一种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法，属于发酵工程领域。本发明首先构建了一株异源表达氨基酸脱氨酶基因的基因工程菌，再以亮氨酸为底物，通过重组菌全细胞催化生产α-酮异己酸。具有生产成本低、生产条件温和、转化体系中杂质较少、工艺步骤简单、生产操作安全等优点。采用本发明生产的α-酮异己酸产量高，每升转化液含有12.69gα-酮异己酸，L-亮氨酸的转化率达到97.49%。
【专利说明】—种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种全细胞转化生产α -酮异己酸的方法，属于发酵工程【技术领域】。【背景技术】
[0002]α -酮异己酸(KIC)，又称α -氧代异戊酸，是支链氨基酸-亮氨酸的中间代谢产物，是一类生物体内有着重要作用的支链α -酮酸，是重要的有机合成、药物合成及生物合成中间体，在医药、食品、饲料等行业有着重要的应用前景。目前KIC的生产方法主要是化学合成法，主要包括二乙基草酰胺与格氏试剂加成产物的水解反应、双羰基化法、海因法等等。这些方法反应条件苛刻，都需要特殊结构作为起始物，或者价格昂贵的催化剂(如八羟基二钴与零价钯的络合物)，并且都需要经过多步反应作为起始物，较难用于生产实践和工业化大规模生产。
[0003]L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2，L_AAD)是依赖FAD为辅酶的黄素蛋白，可以催化氨基酸氧化脱氨生成相应的酮酸、过氧化氢和氨基。催化过程可以分为两步:第一步是从氨基酸脱下来的氢传递给辅酶FAD生成氨基酸的中间形式，然后立即水解生成酮酸和氨基。第二步是FAD的氢原子将O2还原成过氧化氢，通常在亚氨基酸分解前完成。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。细菌和真菌来源的游离L-氨基酸脱氨酶，由于反应过程产生过氧化氢，对细菌有毒害作用，异源表达时会产生包含体，酶活较低。而来源于P.vulgaris的氨基酸脱氨酶，表达在细胞膜上，为异源表达氨基酸脱氨酶提供了可倉泛。
[0004]本发明旨在开发一种新的KIC生产模式:全细胞蛋白转化。这种生产方法对设备要求较低，反应条件温和 ，操作简单，一步反应，易于控制。而且反应过程中，不需要加入有毒化学原料，底物和培养基对环境不会造成污染。反应对底物的专一性高，能选择性利用底物，而且产生具有立体专一性，光学专一性的产品。全细胞转化法生产的α-酮异己酸，产物纯度高，易于分离和纯化，有利于大规模的工业化应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，使得合适来源的氨基酸脱氨酶在异源宿主中高效表达，进而通过全细胞转化亮氨酸生产α-酮异己酸。
[0006]为此，本发明首先构建了一株以L-亮氨酸为底物转化生产α-酮异己酸的基因工程菌，是表达了源于奇异变形杆菌(Proteus vulgaris)的脱氨酶，编码所述脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]所述基因工程菌是以E.coli BL21 (DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
[0008]所述基因工程菌的构建方法是以P.vulgaris的基因组为模板，PCR扩增获得氨基酸脱氨酶基因，连接到表达载体pET-28a(+)中，将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)，筛选得到阳性转化子。[0009]应用所述基因工程菌全细胞转化生产α -酮异己酸的方法，是将种子培养液按2%的接种量接种到发酵培养基中，37°C培养至0D_为0.6，添加终浓度0.4mM的IPTG，37°C诱导5h，收集细胞；以0.4-2.4g/L细胞、25-150mM/L底物L-亮氨酸，在25_45°C条件下，转化
0.5-24h。
[0010]所述底物L-亮氨酸浓度优选100mM/L。所述细胞浓度优选0.8g/L。所述转化优选37°C下转化16h。
[0011]所述种子培养基(/L):蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,蒸懼水定容。
[0012]所述发酵培养基(/L):蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加水900mL溶解后高压灭菌。冷却到60°C，再加IOOmL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为IOOmL,高压灭菌)。
[0013]有益效果:本发明成功实现了 P.vulgaris中L-氨基酸脱氨酶在大肠杆菌中异源表达，并以此重组细胞一步转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸。与现有技术相比，本发明的全细胞转化L-亮氨酸制取α -酮异己酸的方法，反应条件温和，对环境污染少，而且底物选择性高，目的产物专一，反应速率快，产物得率高，而且生产周期短，只需16h，就能利用97.49%的底物。本发明技术方案缩短了生产周期，降低了 α -酮异己酸的生产成本，使大规模生产α-酮异己酸成为可能，从而解决了工业化α-酮异己酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。目前尚未有利用全细胞转化法生产α-酮异己酸的报道，此方法有利于解决化学合成法中的污染严重，步骤繁琐等问题，而且工艺简单，易于控制，方便推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1重组质粒的构建图。
[0015]图2全细胞转化优化结果图:a，底物浓度对产量的影响；b，生物催化剂浓度对产量的影响；c，温度对产量的影响；d，转化时间对产量的影响。
【具体实施方式】
[0016]材料与方法
[0017]种子培养基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自来水定容至100mL。
[0018]发酵培养基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌，冷却到60°C，再加IOOmL灭菌的含有17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
[0019]样品制备:取ImL转化后的溶液，在10，OOOrpm下离心lOmin，取上清液稀释后，经过0.45 μ m滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
[0020]α-酮异己酸的含量测定=AgilentllOO高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)采用ZORBAXSB-Aq (4.6 X 250mm, 5 μ m)色谱柱，流动相为0.01mol/L的磷酸氢二铵溶液(pH2.50)-甲醇溶液(90:10，v/v)，流速为0.8mL/min，柱温为35 °C，在紫外检测波长为203nm下检测。
[0021]实施例1L-氨基酸脱氨酶重组质粒构建
[0022]以Proteus vulgaris的基因组为模板，以
[0023]5 ’ CGCGGATCCATGGCGATATCTAGAAGAAAATTTA3 ’为正向引物，以
[0024]5，CCGCTCGAGTTAGAATCTGTAAAGACTAAATGGTTT3，为反向引物，(划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点)扩增获得目的基因，所得目的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。PCR产物经过纯化、酶切后，与载体pET28a(+)连接，构建重组质粒pET28a_lad (如图1)。
[0025]实施例2重组大肠杆菌构建
[0026]将实施例1重组质粒Pet28a_lad转化克隆宿主E.coli JM109,挑取在LB氨苄抗性平板上生长的单菌落，PCR扩增，挑选到阳性转化子提取质粒，双酶切验证，条带正确并进行测序，序列正确的转化表达宿主E.coli BL21 (DE3)。
[0027]实施例3全细胞转化L-亮氨酸的条件优化
[0028]将重组大肠杆菌E.coli BL2KDE3)从平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，过夜培养，以2% (v/v)的接种量接种到50mL发酵培养基中，37°C、200r/min培养到OD6tltl为
0.4~1.5之间，加入0.4mM IPTG诱导，37°C培养5h后离心收集菌体进行全细胞转化。以水为反应介质，转化条件:
[0029]细胞浓度为1.0g/L时，分别在不同浓度L-亮氨酸(25mM、50mM、75mM、100mM、125mMU50mM)条件下，37°C转化12h，考察底物浓度对产量的影响，最优L-亮氨酸浓度为IOOmM时，产量最大达到11.84g/L，转化率达到90.95%。
[0030]当L-亮氨酸浓度为100禮时，加入不同浓度的菌体(0.48/1、0.88/1、1.28/1、
1.6g/L、2.0g/L、2.4g/L细胞干重)，37°C，培养12h，研究细胞浓度对转化的影响，最优细胞浓度为0.8g/L，产量达到12.48g/L，转化率为95.61%。
[0031 ] 在最优底物浓度和最优细胞浓度条件下，考察不同温度(25°C、30°C、35 V、40°C、45°C)对转化的影响，最优转化温度为35°C，产量为12.33g/L，转化率为94.71%。在上述基础上，研究转化时间(0.5h、lh、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h)对转化率的影响，发现转化时间为16h时，产量最大达到12.69g/L，转化率达到97.49%。随后，产量不再增加，所以从经济的角度考虑，转化16h为最佳。
[0032]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一株基因工程菌，其特征在于，是表达了来源于奇异变形杆菌(Proteus vulgaris)的脱氨酶的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以E.coliBL21 (DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
4.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，是以奇异变形杆菌的基因组为模板，PCR扩增获得氨基酸脱氨酶基因，连接到表达载体pET-28a (+)中，将重组质粒转化入E.coli BL21 (DE3)，筛选得到阳性转化子。
5.一种应用权利要求1所述基因工程菌全细胞转化亮氨酸生产α-酮异己酸的方法，其特征在于，首先培养制备游离的活性细胞，再利用所得活性细胞进行全细胞催化生产α -酮异己酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是将种子培养液按2%的接种量接种到发酵培养基中，37°C培养至0D_为0.6，添加终浓度0.4mM的IPTG，37°C诱导5h，收集细胞；以 0.4-2.4g/L 细胞、25-150mM/L 底物 L-亮氨酸，在 25_45°C条件下，转化 0.5_24h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述底物L-亮氨酸浓度为100mM/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞浓度为0.8g/L。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转化是在37°C下转化16h。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，加占培养基体积9/10的水溶解后高压灭菌，冷却到60°C，再加占培养基体积1/10的灭菌的含17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
【文档编号】C12N15/70GK103789247SQ201410050399
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】陈坚, 刘龙, 堵国成, 李江华, 宋阳 申请人:江南大学