专利名称：一种α-酮异己酸含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种α “酮异己酸含量的检测方法，尤其是一种利用高效液相色谱的 检测方法，属于分析技术领域。
背景技术：
α-酮异己酸(KIC)，又称α-氧代异戊酸，是支链氨基酸一亮氨酸的中间代谢产 物，是一类在生物体内拥有重要作用的支链α “酮酸，是重要的有机合成、药物合成及生物 合成中间体，在医药、食品、饲料等行业有着重要的应用前景。KIC能够抑制胰高血糖素的分 泌，促进胰岛素的分泌，具有促进肌肉蛋白合成，防止肌肉分解的双重作用。KIC与骨骼肌的 合成代谢有密切的关系，它可以减少肌肉组织的分解，加速肌肉的合成，可以为骨骼肌在训 练和比赛时直接提供能量，减缓运动对肌肉的损伤程度，是一种重要的运动营养成份和营 养增补剂。α -酮异己酸是两个羧基直接相邻的酮酸，含有氨基酸的碳结构骨架，因其反应 中心多而显出其重要和特殊的化学性质，在很多有机合成及生物代谢过程中起着承上启下 的中间体的作用，所以近年来KIC的合成已成为热点。目前检测酮酸含量的方法主要有酶偶联法、分光光度法和高效液相色谱法。酶偶 联法的成本较高，而且一个样品只能测定一种成分，造成时间和样品的消耗比较多。分光光 度法操作繁琐，样品处理中损失较多，且检出限较高，重复性差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种α -酮异己酸含量的检测方法，利用高效 色谱精确，稳定的检测α-酮异己酸含量。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为将经过将溶液经离心、过滤等一系列操作，滤除固体杂质，直至滤液澄清处理的样 品注入流动相带入所述色谱柱中，流动相为磷酸氢二铵和甲醇的混合溶液，固定相为，样 品分离后经紫外检测器进行检测；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰 面积进行定量分析。所述色谱柱为粒径5 μ m的ZORBAX SB-Aq色谱柱。所述流动相磷酸氢二铵和甲醇混合溶液为0. 01mol/L的，有机相的比例设定为 10% 20%，无机相的比例设定为80% 90%。所述的流动相流速为0. 5 1. OmL/min,所述流动相流最佳流速为0. 8mL/min。所述色谱柱柱温为30 40°C，最佳柱温为35°C。紫外检测器所用检测波长为200 210nm，最佳检测波长为203nm。主要分析步骤如下1、样品预处理取一定量的储备溶液，适度稀释后转移到50mL离心管中，lOOOOr/min离心lOmin， 然后再用0. 22um滤膜过滤后备用。
2、色谱条件(1)色谱柱Z0RBAX SB-Aq 柱；(2)检测器紫外检测器；(3)检测波长200 2IOnm ；(4)流动相采用0. 01mol/L的磷酸氢二铵(pH2. 50)-甲醇缓冲液作为流动相，有 机相的比例设定为10 % 20 %，无机流动相的比例设定为80 % 90 %，平衡色谱柱使基线 平稳，该条件下保留时间适合，峰形对称，分离度好；(5)流速:0· 5 1. OmL/min ；(6)柱温30 40°C ；3、浓度计算方法用α -酮异己酸标准品配制成一定梯度浓度的标准液，20uL体积进样，按外标法， 以峰面积和进样浓度作线性回归，得到线性回归方程，利用该方程和样品中α-酮异己酸 的峰面积计算样品号中的α-酮异己酸含量。本发明提供的检测方法通过线性试验证明，在一定浓度下，α-酮异己酸回归 方程的相关系数为0. 999，线性关系良好，易于准确定量，精密度实验测得相对偏差仅为 0. 19%。应用本发明优化的各项参数可快速精确检测α-酮异己酸含量，稳定性高，重现性 好，可实现自动化，适于生产过程中对α-酮异己酸的质量控制。
图1为α _酮异己酸标准品的高效液相色谱图。图2为α-酮异己酸的标准曲线图。
具体实施例方式仪器与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪(HPLC)，配备G1322A型脱气仪，G1311A型四元 泵，A1329A型自动进样器，G1316A型柱温箱，G1315D型DAD检测器；ZORBAX SB-Aq色谱柱 (4. 6 X 250mm, 5 μ m) CR22G II高速冷冻离心机；AL204电子天平；FE20型梅特勒-托利多酸 度计；日本岛津UV-2450型紫外可见分光光度计；Pure X制水机。α -酮异己酸；甲醇，色谱纯，J&K CHEMICAL LTD. ；L-亮氨酸，无锡晶海氨基酸有 限公司；磷酸氢二铵，BIO BASIC INC.；超纯水(18. 2 Ω )，实验室自制。实施例1 标准溶液和样品溶液的配制1.1标准溶液的配制准确称取0. 02ga-酮异己酸标准样品，置于200mL烧杯中用超纯水溶解，然后倒 入200mL容量瓶中定容至刻度。用超纯水稀释得到质量浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、 80mg/L、100mg/L的标准溶液。1.2流动相的配制准确称取1. 32g磷酸氢二铵，置于200mL烧杯中用超纯水溶解，然后倒入IOOOmL 容量瓶中定容至刻度。摇勻后再将其倒入IOOOmL烧杯中，用lmol/L磷酸溶液调节pH至 2. 70。
1.3样品的处理将溶液lOOOOr/min离心lOmin，取上清液经0. 22 μ m滤膜过滤后待用。实施例2 高效液相色谱条件的选择2. 1检测波长的确定用190 300nm对α -酮异己酸的标准溶液进行紫外全波长扫描，根据所得紫外 吸收光谱图，确定在波长范围为200 210nm，其中203nm处有最大的紫外吸收峰。2. 2流动相的选择将流动相分别配成不同梯度浓度的磷酸氢二铵溶液，考察对分离α -酮异己酸的 影响。结果表明当流动相中不含有磷酸盐时，α-酮异己酸分离效果不好；流动相中磷酸 盐的浓度越高，保留时间越长，α-酮异己酸均能得到较好的分离。由于高浓度的盐会对泵 和柱子的寿命产生影响，所以选用0. Olmol/L的磷酸氢二铵溶液作为基本流动相。在流动 相中加入不同的甲醇比例，结果表明随着流动相中甲醇比例的增大，流动相的洗脱能力不 断增强，保留时间缩短，柱压升高，单位体积流动相中所含的目标组分越高，从而响应值越 大。在保证有效分离组分的情况下，应尽可能地增大流动相中甲醇的比例。实验表明，10 20%的甲醇是最适宜的比例，组分分离度和峰形都较好。2. 3柱温的选择考察不同温度对各组分保留时间和峰高的影响，30 40°C对各组分的保留时间 和峰高均没有较大的影响，而柱温过高则会加快传质过程，缩小分离度。实验表明35°C作为 最佳检测温度。在此温度下，柱温箱的负担不大，保留时间和分离度都比较好。2. 4pH 的选择用磷酸将磷酸氢二铵调至不同pH值，测定α-酮异己酸的保留时间表明，流动相 PH值对组分的影响很大。pH值越低，α-酮异己酸的保留时间越长，峰面积越小。当pH值 大于2. 60时，α -酮异己酸不能完全和其他物质分开；当PH值为2. 40时，α -酮异己酸的 保留时间太长，而且会影响色谱柱的寿命。因此，选择PH值为2. 50的磷酸氢二铵溶液作为 流动相。2. 5流速的选择设定不同的流速梯度，结果显示随着流速的增大，α-酮异己酸的保留时间和峰高 均有不同程度的减小。流速太小，分离所用时间就会增加；流速太大，则达不到较好的分离 效果。实验表明最佳的流速为0. SmL/min。实施例3 标准曲线的建立将配制好的不同质量浓度的α -酮异己酸标准溶液，经滤膜过滤后在选定的色谱 条件下进样测定，以KIC质量浓度(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果表 明曲线线性良好。在20 100mg/L范围内，峰面积和KIC的浓度之间的相关方程为y = 19. 261x-95. 474，R2 = 0. 9995。实施例4 检出限、精密度和回收率的测定使用下列参数对α -酮异己酸进行分析和检测。流动相为pH 2.5,0. Olmol/L磷酸氢二铵和甲醇混合溶液(有机相的比例设定为 15%，无机相的比例设定为85% )，流动相流速为0. 8mL/min。色谱柱最佳柱温为35°C。
紫外检测器所用检测波长为203nm。4.1检出限的测定在进样量20 μ L的条件下，0. lmg/L的标准样品能够产生区别于基线噪声的色谱 峰，根据信噪比S/N = 3，测得每个组分最低检测质量浓度为0. 2mg/L。4. 2精密度试验将60mg/L的KIC标准溶液在选定的色谱条件下进行6次平行测定，测定结果如表 1所示。计算得到KIC含量的相对标准偏差(RSD)为0.19%，表明该方法精密度良好。表IKIC检测的精密度实验结果分析
权利要求
一种α 酮异己酸含量的检测方法，采用高效液相色谱，其特征在于将经过前处理的样品注入流动相带入所述色谱柱中，流动相为磷酸氢二铵和甲醇的混合溶液，样品分离后经紫外检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱为粒径5μ m的ZORBAX SB-Aq色谱柱。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述流动相磷酸氢二铵和甲醇混合 溶液浓度为0. Olmol/L，有机相的比例设定为10% 20 %，无机相的比例设定为80% 90%。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的流动相流速为0.5 1. OmL/min0
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于所述流动相最佳流速为0.SmL/min0
6.根据权利要求1-4任一所述的检测方法，其特征在于所述流动相的PH为2.5。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱柱温为30 40°C。
8.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱最佳柱温为35°C。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于紫外检测器所用检测波长为200 210nm。
10.根据权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于紫外检测器最佳检测波长为 203nmo
全文摘要
本发明公开了一种α-酮异己酸的检测方法，采用高效液相色谱，色谱条件为采用ZORBAX SB-Aq色谱柱，流动相为0.01mol/L的磷酸氢二铵和甲醇的混合溶液，有机相的比例设定为10％～20％，无机相的比例设定为80％～90％，流速0.5～1.0mL/min，柱温30～40℃，进样量10～30uL，检测波长为200～210nm。通过优化检测参数，提供了一种分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，适用于生产过程中α-酮异己酸产量的检测的方法。
文档编号G01N30/02GK101975827SQ20101027293
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者刘龙, 堵国成, 李江华, 祝玉红, 陈坚 申请人:江南大学