与例如早期描述的计数方法如何可以用于玉米须的范围有关的实施例中阐述。H.另外的示例性应用
利用比较高处理能力的对于须或其它伸长的碎片或丝束的计数的能力由下列实施例表明。这些实施例涉及玉米须，但意图是举例说明须计数有时可以如何与其它测量或者参数相关联。1.须计数的测量
本领域公知在须和胚珠数之间存在很强的关系，并且该参数也是颗粒数目/穗和潜在产量的指示。现有的须计数方法适于帮助以比手工计数更高的处理能力获得须数目至可接受的统计学准确性的程度。所述计数可以是对植物无损伤的。所述方法允许有效地获取计数。一个目标是实现在手工计数的+/_2%内的计数准确性。使用先前描述的示例性实施方案一(见图15)的图像分析技术对各种各样的须数目(80-900)计数是在认为可接受的+/-2%范围内相当一致的。对于先前描述的示例性实施方案二(见图16)液体流光检测器测量器技术，结果也在它的可接受的范围内。所述计数方法甚至对低于上述目标的准确性结果可以适用的。统计学上可接受的方法或对玉米须数目进行量化的方法的开发已经应用在许多方面。某些非限制性实施例包括提供一种更有效的方式来调研不同植物之间、同一植物的穗之间、或者甚至同一穗在不同时期的变化。这已经开发了须计数以许多方式使用的潜力来试图更好地理解须和须开发、以及穗和植物开发，其可以继而导致对植物特性和开发的认识提高。a)植物之间或穗内的须变化
所述示例性实施方案中的须计数方法已经被用于建立介于不同基因型植物、相同基因型的植物、在不同生长地点不同环境条件下生长的相同或不同基因型的植物、以及用不同覆盖处理(例如须覆盖或未覆盖一段时间)的相同或不同基因型的植物(见图17)的须数目之间的变化。该变化可以以许多方式应用。例如，可以用须数目区分或识别不同的基因型。另一种将是基于在不同环境的须生产来表征一种基因型或不同基因型。另一种将是量化相同近交或杂交种的植物之间须数目的变化程度。注意图17也表示了须数目如何在长须周期内一天天的变化。如后面将讨论的，这也可以用来表征或预测一种基因型或多个基因型。所述特性可用于评价作为受环境、基因型或农业实践影响的生产产量的这类事物。所述方法也允许在不同的时期从相同的穗获取须数目来研究须伸出和生长的动力学。2.须计数的应用
a)数目
须数目已经应用在许多方法中来帮助理解玉米植物的处理。如提到的，一个主要的实施例是作为识别工具的基因型与须数目之间的关系。也如上述讨论的，须数目已经与穗或植物潜在的产量相关联。任何产量潜力的降低，正如须数目测定的，可以表示种子生产商的业务收入潜力的损失。须计数是有价值的工具，用来评价产品产量受环境、基因型或农事管理实践的影响。使用先前描述的示例性实施方案1-3的须计数方法，须计数可以以相对有效的方式利用来达到这些目的。可以更有效地研究这些事物作为母体产量潜力、稳定性、风险和损伤。例如，产量的不稳定几乎总是与目标基因型中的一系列压力敏感度互相作用的压力变化水平有关。在育种程序中选择改善的产量稳定性、或作为转基因评价计划的一部分， 可以是种子公司和种植户希望的目标。在生长季节中期当所述玉米植物在压力下，谷物产量的变化基本上是通过其变化在每棵植物的穗和每穗的颗粒(KPE)粒数的变化。开花时的压力造成须伸出的延迟，通常与作为ASI (开花期的长须间隔)的开花期的时间有关，因为 50%开花期的时间几乎不受压力影响。ASI到谷物出产与KPE的关系已被明确确立，但是所述特性是暂时的并显示出很少的关于生长须和花粉分布的总体动力学详情。这些群体必须重叠来确保授粉，并且须和花粉在受力状态下必须保持充足来确保受精作用和良好的颗粒设定。须生产的动力学特别涉及植物中以及穗内的须生长变化、须暴露的均勻性、及其与可用花粉的同步。在受力状态下稳定颗粒设定的选择需要针对特性筛选大量的基因型，所述特性在压力水平范围内对颗粒设定特性至关重要。下面是与须计数有关的各种其它应用实例的非限制性讨论。要在可变的压力水平(干旱、热、密度、低氮)下提高产量稳定性，应当改善玉米杂交种随时间和环境的性能、并帮助提高和稳定农场收入。发生在玉米开花期过程中的再生方法对压力特别敏感，因此表示用来改善产量稳定性的有预期前景的目标。在受管控的压力研究环境中初步学习的结果证实了当在开花过程中发生干旱压力时谷物产量对穗和子房生长、须形成和授粉后颗粒生长有很强的依赖性。这些研究也已经证实了这些方法的压力敏感性存在遗传的变化。下面是在开花和产生出将用作提高玉米产量稳定性模式的表现型时、用来分析压力容限的其它的精确度表型工具。预期的利益包括须生长速率和长须的穗内同步的高处理能力精确表型方法，以及早期穗生长过程中测定颗粒发育不全程度的方法。使用这些工具改善稳定性的选择是期待用来提供对于影响颗粒数且因而影响产量的一系列压力的有所改善的容限。b)预测 (I)KPE和谷物产量
正如提到的，每穗的须数目通常粗略地表现出每穗极限产量，因为每个须应当关联一个胚珠，该胚珠理想地应当产生一个颗粒，该颗粒是测定谷物产量的主要因素(与颗粒尺寸一起)。使用高处理能力的须计数方法，须数目的量化可以用许多方式应用来预测产量。 它可用于预测一个穗、一个植物、或一个基因型的产量。通过传统方法，所述产量预测可用来帮助种植户或者种子生产公司做计划。因为可以在植物寿命的相对早期获得须数目，这些信息可以在收获之前很好地应用(基本上在生长季节的中期)。
权利要求
1.一种用于获得玉米植物的须刷的单一须样品的装置包含a.第一个臂，其携载有两个间隔开的刀片以限定单一须的相对短的长度；b.第二个臂，包含钝边缘；c.介于第一个臂和第二个臂之间的连接，适合于允许所述刀片和所述钝边缘朝彼此相互平移；以及d.允许所述刀片切割须刷以及从须刷的须中切掉所述短碎片。
2.如权利要求1所述的装置进一步包含装置上的支架，该支架适合于允许将容器支撑到装置上以捕获从须刷上切割之后的须的短长度。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述刀片包含具有单个斜角的边缘。
4.如权利要求1所述的装置，其中由须刷的须得到的短碎片包含须刷的横截面。
5.如权利要求1所述的装置，其中在剪切机中所述钝边缘移过刀片以进行经过须刷的切割。
6.如权利要求1所述的装置，其中所述两个间隔开的刀片在一副刀头之间平行连接。
7.如权利要求1所述的装置，其中所述钝边缘进一步包含一种弯曲的凹面钝边缘，所述弯曲的凹面钝边缘具有的宽度为适配于所述两个间隔开的刀片之间。
8.如权利要求7所述的装置，其中所述弯曲的凹面钝边缘包含一种受限于所述钝边缘的深度，所述深度足够容纳须刷。
9.一种获得对相对小的伸长的碎片或丝束的定量计数的系统，包含a.工具，适合于从所述碎片或丝束上获得相对均勻的样品；以及b.自动计数器，定量地计数样品和记录计数。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述工具包含一种具有两个并排的间隔开的刀片， 其中两个并排的刀片横向移过伸长的碎片或丝束以制备样品。
11.如权利要求10所述的系统，其中所述工具进一步包含钝边缘，所述钝边缘相对于由两个并排刀片进行切割的方向被设置在所述伸长的碎片或丝束的相对侧上。
12.如权利要求9所述的系统，其中所述自动计数器包含图像评价系统或光学检测器。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述图像评价系统包含一种用于采集样品的数字图像的工具。
14.如权利要求12所述的系统，其中所述光检测器包含一个光电检测器、激光器或颗粒计数器。
15.如权利要求9所述的系统，其中所述碎片或丝束包含植物根、植物须、植物分蘖、植物纤维、光纤、毛发、纱线、纤维、长丝、绞纱、丝线、腱、细绳，昆虫或昆虫部件，或昆虫卵。
16.如权利要求9所述的系统，其中用于田地用途的工具和自动计数器是便携式的。
17.一种用于玉米植物的须刷的单独须的相对高生产量计数的系统，包括a.工具，其包括间隔开的刀片以及一种钝边缘，所述间隔开的刀片限定单独须的相对短的长度，所述钝边缘适合于在剪切机中以间隔开的刀片经过、来从须刷的须中获得相对均勻的短碎片；以及b.自动计数器，其具有须识别软件以评测和计数目标物，来表示用于从对识别出的目标物进行的计数中估计出总的须计数的须的切割短长度。
18.如权利要求17所述的系统，其中所述自动计数器包含a.一种具有图像采集软件的图像采集系统，用于采集和分析须的数字图像以及对表示出须的切割短长度的实物进行计数；或b.一种光学检测器，其经编制以计数表示着须的切割短长度的目标物。
19.如权利要求17所述的系统，其具有数据储存以储存与每个样品相关的计数。
20.如权利要求17所述的系统，其进一步包含一种用以分析每个样品计数的操作指令以a.预测植物的变种、表现型或基因型；b.预测植物的生长条件；c.为来自植物的种子选择生长条件；d.选择植物的另外用途以进行研究；e.选择植物的另外用途以进行商品化生产；f.评估不同的转基因结构或事物。
全文摘要
公开了用于比较高处理能力地计数包括植物丝的细长丝束的设备和体系。一个设备或体系包括使用适于获得均匀样品的工具和系统自动定量地计数碎片从一节植物丝状刷子中分离相近尺寸的须片。所述自动化系统可以是穿过表面或在表面上的碎片分布的数字图片，进行图像分析得出单独的碎片的数目。另一种自动化系统将碎片顺序地移动并基本上单独通过一个检测器。
文档编号G01N1/04GK102197295SQ200980142059
公开日2011年9月21日 申请日期2009年8月21日 优先权日2008年8月22日
发明者D·M·戈德曼, J·R·舒斯勒, N·J·豪斯曼, R·L·费林顿, S·R·安德森, T·A·汉塞尔曼 申请人:先锋国际良种公司